nmda受体nr2b亚型基因对海马成年新生神经元形态发生的影响

NMDA 受体 NR2B 亚型基因对海马成年新生神 经元形态发生的影响 摘要：目的研究 NMDA 受体 NR2B 亚型基因对海马成年新生颗粒细胞形态发生的影响。 方法通过 Creloxp 重组酶系统构建 NMDA 受体 NR2B 亚型基因单细胞敲除模型。运用 Neurolucida 软件系统对野生型、NR2B 基因敲除成年新生神经元进行形态重建，观察树突 长度、树突复杂度以及棘突的变化。结果 NR2B 基因敲除成年新生神经元外形与 WT 神经 元相似，树突长度接近，棘突减少。Sholl 分析显示在以胞体为中心，距胞体不同距离的树 突亚区域内，树突复杂性（树突交叉）减低，与此同时棘突分布密度减低（P0.05） 。结论 海马成年新生颗粒神经元 NR2B 基因敲除对新生细胞树突长度影响甚微，但降低了树突复 杂性，减少棘突形成，从而导致了功能性整合入海马特定神经信息网络的障碍。 关键词：成年神经发生；NMDA 受体；NR2B 亚型；形态发生 中图分类号：R392 文献标识码： A 文章编号：16721349（2012）12149503 成年神经发生（adultneurogenesis）在哺乳动物前脑持续存在，脑卒中、癫痫、创伤、 环境刺激、情绪等因素均会影响成年后神经发生。行为学证据表明1，2 ，海马成年神经 发生对于海马某些形式的学习、记忆以及情绪调节非常重要。成年新生神经元，具有长时 程增强（longtermpotention，LTP） 、动作电位诱发阈值降低、兴奋性增高等神经活性3 。 海马癫痫为神经兴奋性增加的最常见的形式之一，也可以诱发增加成年神经发生：在红藻 氨酸注射诱发的癫痫模型4和癫痫的点燃激发模型均能观察到神经发生增加 5。而在匹罗 卡品诱发癫痫模型中，通过阻滞成年神经发生可以减少自发性复发性癫痫的发生6。因此， 海马神经活性与成年神经发生之间存在着紧密的双向联系。 而 NMDA 受体依赖型的长时程增强是成年神经发生中神经活性、突触可塑性的重 要证据，被认为是海马空间记忆的神经生物机制7，8 。 Ge 等3研究发现，LTP 是依赖于 NMDA 受体 NR2B 亚型基因的。因此，研究 NMDA 受体 NR2B 亚型基因对海马成年新生 神经元发育成熟过程的影响，对于进一步探讨新生神经元的功能、神经活性、海马依赖的 学习和记忆分子机制，以及未来可能的治疗策略，均具有非常重要意义。 本研究建立海马成年新生神经元 NR2B 基因敲除模型，观察 NR2B 基因敲除对成年 新生神经元细胞形态、树突、棘突发育等的影响，进一步阐明 NR2B 基因在海马成年发生 中的重要作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组经基因型鉴定后的清洁级成年健康 NR2Bfl/fl 转基因小鼠9 （NR2B 基因被 loxp 序列标记） ，C57BL/6 野生型小鼠（wildtype，WT） ，同济医学院实验 动物中心提供，体重 20g30g。NR2Bfl/fl 转基因小鼠为实验组， C57BL/6 小鼠为 WT 对 照组。 1.2 实验方法 1.2.1 海马成年新生神经元 NR2B 基因敲除模型制作运用逆转录病毒基因标记技术， 利用 Creloxp 重组酶体系，建立海马成年新生神经元单细胞 NR2B 基因敲除模型。本实验 采用的是逆转录病毒载体 MoloneyRSVpGFP：T2aCre（Dr.WolfgangKelsch 馈赠）：带有一 个来源于 Roussarcomavirus 内源性启动子 RSV；pGFP 与 Cre 基因由 T2a 序列连接，T2a 序 列保证了 GFP 基因与 Cre 基因的同时高效率表达10。 当逆转录病毒注射入成年神经发生部位时（海马齿状回颗粒下层） ，感染带有 loxp 打靶基因 NR2B 的神经祖细胞/母细胞，当 Cre 酶激活时，Creloxp 重组酶系统工作从而产 生海马新生单细胞 NR2B 基因敲除模型。当 Cre 在 NR2Bfl/fl 转基因小鼠海马齿状回表达 后，GFP+阳性神经元为 NR2B 基因敲除海马新生神经元（NR2B 神经元） 。野生型小鼠作 为对照。 1.2.2 小鼠海马齿状回立体定位注射 Isofluran（Baxter）吸入麻醉（0.5mL/100g） ，固 定小鼠于立体定位仪上（Kopf921，德国） 。麻醉以及手术期间用加热毯持续加热，保持体 温 3737.5。根据海马齿状回立体坐标定位（前囟向后 2mm，旁开 1.3mm，深 1.8mm） ，用牙科钻钻孔，在双侧海马各注射 1mL 病毒（ RSVpalmGFP：T2aCre） 。 1.2.3 组织漂片制作和免疫组织化学染色在逆转录病毒注射后 17d 予以经心脏 4%多 聚甲醛灌注取脑。组织漂片（150m）于 3%H2O2 室温处理 20min25min。2%TritonX100 室温破膜 1h。5%BAS+0.2%TritonX100 室温封闭 1h。1 抗工作液 4 度孵育 24h（兔抗 EGFP1 1000， Invitrogen） 。生物素标记的抗兔二抗（1500，VectorLaboratories） ，室温 孵育 4h。辣根酶标记的工作液 A+B（VectorLaboratoriesBurlingame，CA，USA）：各 1500+1%TritonX100 用 1PBS 稀释，孵育 2h3h。滴加 DAB 工作液 200L（5mg/mLDAB）+800LPBS+0.67L30%H2O2，显色满意后以 PBS 终止反应。各主 要步骤间均以 1PBS 漂洗 3 次4 次。 1.2.4 海马成年新生神经元形态重建采用 OlympusBX51 显微镜系统和 Neurolucida（MBFBioscience）软件分析系统对 DAB 标记的 GFP 阳性细胞进行胞体、树突、 棘突重建。Sholl 分析11 用来累计计算以胞体为中心，每间隔 30m 直径范围内棘突 （protrusions）密度和树突交叉（dendriticintersections）的数目，后者反映了树突复杂度 （dendriticcomplexity） 。 3 讨论 NMDA 受体是兴奋性谷氨酸离子通道，介导中枢神经系统的信号传导。它由 2 个功 能亚单位 NR1 和两个调节亚单位 NR2（NR2AD）组成。在胚胎期内，NR2B 表达非常广 泛；但在成年后 NR2B 表达局限于包括海马、皮层的前脑结构。NR2B 全脑敲除模型或 C 末端截断模型均导致动物在出生立即死亡13，14 。NR2B 基因在胚胎期重点表达、决定胚 胎期动物存活的特点，以及特异性的发育分布模式，引起了广泛的关注。本课题组前期研 究工作中发现，NMDA 受体 NR2B 亚型基因在起源于侧脑室旁室管膜下区 （subventricularzone）的嗅球成年新生神经元的生存，整合以及兴奋性神经网络的功能维 持中起着至关重要的作用。因此，发源于海马齿状回颗粒下层的成年新生神经元是否遵循 同样的生存规律值得深入探讨。 结果显示，海马成年新生神经元的树突生长并不依赖于 NMDA 受体 NR2B 亚型基 因。表现为在新生神经元快速分化整合到原有神经网络的阶段，NR2B 和 WT 神经元均生 成了形态类似、长度相近的树突。而近期研究结果亦有类似发现，NR2B 基因对海马成年 新生神经元和大脑 Barrel 皮层卫星细胞形态发育的影响不大，NR2B 神经元形成了与 WT 神经元相似长度的树突15。与此同时，另外两篇研究报道显示， NMDA 受体的另一功能 亚型 NR1 对大脑皮层锥体神经元的树突发生影响不大16，17 。因此，NMDA 受体，包括 NR2B 亚型在内，对神经元的树突长度影响甚微15。 然而，成年新生神经元 NMDA 受体 NR2B 亚型基因敲除显著减少棘突发生，表现 在总棘突数目的下降；Sholl 分析进一步显示，在树突的某些亚区域，NR2B 依赖型的棘突 发生减少尤为明显。由于棘突的形成在空间上受树突分枝的限制，早期的树突发展的模式 变化可以限制后期棘突的分布12；因此，当局部区域树突复杂性减低之后，会在相应的 区域影响棘突的发育。在我们的观察中的确观察到类似的 NR2B 依赖的功能亚区。 Ultanir 等16 同样在 NR1 基因敲除的皮层锥体细胞中观察到棘突密度下降。这些类 似的改变可能来自于 NR1 和 NR2B 亚单位共同作用于同样的突触后结构，并影响下游可能 的级联信号反应。离体组织培养研究发现1820，树突上的棘突发生可以被谷氨酸或者 LTP 诱发的刺激以一种 NMDA 受体依赖的方式激发。研究进一步指出，棘突的发生先于 突触的形成，新发生的棘突更倾向于与原有的突触相关联，从而形成多突触结构21。如 果该假设成立，那么 NMDA 受体信号通道可能在维持突触的稳定性中的作用更为关键。 Alvarez 等22在体外细胞培养的研究中，通过 SiRNA 介导的 NR1 基因敲除，同样引起了 棘突密度减低以及棘突失稳。近期在对海马 CA3 区锥体细胞研究发现，NR2B 缺失会影响 Actin 细胞骨架蛋白的稳定性和动力学特性，而 Actin 是树突棘突上最主要的细胞骨架成分， 因此，该研究认为 NR2B 与突触后巨分子复合物的互动是影响棘突稳定性的一个重要因素 23。 Espinosa 等15同时观察到树突发生模式的变化，例如海马新生 NR2B 缺陷神经元 形成多分支树突；大脑皮层第 4 层 Barrel 皮层的星形兴奋性神经元将其突触延伸至毗邻的 Barrel，与此同时，WT 神经元树突延伸仅局限于一个 Barrel。胚胎期 NR2B 和 NR1 基因敲 除13，24 ，以及皮层特异性 NR1 基因敲除能引起皮层 Barrel 的缺失16。这些模式的改 变可能来源于 NMDA 受体失活之后所相关联的下游的级联反应的阻滞 24。本研究中没有 观察到类似的树突发生模式的改变，尚需更进一步完善的研究。 参考文献： 1 DengW，SaxeMD，GallinaIS，etal.Adultbornhippocampaldentategranulecellsundergoingmatura tionmodulatelearningandmemoryinthebrainJ.JNeurosci，2009，29（43）：1353213542. 2 SaxeMD，BattagliaF，WangJW，etal.Ablationofhippocampalneurogenesisimpairscontextualfea rconditioningandsynapticplasticityinthedentategyrusJ. 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