2012级 多巴胺代谢通路成分的衍生化hplc荧光检测方法的研究

本科生毕业论文（设计） 题 目 多巴胺代谢通路成分的衍生化 HPLC 荧光检 测方法的研究 姓 名 贾士城 学号 2010412808 院 系 化学与化工学院 专 业 化学工程与工艺 指导教师 赵先恩 职称 副教授 2014 年 5 月 15 日 曲阜师范大学教务处制 目 录 摘要1 关键词1 Abstract1 Key words1 引言2 1.实验部分4 1.1 仪器与试剂 4 1.2 标准溶液的配制 4 1.3 衍生过程 4 1.4 色谱条件 4 2.结果与讨论5 2.1 衍生产物激发波长和发射波长的选择 5 2.2 衍生条件的优化 5 2.3 灵敏度的讨论 . 5 2.3.1 RB-SE 的直接荧光检测5 2.3.2 RB-SE 标记检测分子产物荧光检测（HPLC-FLD）.6 2.3.3 实际样品中被检测物质的分离与分析6 2.4 精密度讨论.7 2.5 结论7 致谢7 参考文献7 表 1 色谱柱梯度洗脱条件 .4 表 2 衍生产物标准曲线分析.7 图 1 衍生反应方程式 .4 图 2 衍生产物荧光检测 .6 图 3 实际样品荧光检测 .6 0 多巴胺代谢通路成分的衍生化 HPLC 荧光检测分析方法的研究 化学工程与工艺专业学生 贾士城 指导教师 赵先恩 摘要：本实验是利用琥珀亚酰胺与 DCC 作用生成罗丹明酯 RB-SE，RB-SE 在 pH=8.00 的硼酸-硼砂 缓冲溶液中、50条件下与被检测分子反应 5 min 可获得稳定的衍生物。比较直接荧光检测与 RB-SE 对单胺类和神经递质类分子标记衍生法，发现后者检测灵敏度提高。检测范围拓宽，其检 出限在 0.265-0.374nmol 之间。然后对其精密度进行考察，测试条件为：在激发波长 566nm、发 射波长 594nm 处对衍生产物进行液相色谱荧光检测。目标检测分子的衍生产物在 210- 7mol/L1.710-5mol/L 范围内，呈现良好的线性关系。此方法方便快捷、选择性好、灵敏度高、 准确性强。 关键词：高效液相色谱法 荧光检测器 罗丹明酯(RB-SE) 衍生化 High Performance Liquid Chromatography fluorescence detection of dopamine metabolic pathway components Chemical Engineering and Technology miaomiao Zheng Tutor Xian-en ZHAO Abstract: A novel labeling reagent generated in the DCC condensation of Luo Danming easter RB-SE was used for the analysis of dopamine synthesis path component and a highly sensitive method for the determination of molecular detection of targets using RB-SE as enhancing reagent detection has been developed. Molecular detection of targets could be labeled with in 5 min at 50 in the presence of pH=8.00 buffer to give the corresponding sensitive FLD current signal. Compared with direct fluorescence detection, the detection sensitivity had been significantly enhanced, the limit of detection was range from 0.268 nmol to 0.373 nmol, At the excitation wavelength of 566 nm and 594nm emission wavelength of derivative products to establish HPLC fluorescence detection method，the calibration curve of derivatives of molecular detection of targets was linear in the range of 210-7mol/L1.710- 5mol/L, The method is rapid, sensitive, selectivity and accuracy. Key words: High performance liquid chromatography; Fluorescence detection;Luo Danming easter 1 引言 生活处处离不开含有氨基的物质，同样的人的一些生理结构都含有氨基，人体内 的蛋白质、氨基酸等都含有氨基。它是人的生命活动中必不可缺少的物质，对于多巴 胺它也是生命体中必要的物质，它能够协助细胞传递脉冲，是人体中的一种神经递质。 作为一种神经递质它主要是用来传递各种信息，比如：人的兴奋、情欲、快乐的情绪 等。有些人之所以吸毒、吸烟，并且难以戒毒、戒烟。都是因为多巴胺起着重要的作 用，它使人产生兴奋，而吸毒、吸烟的人会刺激多巴胺的产生，让自己感到兴奋、快 乐，所以难以戒掉，对人的身体健康产生重大影响，造成不可磨灭的损坏。同时基于 多巴胺的兴奋功能他经常用来治疗抑郁症患者，并且有一定的效果。凡是有其利必有 其弊，多巴胺在人体内产生的多少对人体有着显著的影响，分泌过多，人就会持续的 兴奋，造成人的多动，不由自主的颤抖，热情积极的干事情，但是他会消耗很大的能 量，而人却意识不到能量的消耗，造成人体的不断消耗，损害人体的健康，世界上的 亨丁顿舞蹈症是由于多巴胺分泌过量造成的，它使患者不由自主的抽动，不停地颤动， 人体的能量慢慢消耗，等到了后期患者就会失去生活能力，直至死亡；多巴胺分泌过 少会使人意志消沉，注意力不集中，多生活失去信心，没有热情；最简答的例子就是 有时候我们感觉打不起精神，干什么事都无精打采，就是因为多巴胺分泌不足造成的。 所以说对于人体多巴胺的分泌是受到严格控制的，分泌过多或是过少都是一种病 1。 蛋白质作为一种人体必不可少的营养物，他不会直接被人体所吸收，它需要经过 酶的分解才会被人体吸收利用，蛋白质经过分解会生成小分子的氨基酸，氨基酸会被 吸收，当人体摄入蛋白质以后，会经过肠胃里多种分解酶的分解为氨基酸和小分子的 多肽，经过吸收进入人体起作用。生物样品从氨基酸、生物胺，到蛋白质都含有丰富 的氨基。蛋白质作为机体内第一营养要素，它的营养价值显而易见，但它在人体内并 不能直接被利用，而是通过变成氨基酸这些小分子后才可以。人体不能直接吸收胃肠 道内的蛋白质，必须经过胃肠道中多种消化酶消化成小分子氨基酸或者多肽，然后在 小肠内被吸收，沿着肝门静脉进入肝脏。一部分蛋白质是由氨基酸在肝脏内分解或合 成的；另一部分是各种特异性的组织蛋白质是由氨基酸在各个组织器官内合成的。正 常情况下，氨基酸进入血液中与其输出速率基本相同，所以正常人血液中氨基酸含量 相当恒定。氨基酸是人类生命活动正常进行过程中必不可少的成分，是生命学科重点 研究的对象之一。氨基酸的种类很多，在本实验中主要检测分子酪氨酸分子。酪氨酸 有促进肾上腺、脑垂体和甲状腺正常发挥作用的功能，除此之外，酪氨酸还可以刺激 生长激素的释放并且产生可抑制人及动物食欲的去甲肾上腺素，可以缓解疲劳、抑郁 及敏感的情绪，有助于控制抗药性精神抑郁及焦躁症。 由于氨基酸类和神经递质类物质有着非常重要的作用，所以要建立一种快速准确 测定这一类型物质的方法就有着重要的意义，尤其对多巴胺的合成和应用有着重要的 意义。但是有些变现生理活性的化合物在生物体内的含量极低，而且它们的结构中缺 少可以检测到的发色团，一般的检测方法灵敏度比较低，例如直接使用荧光紫外法检 测，因此就需要利用衍生试剂来进行衍生化标记后再进行检测，这类方法主要有高效 液相色谱法，电化学法，毛细管电泳法等。 毛细管电泳是利用毛细管作为分离通道、以电场作为驱动力的分离技术，具有分 离速度快、柱效高等特点。而利用含有色谱固定相的毛细管分离柱的毛细管电泳色谱 分析法，兼备了高效液相色谱和毛细管电泳的双重分离机制，还可以用来分离中性物 2 质 2。林嵘 【3】 等利用毛细管区带电泳对反相 C18 制备分离生物活性酪蛋白磷酸肽的 结果进行了分离和分析，以检测高效液相色谱制备分离的结果并对高效液相色谱的使 用条件进行了进一步的调整。 高效液相色谱（HPLC）与气相色谱不同，而且它具有很强大的分离与分析能力， 现已被广泛应用于许多研究和应用领域,如临床医学、药物学、神经生物学、化学、 生物化学、环保鉴定与检测、空气质量控制以及食品卫生与安全等。该法也是分析化 学中发展速度最快、应用前景最好，应用范围最广的领域之一。然而由于样品中一般 含量都比较低以及被检测组分自身的性质等这些因素的限制。化合物直接用于高效液 相色谱分析不太现实。荧光检测具有较高的灵敏度,利用荧光探针技术使一些自身不 具有荧光性的化合物（如神经递质类、氨基酸类等）衍生化成具有荧光的产物,能够 实现高效高灵敏液相色谱荧光检测。本文着重研究了一种新型的荧光标记试剂法对于 目标检测分子进行标记，从而提高其分离检测的灵敏度的问题,考察了荧光标记试剂 的色谱性质,优化了衍生反应的条件（PH 值，反应时间，反应温度，衍生试剂的用量 等）、色谱分离分析条件,并将建立的方法应用于实际生物样品(血浆）的分析。高效 液相色谱联用的理想检测器大部分都有许多限制，为了扩大高效液相色谱的应用范围， 提高检测灵敏度以及改善分离分析效果，衍生标记法是现在广泛采用的措施。利用衍 生试剂标记反应来改变化合物的一些性质，这样就能更适合于特定的检测器。如，质 谱、核磁、紫外-可见、电泳、荧光检测和电化学分析等都曾采用过化学衍生反应的 手段。气相色谱中运用衍生化反应主要是为增加样本的挥发度，与此同时液相色谱的 化学衍生法是指在特定条件下利用具有特定发光或其他性质的某种试剂 (化学衍生试 剂，标记试剂)与检测样品组分在色谱分离之前或者色谱分离之后进行衍生反应，生 成产物有某种适合高效液相色谱的检测和分离的性质。 目前国内外也已有对氨基酸类和神经递质类物质检测方法的报道。王贤纯 【5】 采 用高效液相色谱与质谱串联对化学合成的多肽产物进行分析与检测。在国外 Esquivel【6】 等采用高效液相色谱法在 CrownpakCR(+)柱上对几种二肽和三肽对映异 构体进行了成功的分离与检测。吕艳 4等人采用异硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液 相色谱外标法定量检测了多肽中的多种氨基酸的组成。Berad 等 【11】 用芯片毛细管电 泳、激光诱导荧光分离检测组胺等多种生物胺，检测限最低为 1.00nmol/L。叶惟玲 【7】 用高效液相色谱-电化学检测法快速灵敏高效地分析了生物样本中单胺类神经递质 及其代谢产物。陈德志、陈巧辉 8等在抗坏血酸和尿酸同时存在的情况下采用循环伏 安法研究 DA 在导电聚合膜修饰玻碳电极上的化学行为，依示差脉冲伏安法建立 DA 含 量的测定方法。Aoyama 等 【12 】 采用 NBD-F 衍生试剂室温衍生 40min，梯度淋洗 HPLC 分离荧光检测，100min 内分离了 24 种氨基酸，检出限在 2.8-2.0fmol 之间。 本实验采用 RS-SE 对神经递质类和单胺类分子进行柱前衍生化处理。需要检测分 析的分子有酪氨酸分子、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素和去甲肾上腺素。首先 RB-SE 衍生试剂 【9】 是一种新型的荧光标记试剂，其具有较高的高荧光量子产率和摩尔吸收 系数，激发波长正处于红光范围，所以它既能满足使用绿激光器的激光诱导荧光系统 发展需要，同时在液相色谱和毛细管电泳分离及荧光检测时背景干扰较小。有良好发 光、发色性能，与目标检测分子结合后其特性不会减弱。其次，该衍生反应是迅速定 量进行的，容易操作，反应的重复性好，反应条件温和。再次，衍生化产物仅有一种， 过量的衍生化试剂在反应的过程发生水解，不干扰目标化合物的分离和检测。最后， 衍生产物在乙腈中有足够溶解度而且衍生产物有较强的稳定性。因此，用新型的 RB- SE 标记检测分子能达到这些目标检测分子的同时分离进行定性或定量分析，因此这种 3 方法有较广阔的研究前景和研究价值。 1. 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent 1260 型高效液相色谱-质谱联用仪(美国，Agilent 公司) 配备四元梯 度泵，在线真空脱气机，荧光检测器，100 位自动进样器。 罗丹明酯(RB-SE，98%，自主合成)；目标检测分子标准品（分析纯包括：多巴 胺，左旋多吧，肾上腺素，去甲肾上腺素，酪氨酸，中国，天津市光复精细化工研究 所） ；乙腈(色谱纯，中国，天津市大茂化学试剂厂)；其他试剂均为分析纯，水由 Milli-Q 超纯水系统制备。 1.2 标准溶液的配制 准确称取目标检测分子酪氨酸 2.5 mg，左旋多巴 3.0 mg，多巴胺盐酸盐 2.3 mg，肾上腺素 2.0 mg，L- 去甲肾上腺素 2.5 mg。用乙腈和水按 1:1 定容至 40 mL，配 成浓度分别为 3.3710-4 mol/L,3.7310-4 mol/L,3.010-4 mol/L,2.6810-4 mol/L,3.6310-4 mol/L 的储备液。低浓度的标准液均由乙腈稀释而成。 称取 2.8 mg 的 RB-SE 用光谱乙腈超声溶解后定容至 2.8 mL，浓度为 1 mg/ml,1.7610-3 mol/L。 1.3 衍生过程 向安培瓶中依次加入 1000 L pH=10.0 的硼酸-硼砂缓冲液，200L 五种标准液 的混合液，1500L 衍生化试剂，封口后于 35 恒温水浴反应 5 min，取出放冷后加 30 L 乙酸 /水混合液(1:1, v /v )中和后直接进样分析。衍生反应式如下图为罗丹 明酯与氨基类物质反应的通式。 图 1 衍生反应方程式 1.4 色谱条件 依利特 SinoChrom ODS-BP 色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m） 。流动相 A 为含 20% 乙腈和 0.1%甲酸的水溶液，流动相 D 为含 0.1%甲酸的乙腈；线性梯度洗脱条件：见 表 1，流速为 1.0 mL/min。进样量 10L，柱温 30 。梯度延长 3 分钟。 表 1 色谱柱梯度洗脱条件 流动相 A 流动相 D 4 0 70% 30% 10 70% 30% 18 0 100% 2. 结果与讨论 2.1 衍生产物激发波长和发射波长的选择 利用了 Agilent 1260 型高效液相色谱-荧光检测器的在线扫描激发波长和发射波 长的功能，发现在激发波长 566nm，发射波长 594nm 信号强度最大，因此选择 566nm 为激发波长，594nm 为发射波长。 2.2 衍生条件的优化 罗丹明 B 对目标检测分子的衍生化反应随着缓冲溶液 pH 值、反应温度、以及衍 生试剂用量的不同，衍生化产率有显著的差别。 对上述几个因素的优化结果表明：当 pH 为 8.00 时衍生化产率最大；随 pH 值的 增大衍生产率逐渐上升，当 pH 大于 8.00 产率因产物的水解产率下降。在 35下具有 最高的衍生产率。衍生产率随衍生化试剂过量程度的增加而升高，当衍生化试剂物质 的量达到目标检测物质的量的 6 倍时信号较强。 2.3 灵敏度讨论 2.3.1 RB-SE 的直接荧光检测 灵敏度和选择性是衡量分析方法优劣的两个重要因素。高效液相色谱荧光检测灵 敏度比紫外可见检测一般要高 3 个数量级，达 10-9mol/L 左右 10。激发诱导荧光检测 限可达 10-16mol/L10。 对 RB-SE 母液稀释 10 倍（其浓度为 1.7610-3mol/L）进行测量，逐渐稀释衍生 试剂浓度，进行荧光检测，根据 S/N（信噪比）=3 求得 RB-SE 的直接荧光检测的检出 限为 1.7610-9mol/L。测得 RB-SE 的最大发射波长为 594nm，最大激发波长为 566nm。 在此波长下对被检测分子标准溶液稀释 5 倍进行测量，其荧光检测。逐渐稀 释标准溶液，根据 S/N（信噪比）=3 求得检测分子的直接荧光检测的检出限为 1.0910-7mol/L 左右。 2.3.2 RB-SE 标记检测分子产物荧光检测（HPLC-FLD） RB-SE 标记目标检测分子衍生产物的激发波长为 566nm，发射波长为 594nm。将配 制的五种标准溶液等量混合，在相同的实验条件下进行荧光检测，可以实现被测物质 的定性定量分析与分离，如图所示。五种检测分子得到较好的分离，根据 S/N（信噪 比）=3，可以计算检出限在 0.268nmol-0.373nmol 左右。 5 图 2 衍生产物荧光检测光谱 2.3.3 实际样品中被检测物质的分离与分析 向血浆中加入上述被检测物质，在同一实验条件下进行 HPLC 荧光检测，可以 看到五种物质都能得到较好的分离。根据定性得到的保留值标记出被检测分子。 图 3 实际样品 HPLC-FLD 检测图 2.3.4 RB-SE 衍生产物的标准曲线 在同一衍生条件下对五种检测物质用 RB-SE 进行标记反应，将五种标准溶液等量 混合，依次稀释 5 倍、10 倍、100 倍进行荧光检测。按照实验方法测定衍生物，在 RB-SE 标记检测分子的衍生物的摩尔浓度在 210-4mol/L2.010-5mol/L 范围内，呈 现良好的线性关系。如图所示。 6 表 2 衍生产物的标准曲线表 目标检测分子 线性方程 R2 LOD (nmol/L) LOQ(nmol/L) RSD(%) 去甲肾上腺素 y=0.1745x-0.0028 0.9997 0.363 1.09 1.41 肾上腺素 y=0.0389x-0.0006 0.9998 0.268 8.04 1.38 左旋多巴 y=0.5687x-0.0218 0.9998 0.373 1.12 1.43 酪氨酸 y=0.3535x-0.0169 0.9995 0.337 1.01 1.23 多巴胺 y=0.9281x-0.3374 0.9859 0.300 9.00 1.31 2.4 精密度讨论 分别连续进样三针（10L）浓度为 41pmol 的样品，积分求算色谱峰面积后，求 得峰面积相对标准偏差 RSD 如上表 2。根据相对标准偏差可以认为实验精密度良好。 2.5 结论 本实验采用的课题组自主合成的罗丹明酯标记衍生氨基酸类和神经递质类分子， 其衍生产物经过高效液相色谱荧光检测可以得到很好的分离分析色谱图。运用这种检 测方法与直接荧光检测方法对比检出限低 3 个数量级，快速高效、具有较高的灵敏度 和良好的重现性，因此这种方法具有广阔的研究前景和研究价值。 致谢 本本科毕业论文是在我的指导老师赵先恩副教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。 老师不辞辛苦的指导我的论文开题，耐心细致的教导我仪器的使用，他对待科研的热 情和严谨的态度深深的影响和感染着我。在实验中遇到问题时，赵老师鼓励我们自己 多动脑动手，在做毕业设计这段时间，我受益匪浅。感谢赵老师，向您致敬。 感谢学院老师们对我的教育培养。老师们在四年中耐心指导我的学习和生活，在 此，我要向诸位老师深深地致敬。同时也感谢学院为我提供良好的毕业设计环境，还 要感谢在论文中被我引用或参考的论著的作者。 感谢我的舍友、学友和朋友们四年以来对我学习、生活的关心和帮助。特别感谢 我的师哥吕涛同学，感谢他在自己忙碌的学习研究中，耐心教我实验仪器的规范使用、 不厌其烦的为我解