大竹蛏源多肽与钙螯合物的制备工艺及生物活性研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 大竹蛏源多肽与钙螯合物的制备工 艺及生物活性研究 摘要：以大竹蛏肉蛋白和氯化钙 为原料，复合酶解法制备大竹蛏源多肽 螯合钙，考察螯合温度、时间、大竹蛏 源多肽与钙离子的质量比和 pH 对螯合 率和螯合物中钙含量的影响。根据响应 面分析试验结果，在温度 50 ，时间 40 min，质量比 12，pH7.0 条件下， 螯合率为 32.73%，螯合物中钙含量为 41.89%。傅里叶变换红外光谱扫描检测 结果表明，竹蛏源多肽与钙离子形成了 螯合物，以硫代巴比妥酸法和抑菌圈试 验分别验证此螯合物具有抗氧化活性和 抑菌活性。 中国论文网 /8/view-12932632.htm -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 关键词：大竹蛏；多肽钙螯合物； 制备工艺；抗氧化活性；抑菌活性 中图分类号：S986.2 文献标识 码：A 文章编号：0439-8114（2017） 08-1530-04 DOI：10.14088/ki.issn0439- 8114.2017.08.031 The Bioactivity and Preparation Technology for Peptides-Ca2+ from Solen grandis Proteins WANG Meng-ya，CHEN Yuan- yuan，QIAN Wen-ju，HU Qin- ying，ZHOU Yu，WANG Meng- fan，HAN Yao-ping （ College of Biology and Food Science， Changshu Institute Technology， Changshu 215500， Jiangsu，China） Abstract： The combination between Solen grandis polypeptides and calcium chloride was studied based on the preparation of Solen grandis polypeptides -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 from compound enzyme. Under given conditions，calcium binding capacity and chelated calcium content were investigated as a function of reaction temperature， time，mass ratio between Solen grandis polypeptides and calcium chloride（P/C） and pH. On the basis of the results of response surface analysis，the four reaction parameters were optimized to be 50 ，40 min，a P/C ratio of 12 and pH 7.0，yielding a calcium binding capacity of 32.73% and a chelated calcium content of 41.89%. The formation of ca-polypeptide chelate was confirmed by the FT-IR spectra. The result indicates that the calcium chelate with Solen grsndis polypeptides. TBA test and the experiments of anti-bacterium-circles show that the chelate products are characteristic of oxidation resistance and antibacterial activity. -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 Key words：Solen grandis；peptides-Ca2+；preparation technology； antioxidant activity；antibacterial activity 钙离子是机体内各项生命活动都 不可缺少的一种物质。它对于维持生物 细胞膜两侧的生物电位，维持正常的神 经传导功能，维持正常的肌肉伸缩及舒 张功能以及神经肌肉传导功能具有非常 重要的作用，而且一些激素的作用机制 也均需钙离子表现出来，如作为凝血因 子参与凝血过程；参与肌肉包括骨骼肌 和平滑肌的收缩过程；参c 神经递质 的合成与释放，激素的合成与分泌过程； 骨骼的形成等1-3。由于中国的膳食结 构以植食性为主，难以摄入足够的易被 人体吸收的钙，而含钙量较多的奶和奶 制品的摄入量较少，致使中国人普遍缺 钙，是全球居民缺钙的首要国家4。而 钙离子与多肽螯合形成有机肽后，能够 借助多肽在体内的吸收机制提高其吸收 率5。金属钙离子与蛏子多肽形成的螯 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 合物具有口感好、易吸收等特点，并且 其他方面的生物活性如抗氧化性和抗菌 活性也得到了增强，同时提高了钙离子 和蛏子的营养价值。蛏子肉口味鲜美， 营养丰富，俗称“ 海里的人参 ”， “小人仙”， 一直是餐桌上的常客，而且蛏子养殖具 有生长快、生长周期短、易管理、产量 高、成本低、效益好、见效快等特点， 总之价格便宜，是一种大众化的海产食 品，可以作为很好的多肽来源6。 本研究以江苏常熟常见的大竹蛏 为原料，采用酶法7水解制备得到蛏子 肉蛋白水解物，将此水解物与钙离子螯 合在不同的条件下进行螯合并研究其螯 合物的抑菌活性和抗氧化活性，以期获 得最佳的螯合工艺和具有高抑菌活性和 高抗氧化活性的金属离子多肽螯合物， 为具有抑菌活性和抗氧化活性的金属离 子多肽螯合物的研究与开发以及为补钙 的保健品研究与开发提供重要参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料与仪器 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 竹蛏，江苏常熟农贸市场；大肠 杆菌、枯草芽孢杆菌，常熟理工学院生 物与食品工程学院微生物实验室；木瓜 蛋白酶、风味蛋白酶，上海奥宇生物科 技有限公司；亚油酸标品、-生育酚标 品、2- 硫代巴比妥酸标品，Sigma 公司； 诺氟沙星药品，上海浩然生物技术有限 公司。AKTA 蛋白纯化系统：醋酸，无 水乙醇，氯化钙，乙二胺四乙酸二钠， 铬黑 T，氨水- 氯化铵缓冲液。 LB 固体 培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，琼脂 1520 g，蒸馏水 1 000 mL。 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，蛋白胨 10 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.47.6。 台式高 速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限 公司；雷磁牌台式 pH 计（pHSJ-4A） ， 上海仪电科学仪器股份有限公司；恒温 培养摇床，上海申贤恒温设备厂；傅里 叶变换红外光谱仪（NICOLET380 型） ， 美国 Thermo 公司；超净工作台，苏州 佳宝净化工程设备有限公司；紫外分光 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 光度计；冷冻干燥机；绞肉机；恒温加 热磁力搅拌器。 1.2 试验设计 1.2.1 蛏子多肽的制备 将蛏子去 壳、去杂物，洗净蛏子的肉蛋白，绞肉 机搅碎，加 0.5 倍的水，调 pH 至 6.0 左 右，以质量比 1001 分别加入木瓜蛋 白酶和风味蛋白酶，在 50 下，放入 恒温加热磁力搅拌器中酶解 5 h，酶解 后，放入离心管中 5 000 r/min 离心 10 min，去沉淀取上清，漏斗过滤，将滤 液倒入适量大小的培养皿中（厚度 1 cm 左右） ，保鲜膜封住，放入冰箱冷冻成 块，膜上戳小孔，放入真空冷冻干燥机 中冷冻干燥 24 h，得到冻干粉。 1.2.2 蛏子多肽与钙螯合物的制 备 按一定的质量比称取蛏子多肽冻干 粉和氯化钙，加入适量的蒸馏水，调节 pH、温度，在恒温振荡培养箱中进行一 定时间的螯合反应，螯合结束后，向螯 合溶液中加入无水乙醇进行离心，去上 清取沉淀，将沉淀放入真空冷冻干燥机 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 中干燥 12 h，得到冻干粉。 1.2.3 单因素试验 螯合温度对 螯合率和螯合物中钙含量的影响。称取 5 份 200 mg 的蛏子多肽粉末，分别加入 277.5 mg 的氯化钙，用 20 mL 的蒸馏水 溶解，调节 pH 至 6.5，分别在 30、40、50、60、70 下放入恒温振荡 培养箱中进行螯合反应 40 min。螯合 时间对螯合率和螯合物中钙含量的影响。 称取 4 份 200 mg 的蛏子多肽粉末，分 别加入 277.5 mg 的氯化钙，用 20 mL 的蒸馏水溶解，调节 pH 至 6.5，放入 50 恒温振荡培养箱中分别进行螯合反 应 30、40、50、60 min。 螯合 pH 对 螯合率和螯合物中钙含量的影响。称取 9 份 200 mg 的蛏子多肽粉末，分别加入 277.5 mg 的氯化 ，用 20 mL 的蒸馏 水溶解，分别调节 pH 为 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 、9.0，放入 50 恒温振荡培养箱中进 行螯合反应 40 min。多肽与钙离子的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 质量比对螯合率和螯合物中钙含量的影 响。称取 7 份 200 mg 的蛏子多肽粉末， 分别加入 50、40、66、67、100、200、400、800 mg 的氯化钙，即分别以质量比 41、51、31、21、11、12 、14，用 20 mL 蒸馏水溶解，调节 pH 至 6.5，温度 50 ，放入恒温振荡 培养箱中进行螯合反应 40 min。 1.2.4 螯合物中钙含量和螯合率 的测定 按照“1.2.2”中的螯合反应步骤， 螯合结束后，取 5 mL 螯合溶液加入 80%乙 醇溶液 45 mL 离心去沉淀取上清，取 10 mL 上清液放入锥形瓶中，氨水 -氯化 铵缓冲液调 pH 至 12 左右，加铬黑 T 溶液，用 EDTA 二钠溶液滴定，记录每 个锥形瓶所耗 EDTA 二钠溶液体积数， 取平均值，按照下列公式进行计算： 游离钙离子质量=CEDTA滴定 体积40螯合溶液稀释倍数； 螯合物中钙含量= -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 100% 螯合率=100% 1.2.5 响应面分析确定最佳螯合 工艺 利用 Box-Behnken 设计方法，4 因素 3 水平，共 29 组设计配方进行螯 合及滴定试验，之后进行响应面分析， 确定最佳螯合工艺（表 1） 。 1.2.6 检测竹蛏多肽螯合钙离子 后的变化 将蛏子多肽钙螯合物通过凝 胶柱，分离纯化后的螯合物冷冻干燥使 成冻干粉，然后进行傅里叶变换红外光 谱检测，与多肽进行比较氨基（3 400 cm-1）和羧基 （1 700 cm-1）的变化。 1.2.7 分离纯化多肽螯合物 利用 AKTA 蛋白纯化系统，将竹蛏多肽钙螯 合物进行分离纯化，之后收集目标峰值 对应的溶液即纯化后的螯合物溶液冷冻 干燥，得到冻干粉，备用。 1.2.8 抗氧化活性检测 采用硫代 巴比妥酸法8测定螯合物的抗氧化活性， -生育酚作为标准品比较螯合物的抗氧 化活性。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 1.2.9 抑菌活性检测 选用大肠杆 菌（革兰氏阴性）和枯草杆菌（革兰氏 阳性）两种菌做滤纸片9抑菌圈试验， 比较抑菌圈的有无和大小，检测螯合物 的抑菌活性。 2 结果与分析 2.1 单因素试验结果 1）螯合温度对螯合率和螯合物 中钙含量的影响。由图 1 可知，螯合温 度对螯合物中的钙含量影响不大，而螯 合温度 50 时有较好的螯合率，所以 选取 50 为最佳的螯合温度。 2）螯合时间对螯合率和螯合物 中钙含量的影响。由图 2 可知，螯合时 间对螯合物中钙含量的影响不大，在螯 合 40 min 后有较好的螯合率，所以选 取 40 min 为最佳的螯合时间。 3）螯合 pH 对螯合率和螯合物中 钙含量的影响。由图 3 可知，pH 在 3.07.5 时螯合物中钙含量变化很小， pH 在 7.59.0 时螯合物中钙含量一直 在升高；而 pH 在 3.07.5 时螯合率变 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 化较明显，尤其 pH 为 7 时螯合率最高， 而 pH 为 7.5 时螯合率略微下降，之后 便一直上升。当 pH 为 7.5 之后螯合物 中钙含量和螯合率一直都呈较大的上升 趋势，根据试验过程，推测原因是在螯 合前加入的氢氧化钠与钙离子结合，溶 液中的游离钙离子量减少，导致螯合率 和螯合物中钙含量同时迅速升高。所以 选择 pH 为 7。 4）多肽与钙离子的质量比对螯 合率和螯合物中钙含量的影响。由图 4 可知，质量比对螯合率的影响不大；在 质量比 11 之前，随着质量比的变大， 螯合物中钙含量的变化不大，在 11 处有一个较大的提高，在 11 之后， 螯合物中钙含量提升较快。作为最佳的 制备工艺，考虑到材料的利用率，在质 量比 0.5 和 0.25 时，虽然螯合物钙含量 相对较高，但根据试验情况，试验中氯 化钙的浪费情况较严重，利用率不高， 而且还需要对螯合产品中多余氯化钙进 行分离处理，所以选取 12 作为最佳 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 的质量比。 2.2 响应面分析法优 化试验结果 根据以上单因素试验结果确定对 多肽与钙螯合反应影响较明显的 4 个因 素的较好水平，由于螯合物中钙含量变 化随着反应条件的改变不如螯合率变化 明显，故以螯合率作为判定最佳反应条 件的响应值进行响应面优化试验10 （表 2） 。 利用 Design expert 9.0.6 软件对 表 1 数据进行分析，得到以螯合率为响 应值的线性拟合方程：螯合率=-644.898 75-15.254 44A+1.832 92B+2.344 5C+169.296 67D+0.033 333AB+0.053 333AC+1.02AD-0.008 75BC-0.06BD- 0.195CD-1.444 44A2-0.010 88B2 -0.000 721 25C2-11.4D2。式中， A 为质量比； B 为时间； C 为温度；D 为 pH。且通过 计算得蛏子多肽与钙螯合反应的最佳条 件是质量比 12，温度 49.98 ，时间 39.74 min，pH 6.98，预测螯合率 32.73%。 按照此条件，重复 3 次取平均值，实际 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 螯合率为 32.33%，说明预测值与实际 结果拟合性良好，响应面的优化方案可 以使用，较为可靠。表 3 为模型显著性 分析，由表 3 可知 A、D 及 AB 较显著。 2.3 多肽螯合钙离子后的变化结 果 由图 5 可知，螯合物和蛏子多肽 的特征峰位置相同，而每个特征峰对应 的基团含量相差较大。在 3 400 cm-1 附近多肽和螯合物都出现了强而宽的吸 收峰，应该是-COOH 中的-OH 与 N-H 的伸缩带重叠，是因为多肽中含有大量 的-COOH 和-NH2 ，螯合物中 -OH 带较 多肽向低波段移动了一些，一级螯合物 中-OH 吸收峰面积远小于多肽中的峰面 积，由于多肽在变成螯合物后，溶解度 大大降低，表明多肽中的-OH 参与螯合 环的构成，-NH2 也可能以提供孤电子 对的方式参与螯合环的形成；在 1 636 cm-1 附近的吸收峰来自-C=O 的伸缩振 动，螯合物中-C=O 隙嚯南虻筒 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 紊陨砸贫了一些，螯合物和多肽的吸 收峰面积比较后也减少了，说明-C=O 也参与了螯合环的构成；1 402 cm-1 附 近的吸收峰来自酰胺键中的-C-N，同样 也