【毕业学位论文】（Word原稿）柑橘黄龙病植株内生细菌群落结构多样性的研究

编 号 10394 图书分类号 学 号 20091089 密 级 全日制学术型研究生硕士学位论文 柑橘黄龙病植株内生细菌 群落结构多样性的研究 科 专 业： 微生物学 研 究 方 向： 植物病害防治 指 导 教 师： 申请学位级别： 理学硕士 论文提交日期 ： 2012 年 5 月 1 日 论 文 评 阅 人 ： 论文答辩日期 ： 2012 年 6 月 1 日 答辩委员会主席： 学位授予单位 ： 福建师范大学 学位授予日期 ： 2012 年 月 日 2012 年 6 月摘要 I 中文 摘要 本文主要研究顺昌 柑橘黄龙病发病情况，通过 析 柑橘内生细菌与柑橘黄龙病病原之间的相关性，并采用 究柑橘内生菌的群落结构。 田间调查表明 园区种植品种主要为红心柚，种植 5600 棵，其中 16 棵发生黄龙病，发病率 对发病果树进行 橘黄龙病病原检测，结果 表明顺昌红心柚黄化是由于柑橘黄龙病病原菌引起的。对柑橘黄龙病病原 16S 列进行分析，顺昌柑橘感 染的黄龙病为亚洲型 ( 对红心柚黄龙病株内生细菌进行分离鉴定，得到的 29 个细菌隶属于 19 个种、 10 个属柑橘内生细菌。 析结果表明 叶片黄龙病病原与 之间呈显著 负相关。 不同部位枝条之间相关性和不同部位叶片之间相关性都存在显著正相关，这说明柑橘植株作为一个微生态系统，为内生细菌所提供的生存环境都具有高度正相关性。植物本身作为一个微生态系统 为内生细菌提供栖息场所，这种微生态系统通过不同微生物种群间的相互作用，建立了一种动态的生态平衡。 通过 脂脂肪酸）标记分析柑橘不同部位，不同健康状态叶片 样性发现，共检测出了 42 个脂肪酸生物标记， 说明红心柚黄龙病株内生微生物群落类丰富。 不同方向红心柚黄龙病株叶片内生微生物 量差异显著，而不同高度和不同健康状态的红心柚黄龙病株叶片内生微生物 量存在一定的差异，但差异不显著。 本研究以柑橘内生菌为研究切入点，探索柑橘黄龙病 植株 内生细菌 的 群落结构多样性 ，为 柑橘内生 细菌资源的进一步开发与利用 奠定物质基础 ， 并 为柑橘黄龙病的生物防治 和 柑橘黄龙病的研究 提供理论依据 以及 新思路 。 关键词： 柑橘黄龙病；内生细菌；多样性；群落结构； 要 on of of 6 600 s of a 6S of in 26 9 0 LB as to to 2 It as a as as of of a in 42 in of in of in of 文文摘 V 中文文摘 柑橘黄龙病（ 称 世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一 。自 20 世纪初在华南地区首次报道以来，已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的 40 多个国家相继发生， 严重影响到世界柑橘产业的发展。柑橘发生黄龙病后，会产生一系列典型症状：斑驳黄化、均匀黄化、缺素状黄化、红鼻子果或青果。研究柑橘黄龙病的困难主要存在于 以下几个方面：（ 1）长期以来对黄龙病的诊断主要依据病株典型黄梢和叶斑驳症状，但病株症状的发展过程易受到环境条件的影响，若症状不明显则难以诊断；（ 2）柑橘黄龙病病原菌（ 尚不能人工培养，这增加柑橘黄龙病研究的困难。（ 3）柑橘黄龙病尚无有效的防治药剂和抗性品种，一旦感病只有挖除。 柑橘内生细菌是柑橘微生态系统的组成成分， 在长期的协同进化中，与 柑橘植株 形成了互惠互利的关系。一方面宿主 柑橘植株 产生的光和产物可为内生菌提供其生长所需的营养，另一方面内 生细菌产生的代谢产物常包含一些促生或抗菌的活性物质，能促进 柑橘植株 的生长发育，提高植株抗逆境、抗胁迫和抗病害的能力。 不同生长状态的柑橘内生细菌结构不 同，柑橘的不同生长状态，其生理特性决定了内生菌存在着多样性。因此，不同状态柑橘内生细菌群落结构特性成了柑橘生长状态的一种指标。在不同的内生细菌组成和群落结构下，柑橘黄龙病的发生状况不同，研究他们之间的关系，找到能够标识不同状态下柑橘植株健康状态的内生细菌群落结构，探索柑橘内生细菌群落结构对柑橘黄龙病发生的影响，为柑橘黄龙病的综合治理提供新思路、新技术。 本研究对 福建省顺昌县 赵氏园艺 技术研究所果树基地的柑橘黄龙病发生情况做了田间调查；采用 测方法对柑橘黄龙病植株不同部位叶片进行黄龙病病原的检测；采用纯培养的方法对柑橘黄龙病植株不同部位（上、中、下）和不同方位（东、西、南、北）叶片，枝条以及根部内生细菌进行分离、鉴定，统计各类内生细菌的在柑橘黄龙病植株不同部位的分布数量，分析柑橘黄龙病植株不同部位内生细菌分布特性及与黄龙病病原菌分布之间的相关性；采用磷脂脂肪酸（ 物标记法，分析柑橘黄龙病植株不同部位及健康状态叶片内生微生物群落结构。 福建师范大学孙大光硕士位论文 要研究结果： 1、田间调查结果显示， 园区种植品种主要为红心柚、种植 5600 棵，其中 16棵发生黄龙病，发病率 该产区的感病红心柚叶片黄化程度严重，有的甚至出现部分枝条叶片黄化或整棵植株叶片失绿变黄。 2、 对 16 棵发病果树中的 1 棵果树进行 橘黄龙病病原检测， 结果表明 红心柚黄化率为 柑橘不同部位叶片黄龙病病原的阳性检出率为 其中 4 个为显性性状， 3 个为隐性性状。不同地区的柑橘黄龙病病原菌 16S 建系统发育树比较不同地区柑橘黄龙病病原菌之间的进化 关系，并分析不同地区的柑橘黄龙病病原菌 16S 序列差异性。结果表明，不同部位叶片内的柑橘黄龙病病原 16S 同源性达 99%以上。柑橘黄龙病病原菌 16S 化分析表明，顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型。 16S 序列差异性分析表明，亚洲种与非洲种的差异性为 非洲种与美洲种的差异性为 亚洲种与美洲种的差异性为 3、从供试柑橘中分离得到 26 株内生细菌（叶片 10 株，枝条 14 株，根部 2 株）隶属于 10 个属 19 个种。 析表明，柑橘黄龙病病原菌分别与柑橘叶 片内生细菌 显著负相关。柑橘叶片内生细菌 别与 显著正相关。柑橘枝条内生细菌 别与 在显著正相关， 间没有相关性。比较柑橘不同器官内生细菌之间相互关系表明，叶片内生细菌之间和柑橘枝条内 生细菌之间呈显著正相关，柑橘根部内生细菌之间呈完全正相关。不同柑橘器官的内生细菌之间都存在负相关性。不同器官之间的 析表明，叶片与枝条关于内生细菌含量的相关系数 显著正相关，其他器官之间相关性不大。 16S 因序列聚类分析，得出 26 株内生细菌可以分为两大类，第 I 大类为革兰氏阳性菌，第 类为革兰氏阴性菌。第 I 大类又可以分为芽胞杆菌纲和放线菌纲两个亚类，第 类可以分为 橘黄龙病病原与叶片内生细菌可以分为三类，第 I 类具有与黄龙病病原菌存在负相关特 性，第 细菌具有叶片分布特征，第 细菌具有非叶片分布细菌特征；柑橘黄龙病植株内生细菌可以分为三大类，第 大类特点是其在叶片中的含量不小于 03 03 大类特点是仅存在于根部且其含量大于 03 福建师范大学孙大光硕士学位论文 内生细菌 数为最高，根部内生细菌 数最低。枝条内生细菌 D）指数最高，根部内生细菌 D）指数最低。根部内生细菌 数最高，枝条内生细菌 数最低。由于柑橘不同部位器官的健康状况以及其为内生细菌提供的生长环境和营养条件的不同，从而最终引起内生细菌群落结构的不同。 4、采用磷脂脂肪酸（ 物标记法，分析柑橘黄龙病株不同部位叶片内部微生物群落结构，结果从柑橘黄龙病植株叶片共检测到 42种 中完全分布的生物标记有 9 种，不完全标记有 33 种；对 行聚类分析表明，柑橘黄龙病株不同部位叶片内部微生物 以分为 2 大类群，类群 I 特点为脂肪酸生物标记 均为不完全分布，类群 的特点为脂肪酸生物标记在被检测的柑橘黄龙病株很多空间的叶片均有分布。总体来看，不同方向中，东面叶片内部微生物 量最大；不同高度中，下部叶片内部微生物 量最大。此外，不同方向中，南面叶片真菌 /细菌比值和 G+/同高度的叶片中，真菌 /细菌比值和 G+/同高度的叶片内部微生物种群多样性指数差异不显著。主成分分析表明，主成分 1 和主成分 2 基本上能把柑橘黄龙病株不同方向叶片内部微生物种群区分开来。 关键词：柑橘；黄龙病；内生细菌；群落多样性； 录 中文摘要 . I . 文文摘 . V 目 录 . 论 . - 13 - 1 柑橘黄龙病及其研究进展 . - 13 - 橘黄龙病的发生及其危害 . - 13 - 橘黄龙病的研究进展 . - 14 - 2 柑橘内生细菌的研究进展 . - 15 - 橘内生细菌多样性 . - 16 - 橘内生细菌的研究方法 . - 17 - 橘内生细菌的生物学作用 . - 19 - 橘内生细菌发展前景 . - 20 - 3 脂肪酸技术及在植物内生菌中的应用 . - 21 - 原理与方法 . - 21 - 应用 . - 22 - 4 本研究的目的与意义 . - 23 - 5 本研究的技术路线 . - 24 - 第一章 柑橘黄龙病田间调查和样品采集 . - 25 - 1 材料与方法 . - 25 - 料 . - 25 - 样方法 . - 25 - 2 结果与分析 . - 25 - 2. 1 柑橘种植地的地形地貌 . - 25 - 2. 2 柑橘种 植地黄龙病发病情况调查结果 . - 25 - 2. 3 柑橘田间症状表现 . - 25 - 2. 4 柑橘黄龙病植株样品采集与处理 . - 26 - 福建师范大学孙大光硕士位论文 X 3 讨论 . - 27 - 第二章 柑橘黄龙病病原检测及其 16S 列分析 . - 29 - 1 材料与方法 . - 29 - 试样品 . - 29 - 试试剂 . - 29 - 试仪器 . - 29 - 法 . - 30 - 2 结果与分析 . - 31 - 橘黄龙病病原检测 . - 31 - 橘黄龙病病原 16S 列分析 . - 32 - 橘黄龙病病原 16S 化树的构建 . - 33 - 同类型柑橘黄龙病病原 16S 序列差异性分析 . - 34 - 3 讨论 . - 36 - 第三章 柑橘黄龙病株内生细菌 多样性 . - 37 - 1 材料与方法 . - 37 - 料 . - 37 - 法 . - 37 - 2 结果与分析 . - 39 - 橘黄龙病株内生细菌分离与鉴定 . - 39 - 橘黄龙病原菌与内生细菌的相互关系 . - 41 - 橘不同部位叶片内生细菌的相互关系 . - 43 - 橘不同部位枝 条内生细菌的相互关系 . - 46 - 橘黄龙病株不同器官内生细菌群落结构多样性 . - 51 - 3 讨论 . - 55 - 第四章 柑橘黄龙病植株内生菌空间分布 态性 . - 57 - 1 材料与方法 . - 57 - 料 . - 57 - 法 . - 58 - 2 结果与分析 . - 59 - 心柚黄龙病株内生微生物磷脂脂肪酸生物标记的分布特性 . - 59 - 福建师范大学孙大光硕士学位论文 心柚黄龙病株不同空间叶片 成及含量比较 . - 63 - 心柚黄龙病株不同部位内生菌 样性指数 . - 65 - 心柚黄龙病株不同部位内生菌 成分分析 . - 65 - 3 讨论 . - 67 - 第五章 结论与展望 . - 69 - 1 结论 . - 69 - 2 展望 . - 70 - 附录 . - 71 - 参考文献 . - 73 - 攻读学位期间承担的科研任务与 主要成果 . - 81 - 致 谢 . - 83 - 个人简历 . - 85 - 绪论 - 13 - 绪 论 柑橘类果树属于芸香科（ 橘亚科，在世界上很多国家和地区都有栽培，在巴西、中国、美国主要集中种 植地 1。柑橘是我国很多地区第一大水果，据联合国粮农组织的有关资料显示， 2006 年我国柑橘种植面积为世界第三。 目前，世界柑橘面积，产量分别为 832 万公顷， 吨； 2007 年我国柑橘面积 量 吨； 2008 年柑橘面积 公顷，产量 2200 万吨，与 2007年相比，面积增加 12 万公顷，产量增加约 150 万吨 2。柑橘以其特有的感官性状及营养价值深受人们喜爱，不仅仅柑橘的口味宜人而且柑橘本身含有很多功能性成分，比如说香精油、色素、果胶、膳食纤维、黄酮类化合物、柠檬苦素 类化合物 3。这些功能性物质赋予了柑橘很多用途，可广泛应用于功能性食品的开发、药物的开采及一些功能性饲料 4的研制。然而，柑橘病害较严重，影响了柑橘产业的健康发展。近年来，关于植物内生细菌生防作用的开发与利用受到了重视，如何利用内生细菌解决柑橘病害问题，对柑橘产业的健康发展具有十分重要的意义。 1 柑橘黄龙病及其研究进展 柑橘黄龙病是世界性柑橘生产上的一种毁灭性病害，据记载黄龙病起源于 19世纪初的中国，黄龙病的植物流行病条件在福建潮汕和永春地区第一次被关注。 1925年在南非也有了关于黄龙病的报道。 1995 年在我国福州市召开国际柑桔病毒学会(十三届学术讨论会上，通过法国学者 提议，决定今后将此类病害的正名称为柑橘黄龙病 (这是对我国已故植物病理学者林孔湘教授的最好表彰 5 。 橘黄龙病的发生及其危害 十九世纪 90 年代黄龙病首先在中国发现，接着 60 年之后在中国台湾省发现了类似黄龙病的病症，在 1919 年第一次用英语报道了中国南部的黄龙病症状，到了1935 年这里的病症已经非常严重了。 1921 年在菲律宾也发现了与黄龙病相似的病症，当时他们认为 这种病症可能是和加利福尼亚一样的缺锌病症。二十世纪 40 年代印度尼西亚也发现了黄龙病，到了 1957 年黄龙病已经非常严重了 6,7。而在 1937 年南非第一次报道了黄龙病，当时认为可能是由于矿质元素的毒害。黄龙病相继在其他的地区都有了很多的报道，如也门、香港、日本、沙特阿拉伯、泰国、澳大利亚等 6。 福建师范大学孙大光硕士位论文 - 14 - 研究表明，由于黄龙病在一棵树的不同部位，其病症是不断改变的，所以对黄龙病所有症状也有细心的研究。黄龙病症在柑橘的叶子上表现的比较容易识别，但在果实上就很难分辨了。其典型的症状有 4 种，斑驳状黄化，是田间判断的主要症状；均匀黄化，主要是新梢不转绿，蕉柑的夏、秋梢较多，也是田间判断的主要症状；缺素状黄化，以类似缺锌状或缺锰状黄化为主，不能作为田间判断的主要症状；红鼻子果或青果，目前已成为果农和果品经销商识别黄龙病的主要症状 8 。 橘黄龙病的研究进展 龙病病原 早期研究，人们普遍认为黄龙病是由于缺水、线虫、镰刀菌或是植株缺素所引起的 9。 20 世纪 50 年代林孔湘通过试验和调查结果，否定了以上提到的黄龙病病原，并证实柑橘黄龙病能通过嫁接传染，苗木带病可在田间自然蔓延。当时推断黄龙病病原是一种病毒 10。而在 1970 年法国科学家通过电镜观察到黄龙病甜橙叶片的韧皮部病原体，当时认为是类菌原体。紧接着他们发现黄龙病病原体的膜包被与典型的类病原菌不同，建议黄龙病病原应属于真细菌。最后证实黄龙病病原是一种革兰氏阴性细菌，然而目前这种韧皮部杆菌 (不能人工培养11。 70 年代以来，我国学者对柑橘黄龙病展开了大量深入的研究，证明其病原菌在形态结构等方面的性质与非洲青果病病原菌十分相似，从而确定了黄龙病的病原性质。后来研究发现我国的黄龙病与非洲青果病在传病介体，热 敏感性流行区域和血清学方面均存在差异，分别称之为亚洲型和非洲型 12 。 龙病的传播途径 黄龙病的传播途径除了通过嫁接传播，用病树接穗繁殖，以及接穗和病苗的远距离传播之外，柑橘木虱是重要的传播媒介。病原还可以通过菟丝子寄生传播，但不能通过磨擦汁液和土壤传播 13。 木虱（ 昆虫纲同翅目 (虱科 (成虫体长 3 毫米，全体青灰色而有褐色斑纹，体被白粉，触角 10 节，末端具 2 条不等长硬毛，前翅半透明，散布褐色斑纹，后翅无色 透明。柑橘木虱以柑橘为主食并且在柑橘上繁殖，当木虱采食到有黄龙病的柑橘时，这样以来木虱也就会被黄龙病病原体感染。一旦木虱感染了黄龙病病原，那么木虱就会在采食柑橘的同时将黄龙病病原体传播到健康的柑橘植株体内 14。早在二十世纪 60 年代， 分别报道，木虱 木虱 别对亚洲型和非洲型黄龙病传绪论 - 15 - 播的影响 15。 龙病的诊断与检测 20 世纪 90 年代， 合酶链式反应）检测技术已经应用到黄龙病检测。自 1992克隆、测序柑橘黄龙病病原序列以来，黄龙病的 测在世界多个实验室开展起来。到目前为止，柑橘黄龙病 测方法主要有常规 量 9。 1996 年田亚南等采用多聚酶链式反应 (术对柑橘黄龙病病原进行检测和定量分析，结果表明， 术能准确、快速地检测出田间和温室内罹病的柑橘、长春花以及带菌柑橘木虱样本中的柑橘黄龙病病原，而健康植株和柑橘木虱样本则呈阴性反应。采用的 物是根据柑橘黄龙病病原亚洲株系的 列（基因库号码： 计的应用竞争性定量多聚酶链式反应（ 法能测定病原在不同样品中的含量 16 。在 2006 年胡浩等利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因设计了 2 对 物 此为基础建立了常规 光染料法荧光定量 应体系，荧光定量 法可以为柑橘黄龙病的病害早期诊断以及柑橘黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术 17 。灵敏度可检测到 因组 景下一个拷贝的病毒基因 18。常规 测黄龙病病原菌时，均未检测出病原 用 行检测，结果均扩出了特异性目的片段，这表明 术检测的灵敏度远高于常规灵敏度 19 。 2 柑橘内生细菌的研究进展 自从 1992 年 第一次提出植物内生细菌 （ 念以来，随着植物微生态学的发展，越来越多关于内生细菌的报道揭示出有些内生细菌对一些植物病源菌、原生生物和害虫具有防治的作用 2