【毕业学位论文】（Word原稿）柑橘内生细菌群落结构多样性的研究

学校编号 10394 图书分类号 学 号 20091089 密 级 全日制 学术型 研究生 硕士学位论文 柑橘内生细菌群落结构多 样性的研究 学 科 专 业： 微生物学 研 究 方 向： 植物 病害防治 指 导 教 师： 研究员 申请学位级别： 理 学 硕 士 论文提交日期 ： 年 月 日 论文评阅人 ： 论文答辩日期 ： 年 月 日 答辩委员会主席： 学位授予单位 ： 师范大学 学位授予日期 ： 年 月 日 年 月摘要 I 中文摘要 本文 主要研究 顺昌 柑橘黄龙病发病情况和 柑橘黄龙病病原菌进行鉴定， 以及柑橘内生菌的群落结构以及柑橘内生细菌与柑橘黄龙病病原之间的相关性。 结果发现， 红心柚的黄 化 症状最为严重 ， 经过田间黄化症状的调查和 橘黄龙病病原检测 ，红心柚 黄化率为 不同部位叶片柑橘黄龙病病原阳性检出率为 这表明，柑橘黄龙病发生是具有一 定潜伏期。对柑橘黄龙病病原 16S 列进行分析，在 对结果表明，顺昌柑橘感染的黄龙病为亚洲型 (从 红心柚、蜜桔、金桔健康植株分别分离得到内生细菌 10 个属 13 个种， 14 个属 22 个种， 12 个属 21 个种，柑橘植株内生细菌的分布和多样性指数有很大的差异。 对红心柚黄龙病株内生细菌进行分离鉴定，得到 10个属柑橘内生细菌 。 析结果表明 叶片黄龙病病原与 的之间呈显著负相关 。 不论在叶片还是枝条中，不同内生细菌之间有的存在正相关，有的存在负相关 。 不同部位枝条之间相关性和不同部位叶片之间相关性都存在显著正相关，这说明柑橘植株作为一个微生态系统，为内生细菌所提供的生存环境都具有高度正相关性 。 植物本身作为一个微生态系统为内生细菌提供栖息场所，这种微生态系统通过不同微生物种群间的相互作用，建立了一种动态的生态平衡。 通过 脂脂肪酸）标记分析柑橘不同部位，不同健康状态叶片 样性发现，共检测出了 42 个脂肪酸生物标记， 说明红心柚黄龙病株内生微生物群落 类丰富。不同朝向红心柚黄龙病株叶片内生微生物 量差异显著，而不同高度和不同健康状态的红心柚黄龙病株叶片内生微生物 量存在一定的差异，但差异不显著。 关键词： 柑橘黄龙病；内生细菌；多样性； 群落结构； 要 of to an in by to to on s s of a 6S in A 32 7 of in 6S 6 9 0 LB as to to 2 It as a as as of of a in 42 in of in of in of 文文摘 V 中文文摘 柑橘是世界上最重要的水果之一，不仅具有重要的食用价值，而且在药物以及一些功能性饲料等方面都得到了广泛的开发与利用。然而柑橘黄龙病却在很大程度上阻碍了柑橘产业的发展。柑橘黄龙病是一种世界性的毁灭性病害，柑橘黄龙病主要分布于亚洲东南部地区，非洲的南非及东非，巴西等 40 多个国家和地区。由于黄龙病病症是不断改变的。目前，柑橘黄龙病田间诊断主要是通过其典型的症状如斑驳状黄化，均匀黄化，缺素状黄化，红鼻子果或青果。 柑橘内生细菌是柑橘微生态系统的组成成分，它们和柑橘植株之间 建立和谐联合的关系 ， 系统地分布于植物组织内，拥有足够的碳源和氮源，而且受到植物组织的保护，比暴露于恶劣外界环境的附生细菌更具有稳定的生存环境，更易于发挥作用。并在一定程度上促进了寄主植物对环境的适应，并加强了系统的生态平衡。目前已了解到的植物内生细菌生物学作用主要有：作为生物防治剂、植物促生作用。 本文对顺昌 双溪街道办事处北门水库赵氏园艺 技术研究所果树基地的柑橘黄化情况做了调查，结果发现，当地的红心柚的黄花症状最为严重。经过田间黄化症状的调查和实验室 橘黄龙病病原的检测得出，一棵红心柚其 其不同部位叶片柑橘黄龙病病原阳性检出率为 这表明，柑橘黄龙病发生是具有一定潜伏期。对柑橘黄龙病病原的部分 16S 列进行分析，在对结果表明，顺昌柑橘感染的黄龙病为亚洲型柑橘黄龙病病原。 对红心柚、蜜桔、金桔内生细菌数量进行统计、分类并作群落多样性分析。 3种柑橘共分离得到的内生细菌 属于 32 个种，隶属于 17 个属。红心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌 10 个属 13 个种， 14 个属 22 个种， 12 个属 21 个种。不同种类细菌中 芽胞杆菌 属细菌含量最高， 3 种柑橘中金桔的内生 细菌含量最高，不同器官中根部的内生细菌含量最高，不同种类柑橘中 红心柚的优势度指数和均匀度最高，分别为 桔的多样性指数最高为 不同柑橘和不同器官中内生细菌的种类、数量和群落多样性存在较大差异。本研究丰富了柑橘内生细菌资源，为柑橘内生细菌的利用提供了物质基础，并对科学说明生防作用机理具有重要价值。 采用 系统聚类和多样性指数研究了柑橘黄龙病 (株不同部位叶片、枝条及其根部内生细 菌的相互关系及其群落结构多样性。结果表明，从供试柑橘中分离得到 26 株内生细菌（叶片 10 株，枝条14 株，根部 2 株）隶属于 10 个属 19 个种。 果显示，柑橘植株不同空间叶片中，黄龙病病原的阳性检出率为 用 比较显示，柑橘内生细菌福建师范大学孙大光硕士学位论文 不同器官的含量（鲜重）大小依次为根 叶 枝条。不同高度叶片和枝条内生细菌含量的差异不显著，而不同方向的叶片和枝条内生细菌含量在 5%水平上差异显著。析表明，柑橘黄龙病病原菌分别与柑橘叶片内生细菌 显著负相关。柑橘叶片内生细菌 别与 显著正相关。柑橘枝条内生细菌 别与 在显著正相关， 较柑橘不同器官内生细菌之间相互关系表明，叶片内生细菌之间和柑橘枝条内生细菌之间呈显著正相关，柑橘根部内生细菌之间呈完全正相关。不同 柑橘器官的内生细菌之间都存在负相关性。不同器官之间的 析表明，叶片与枝条关于内生细菌含量的相关系数 显著正相关，其他器官之间相关性不大。 16S 因序列聚类分析，得出 26 株内生细菌可以分为两大类，第 I 大类为革兰氏阳性菌，第 类为革兰氏阴性菌。第 I 大类又可以分为 芽胞杆菌 纲和放线菌纲两个亚类，第 类可以分为 橘黄龙病病原与叶片内生细菌可以分为三类，第 I 类具有与黄龙病病原菌存在负相关特性，第 细菌具有叶片分布特征，第 细菌具有非叶片分布 细菌特征；柑橘黄龙病植株内生细菌可以分为三大类，第 03 大类特点是含量都不大于 03 大类特点是仅存在于根部且其含量大于 03 片内生细菌 数为最高，根部内生细菌 数最低。枝条内生细菌 D）指数最高，根部内生细菌 D）指数最低。根部内生细菌 数最高，枝条内生细菌 数最低。由于柑橘不同部位 器官的健康状况以及其为内生细菌提供的生长环境和营养条件的不同，从而最终引起内生细菌群落结构的不同。 采用磷脂脂肪酸（ 物标记法，分析红心柚黄龙病株不同空间及健康状态叶片内生微生物群落结构，结果从红心柚黄龙病植株叶片共检测到 42 种中完全分布的生物标记有 9 种，不完标记有 33 种；对磷脂脂肪酸生物标记进行聚类分析表明，红心柚黄龙病株不同空间叶片内生微生物 以分为 2大类群，类群 I 特点为脂肪酸生物标记均为不完全分布，类群 的特点为脂肪酸生物标记在红心柚黄龙病株很多空间的叶片均有分布。 红心柚黄龙病株不同空间及健康状态叶片内生微生物磷脂脂肪酸生物标记组成及含量存在差异。总体来看，不同朝向中，东面叶片内生微生物 量最大；不同高度中，下部叶片内生微生物量最大；不同健康状态中，带有黄龙病原叶片内生微生物 量比健康植株叶片更大。此外，不同朝向中，南面叶片真菌 /细菌值和 G+/同高度的叶片中，真菌 /细菌值和 G+/同健康状态中，健康叶片的福建师范大学孙大光硕士学位论文 菌 /细菌值和 G+/红心柚黄龙病株不同空间及健康状态叶片 内生微生物多样性研究 表明，不同朝向和不同健康状态的叶片内生种群多样性指数差异显著，不同高度的叶片内生种群多样性指数差异不显著。主成分分析表明，主成分一和主成分二基本上能把红心黄龙病株不同朝向叶片内生种群区分开来。对红心柚黄龙病株不同空间及健康状态叶片进行聚类，结果发现带有黄龙病原的叶片聚为一类，不带黄龙病原的健康叶片分聚为两类，其中，不同朝向的叶片分聚在不同的亚类群中，表明红心柚黄龙病株内生微生物 布与叶片健康状态和叶片朝向均有紧密关系，与叶片健康状态关系更为密切。 关键词：柑橘；黄龙病；内生细菌；群落多样性； 录 录 中文摘要 . I . 文文摘 . V 目录 . 一章 绪 论 . - 1 - 橘黄龙病及其研究进展 . - 1 - 橘黄龙病的发生及其危害 . - 1 - 橘黄龙病的研究进展 . - 2 - 橘内生细菌的研究进展 . - 3 - 橘内生细菌多样性 . - 3 - 橘内生细菌的研究方法 . - 5 - 橘内生细菌的生物学作用 . - 6 - 橘内生细菌发展前景 . - 7 - 肪酸技术及在植物内生菌中的应用 . - 9 - 谱分析的原理与方法 . - 9 - 应用 . - 10 - 研究的目的与意义 . - 11 - 研究的技术路线 . - 12 - 第二章 柑橘黄龙病田间调查 . - 13 - 言 . - 13 - 料与方法 . - 13 - 料 . - 13 - 查地点 . - 13 - 查方法与内容 . - 13 - 果与分析 . - 13 - 橘田间症状表现 . - 13 - 橘品种与柑橘黄龙病发生的关系 . - 15 - 福建师范大学孙大光硕士学位论文 X 论 . - 16 - 第三章 柑橘黄龙病病原检测及柑橘黄龙病病原菌 16S 列分析 . - 19 - 言 . - 19 - 查地点 . - 19 - 要仪器与试剂 . - 19 - 法与步骤 . - 20 - 果与 分析 . - 22 - 橘叶片黄龙病病原菌检测 . - 22 - 橘黄龙病病原菌与柑橘叶片黄化之间的关系 . - 24 - 橘不同部位黄龙病病原 16S 测序 . - 25 - 橘黄龙病病原 16S 化分析 . - 25 - 同类型黄龙病病原 16S 序列差异性分析 . - 26 - 论 . - 28 - 第四章 柑橘内生细菌分离、鉴定及群落结构多样性 . - 29 - 言 . - 29 - 料与方法 . - 29 - 料 . - 29 - 法 . - 29 - 果和分析 . - 31 - 橘内生细菌分离与鉴定 . - 31 - 橘内生细菌分布特性 . - 33 - 橘内生细菌聚类分析 . - 35 - 橘内生细菌多样性 . - 36 - 论 . - 37 - 第五章 柑橘黄龙病株内生细菌相关性 . - 39 - 言 . - 39 - 料与方法 . - 39 - 料 . - 39 - 法 . - 39 - 据处理 . - 41 - 福建师范大学孙大光硕士学位论文 果与分析 . - 41 - 橘黄龙病株内生细菌分离与鉴定 . - 41 - 橘不同部位叶片黄龙病病原分子检测 . - 43 - 橘黄龙病原菌与内生细菌的相互关系 . - 44 - 橘不同部位叶片内生细菌的相互关系 . - 45 - 橘不同部位枝条内生细菌的相互关系 . - 47 - 橘黄龙病株不同器官内生细菌群落结构多样性 . - 50 - 结与讨论 . - 53 - 第六章 柑橘黄龙病植株内生菌空间分布 态性 . - 57 - 言 . - 57 - 料与方法 . - 57 - 试材料 . - 57 - 橘黄龙病原分子检测 . - 57 - 橘黄龙病植株内生菌的 析 . - 57 - 计分析 . - 57 - 果与分析 . - 58 - 心柚黄龙病株不同空间叶片的黄龙病原检测 . - 58 - 心柚黄龙病株内生微生物磷脂脂肪酸生物标记的分布特性 . - 59 - 心柚黄龙病株不同空间叶片 成及含量比较 . - 65 - 心柚黄龙病株不同部位内生菌 样性指数 . - 68 - 心柚黄龙病株不同部位内生菌 成分分析 . - 68 - 心柚黄龙病株不同部位内生菌 类分析 . - 69 - 论 . - 70 - 第七章 结论与展望 . - 73 - 论 . - 73 - 望 . - 74 - 附录 1 . - 75 - 附录 2 . - 77 - 参考文献 . - 79 - 攻读学位期间承担的科研任 务与主要成果 . - 87 - 福建师范大学孙大光硕士学位论文 谢 . - 89 - 索引 . - 91 - 个人简历 . - 93 - 第一章 绪 论 - 1 - 第一章 绪 论 柑橘类果树属于芸香科（ 橘亚科，在世界 上很多国家和地区都有栽培， 在巴西、中国、美国 主要集中种植地 1, 2。柑橘是我国 很多地区第一大水果 ，据联合国粮农组织的有关资料显示， 2006 年我国柑橘种植面积 为 世界第三。 目前，世界柑橘面积，产量分别为 832 万公顷， 吨； 2007 年我国柑橘面积 量 吨； 2008 年柑橘面积 公顷，产量 2200 万吨，与 2007年相比，面积增加 12 万公顷，产量增加约 150 万吨 3, 4。柑橘以其特有的感官性状及营养价值深受人们喜爱，不仅仅柑橘的口味宜人而且柑橘本身含有很多功能性成分，比如说香精油 5、色素 6、果胶 7、膳食纤维 8、黄酮类化合物 9、柠檬苦素类化合物 10。这些功能性物质赋予了柑橘很多用途，可广泛应用于功能性食品的开发、药物的开采及一些功能性饲料 11的研制。然而，柑橘病害较严重，影响了柑橘产业的健康发展。近年来，关于植物内生细菌生防作用的开发与利用受到了重视 12，如何利用内生细菌解决柑橘病害问题，对柑橘产业的健康发展具有十分重要 的意义13。 橘 黄龙病及其研究进展 柑橘黄龙病是世界性柑橘生产上的一种毁灭性病害，据记载黄龙病起源于 19世纪初的中国，黄龙病的植物流行病条件在福建潮汕和永春地区第一次被关注。 1925年在南非也有了关于黄龙病的报道。 1995 年在我国福州市召开国际柑拮病毒学会(十三届学术讨论会上，通过法国学者 提议，决定今后将此类病害的正名称为柑橘黄龙病 (这是对我国已故植物病理学者林孔湘教授证明它是一种嫁接传染性病害的最好表彰 14。 橘 黄龙病 的发生及其危害 十九世纪 90 年代黄龙病首先在中国发现，接着 60 年之后在中国台湾省发现了类似黄龙病的病症，在 1919 年第一次用英语报道了中国南部的黄龙病症状，而到了1935 年这里的病症已经非常严重了。而在 1921 年菲律宾也发现了与黄龙病相似的病症，而他们当时认为这种病症可能是和加利福尼亚一样的缺锌病症。二十世纪 40年代印度尼西亚也发现了黄龙病，直到 1957 年黄龙病已经非常严重了 19而在1937 年南非第一次报道了黄龙病，当时认为可能是由于矿质元素的毒害。黄龙病相继在其他的地区都有了很多 的报道，如也门、香港、日本、沙特阿拉伯、泰国、澳大利亚等等 19。 研究表明，由于黄龙病在一棵树的不同部位，其病症是不断改变的，所以对黄龙病所有症状细心研究。黄龙病症在柑橘的叶子上表现的比较容易识别，但在果实福建师范大学孙大光硕士学位论文 - 2 - 上就很难分辨了。其典型的症状有 4 种，斑驳状黄化，是田间判断的主要症状；均匀黄化，主要是新梢不转绿，蕉柑的夏、秋梢较多，也是