【毕业学位论文】（Word原稿）芽胞杆菌属种类全基因组序列相似性及其分子系统发育研究

芽胞杆菌 属种类全基因组序列相似性及其 分子 系统发育研究 on of its 要：利用高通量基因组测序技术，测定芽胞杆菌属 90%以上种类 标准菌株 （ 160株）和中国不同生境采集的 200株芽胞杆菌，绘制芽胞杆菌属种类全基因组精细图，分析基因组序列相似性，建立 基因组核心基因（ 均核苷酸一致性（ ，分析 关性，用 为基于全基因组测序的芽胞杆菌种类鉴定黄金标准 ，建立基于 分析芽胞杆菌生理分化（如 嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热 特性等）基因组序列的保守基因簇，利用 位点序列分型），进行分子系统发育分析，提出芽胞杆菌属依据生理分化的系统进化亚属分类单元或分群。分析中国芽胞杆菌种类资源和生态进化，编制中国芽胞杆菌名录，为进一步挖掘我国芽胞杆菌功能基因和应用领域提供科学基础。 0% of 160 s 00 by to to of on NI it is NI DH as of of of on of of or of of in to of a （一）立项依据与研究内容 （ 4000 1. 项目的立项依据 （研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）； 究意义 芽胞杆菌属（ ， 属于 细菌界（ 厚壁菌门 （ 杆菌纲（ 芽胞杆菌目（ 芽胞杆菌科（ （ et 2011） 。芽胞杆菌可产生抗逆性极强的内生芽胞来度过不利的生长条件 （ et 2009） ，因此，分布在世界各地广泛，特别是极端环境如南极 （ et 2011） 、火山 （ et 2011） 、沙漠 （ et 2011； et 2001） 、深海 （ et 2011） 、温泉 （ et 2009） 、盐田（ et 2008； et 2011） 、矿藏 （ et 2011） 等中常有芽胞杆菌的踪迹。芽胞杆菌属种类繁多，迄今为止，世界上共记录了芽胞杆菌属（ 效种 171种，芽胞杆菌近缘属 48 属 231 种（ 2011； et 2011） 。中国芽胞杆菌的资源也十分丰富 （ 刘国红等 ， 2008） ，遗憾地是系统地从事芽胞杆菌属资源收集、保存、鉴 定、分类、系统发育等研究较少，保存的芽胞杆菌种类标准菌株十分缺乏，严重地影响了我国芽胞杆菌资源分类与系统发育的研究。 芽胞杆菌 存在着 生理分化的生态适应性， 芽胞杆菌具有嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热、嗜金属 、 好氧、厌氧、耐高压、耐低压等生理分化和生态适应性， 在地球的各种极端条件下都有分布。目前，芽胞杆菌种类鉴定和分类系统主要还是采用多相分类法，包括了形态特征、生理生化、 16肪酸组成（ 细胞壁组成、 交 等。在一般情况下 一种 芽胞杆菌 与其最靠近的已知芽胞杆菌的 16似性 小于 98%， 交 相似性小于 70%，可定为新种。因而，一个芽胞杆菌鉴定过程非常复杂繁琐，特别是 为芽胞杆菌鉴定的黄金标准，检测 技术复杂，费用高； 申请者利用华大基因研究院的新一代高通量全基因组测序技术，其成本和 交成本相差无几（每个芽胞杆菌在 行提取的条件下，全基因组测序的费用在 5 千元左右），可以高效、低成本地完成芽胞杆菌物种基因组序列图谱 全基因组 ，利用芽胞杆菌的全基因组，计算 均氨基酸一致性）， 比较分析 交相似性 ，作为种鉴定的黄金标准，替代交。 同时，获得的全基因组序列，可用于芽胞杆菌生理分化的遗传机制分析 ，研究芽胞杆菌属的分子系统发育， 选择 芽胞杆菌属的生理分化基因序列特征， 利用 多位点 序列分型（ 重新对芽胞杆菌属的分化进行研究，使得芽胞杆菌属的分子系统发育与生物学特性紧密相关，建立一个符合逻辑的芽胞杆菌分类体系 。 芽胞杆菌可以产生多种多样的活性物质， 在工业、农业、医学、环境等领域有着重要的经济价值。芽胞杆菌可以用于生产工业原料（如丙二醇等） （ Wu et 2007） 、医药卫生（如二酮哌嗪等） （ et 2011） 、食品加工（如环糊精） （ et 2011） 、生物农药 （ et 2005； 郑雪芳等 ， 2006； et 2006； et 2011） 、生物肥料 （ et 2011） 、生物保鲜剂（如龙眼短短芽胞杆菌保鲜菌） （ 车建美等 ， 2010，2011； et 2010）、饲用益生菌 （ 陈璐等 ， 2009； et 2011） 、环境生物修复剂 （ et 2011） 、畜禽粪便降解剂（如凝结芽胞杆菌猪粪降解菌） （ 刘波 等 ， 2009； et 2011）、水质生物净化剂 （ et 2010） 等。到目前为止，农业微生物活菌制剂90%来自于芽胞杆菌 （ et 2006） 。同时，芽胞杆菌也是一种模式微生物，在生物学、生态学、生理学、分子生物学、病理学、基因组学、蛋白组学、转入组学、代谢组学等领域具有重要的研究意义 （ et 2011） 。 鉴于芽胞杆菌的重要研究性和应用价值， 发达国家如德国、美国、法国、英国、比利时、日本等已建立了完善的资源收集和研究体系 （ 2008； et 2010） 。丰富的种类标准菌株资源，为芽胞杆菌新种的鉴定和分类体系的研究提供了重要的基础作用（ 2000） 。德国的菌种保存中心（ 存收集了完整的芽胞杆菌属（ 式种 171 种，芽胞杆菌近缘属 48 属 231 种。近 10 年来（ 2001全世界发表的芽胞杆菌属新 种共 135 种；大多数新种发表者来自发达国家，欧美国家发表了 62 种，占总数的 韩国发表了 24，占 日本发表了 17 种，占 我国发表了 14 种，占 10%；印度发表了 10 种，占 其他国家发表了 8 种，仅占 刘国红等 ， 2011） 。尽管我国在 作为微生物学基础研究的重要领域，专业从事分类相关的实验室和研究人员却很少。据周宇光等（ 2007）主编的中国菌种目录记载，保存在中国各大保藏中心的芽胞杆菌属种类种类标准菌株仅 25 种，这些数量与国外保存的芽胞 杆菌属种类标准菌株 171 种相比，对于中国芽胞杆菌资源分类和系统发育研究来说是远远不够的。 本研究拟解决的科学问题是 ： 通过芽胞杆菌全基因组计算 均氨基酸一致性），作为种鉴定的黄金标准，替代 交；选择芽胞杆菌属的生理分化（ 如嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热 等等） 基因序列特征，利用多位点序列分型（ 进行芽胞杆菌属的分子系统发育分析 。 研究 利用收集到的 芽胞杆菌 属 160 种 标准菌株， 进行全属芽胞杆菌种的全基因组测序，利用芽 胞杆菌全基因组，计算 均 核苷酸 一致性），比较分析 交相似性，作为种鉴定的黄金标准，替代 交。选择芽胞杆菌属的生理分化（嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热、嗜金属、好氧、厌氧、耐高压、耐低压等）基因序列特征，利用多位点序列分型（ 重新对芽胞杆菌属的分化进行研究，使得芽胞杆菌属的分子系统发育与生物学特性紧密相关，建立一个符合逻辑的芽胞杆菌分类体系 ， 形成芽胞杆菌 属 资源分类体系，挖掘我国芽胞杆菌种类资源，为我国 芽胞杆菌理论研究和实际应用奠定科学基础。 围绕 芽胞杆菌属种类基因组 均 核苷酸 一致性）分析和多位点序列分型（ 究， 申请者提出 芽胞杆菌属种类全基因组序列相似性及其分子系统发育研究 ，并作了大量的前期研究准备工作。利用申请者作为访问学者和博士生导师与德国波恩大学植物病理研究所 授建立了长达 20 年（ 1992合作关系，已经从德国微生物菌种保藏中心（ 进芽胞杆菌属种类标准菌株 160 种，占芽胞杆菌 属种类标准菌株总数的 还将继续引进，较为完整的芽胞杆菌属种类标准菌株体系（ 171 种，除了部分高致病性芽胞杆菌外），使得国内芽胞杆菌属种类标准菌株保存水平达到了一个新的高度与国际接轨，为本项目的研究打下坚实的基础。 申请者近 15 年来致力于芽胞杆菌资源采集 、保存、鉴定、分类和功能开发，在中国大陆除了湖北、重庆、贵州外的 28 个省（市、自治区）采集和保存了不同地理、不同生境的芽胞杆菌土壤样本 15400 多份，分离到芽胞杆菌属的菌株 18000 余株，将继续进行芽胞杆菌全国范围内的系统采样、极端生境采样（如古墓地 、温泉口、盐田地、矿藏地、 高山湖泊、沙漠、草原、戈壁滩、海滩底泥 等），为中国芽胞杆菌资源收集、保存、鉴定、分类和新种的发现创造条件；申请者研究团队掌握了芽胞杆菌多相分类方法的技术体系，且拥有进行芽胞杆菌分离培养、形态观察、生理生化鉴定、 16S 列测定、 交、脂肪酸分类鉴定的技术体系所需的装备；利用引进的芽胞杆菌属种类标准菌株，对国内采集芽胞杆菌资源进行鉴定和多相分类，整理中国芽胞杆属的种类，力图发现中国芽胞杆菌的新种；测定较为完整的芽胞杆菌属种种类标准菌株的脂肪酸生物标记，补充美国 司建立的仅有50 多种芽胞杆菌种类标准菌株的脂肪酸生物标记的不足，形成完整的 具有 160 种的 芽胞杆菌种类脂肪酸自动鉴定系统，加速我国芽胞杆菌资源鉴定分类的研究；同时进行以芽胞杆菌脂肪酸生物标记为基础的系统发育研究，与 16比较，结合生物学研究，提出芽胞杆菌脂肪酸系统发育的新观点 析我国芽胞杆菌属种类生态分布、群落结构、种群分化的系统发育。 开发出了一批芽胞杆菌生物农药，生物肥料，动物益生菌等，应用于农业生产。 本项目的研究将 建立一个基于芽胞杆菌种类全基因组测序的系统分类体系 ，并将所有数据上网公开，提供芽胞杆菌新种全基因组比对的软件为自助鉴定服务，同时形成芽胞杆菌生理分化的分子系统发育分类系统，填补我 国芽胞杆菌系统分类的空白，在科学上和应用上具有重要意义。 内外芽胞杆菌属的研究现状及发展动态 芽胞杆菌属分类系统研究现状与发展动态。 1835）命名和描述了 纤毛虫 ） 的一个种。 （ 1864）在显微观察炭疽病致死的动物血液中的寄生虫时发现炭疽病是可以从死亡的动物血液中相互传染的， 定名为1870 年 研究蚕病时，在蚕软腐病 （ 死亡的昆虫中，明显地观察到内生芽胞，发现了内生芽胞的细菌。直到 1872）提出芽胞杆菌属（ 其分类地位才固定下来，将 为该属的种类标准菌株，并重新命名为枯草芽芽胞杆菌 1877 年 述了 芽胞，证明了芽胞的抗热性。 1877年 出了炭疽芽胞杆菌 细胞生长循环，指出了细菌生长从细胞到抗热芽胞，再从抗热芽胞到细胞。 1891）第一个提出使用好气生长特性对 进行分类。早期的分类学家把杆状的细菌均归结为 ，从而导致了这个属含有大量的种类，虽然在 1929）的著作 ，把这个属定义为好氧的、含有芽胞的杆菌、通常为革兰氏阳性，当时在这个属中大约有 200 多个种，但是，直到今天仍然有很多微生物学家认为这 个属存在着巨大的多样性，是可以分化的（ 1965）。 在细菌分类学研究上的三个重要的里程碑 对芽胞杆菌分类研究是非常重要的。第一个里程碑就是 . 923 年主持出版了伯杰氏鉴定细菌学手册（ s 他从 1913 年到 1946 年是 学附属纽约农业试验站 （ 菌学部的主任，承担了伯杰氏鉴定细菌学手册的第一版到第 七版的主要编辑工作。第二个里程碑是 究芽胞杆菌属的工作，出版了著名著作 是现代 类学的基础。第三个里程碑是出版 细菌核准名称目录（ et 1980）。 伯杰氏鉴定细菌学手册的不同版本收入的芽胞杆菌属种类不同， 第一版（ 1923） 75种，第二版（ 1925） 75 种，第三版（ 1930） 93 种，第四版（ 1934） 93 种，第五版（ 1939） 146种， 第六版（ 1948）分化出多个芽胞杆菌近缘属，记述芽胞杆菌属 33 种，第七版（ 1957）分化出多个芽胞杆菌近缘属，记述芽胞杆菌属（ 25 种，第八版（ 1974）分化出多个芽胞杆菌近缘属，记述芽胞杆菌属 22 种； 1984间伯杰氏鉴定细菌学手册改名为伯杰氏系统细菌学手册（ s 1986 年伯杰氏系统细菌学手册由美国 版公司出版了第一版伯杰氏系统细菌学手册（ 1984分四卷出版； 1994 年又将伯杰氏系统细菌学手册 1中有关属以上分类单元的分类鉴定资料进行少量的修改补充后汇集成一册，仍用原来书名出版，故称之为伯杰氏鉴定细菌学手册第九版。 2001 年出版了伯杰氏系统细菌学手册第二版，分五卷出版。 1991）首次利用 16S 1株芽胞杆菌分为 5大类群， 许多种芽胞杆菌逐渐从芽胞杆菌属分化出来，另建属。在伯杰氏系统细菌学手册第一版中，将好氧和兼性厌氧的产芽胞细菌都列入了芽胞杆菌属。 刘波 （ 2006）出版著作芽胞杆菌文献研究中，采 用老的分类体系芽胞杆菌近缘属全部归为芽胞杆菌属，列出了芽胞杆菌属 244个种。伯杰氏系统细菌学手册第二版则完全按照 16S 天申等 ， 2007），列述了芽胞杆菌目 22个属的 212种芽胞杆菌（这些种中不包括同物异名）（ et 2004）。至今为止，芽胞杆菌从一个属分化演变出芽胞杆菌 48个近缘属 （ 2011） 。 化学分类方法的产生和发展是细菌分类和鉴定技术的一大进步， 用于化学分类的化学物质很多种，如极性脂（ et 2011） 、呼吸醌（ et 2011）、脂肪酸（ et 2011）等。 et 963 年就指出脂肪酸可用于细菌鉴定， K 1994）证明脂肪酸生物标记具有遗传稳定性，可以作为芽胞杆菌属种类鉴定的有效手段。美国 司依据自 20 世纪 60 年代以来对微生物细胞脂肪酸的研究经验，开发的一套 微生物鉴定系统分析软件（ 根据微生物中特定短链脂肪酸（ 种类和含量进行微生物的鉴定，该软件可以操控 司的 6850 和 6890型气相色谱，通过对气相色谱获得的短链脂肪酸的种类和含量的图谱进行 比对，从而快速准确地对微生物种类进行鉴定。但是，该系统中芽胞杆菌属的种类仅有 50 多种，与目前芽胞杆菌属 171 个模式种的数量差距甚远。不过， 统自带的 块，通过测定芽胞杆菌属模式种菌株株脂肪酸，建立数据库，可以扩展该系统作为芽胞杆菌属种类鉴定的专业应用系统。 刘波 （ 2011）出版的微生物脂肪酸生态学中，以芽胞杆菌为例子， 比较了脂肪酸鉴定与 16S 子鉴定，结果表明， 98%的芽胞杆菌种类用脂肪酸鉴定结果与16S 子鉴定结果相同，可以作为脂肪酸芽胞杆菌种类鉴定可以作为芽胞杆菌快速鉴定的方法之一（ 刘波 ， 2011）。特别在 16S 子鉴定无法区别时，脂肪酸鉴定表现出其独特的优越性（ Li et 2010）。虽然芽胞杆菌脂肪酸种类鉴定有较高的准确性，但是，利用脂肪酸进行芽胞杆菌种类的系统发育研究，分群结果与 16S 统发育结果比较存在着异质性，表明脂肪酸分群存在着特殊的生物学意义（ et 2010； 刘波， 2011）。 et 2008）研究 以色列 进化谷 中的系统发育关系，模拟了进化谷的生态环境，分析结果证明微生物系统发育包含多种脂肪酸成分、基因、和细胞膜变化。张晓霞等（ 2009）利用脂肪酸成分对不动杆菌进行鉴定，研究结果表明脂肪酸鉴定结果和 16S 种水平上利用 16S 因系统发育分析结果与脂肪酸组分分析的结果可互为补充，相互印证。 et 2010）利用脂肪酸 成分可以区分不同培养上的蜡状芽胞杆菌的芽胞，脂肪酸成分是一种有效研究芽胞杆菌营养条件系统发育的手段。 et 2011）研究喂食不同事物下 肪酸的变化，发现脂肪酸是可以作为不同事物来源的菌株有效标记。 邝玉斌等（ 2000）通过气相色谱对 10 种芽胞杆菌模式菌株的细胞脂肪酸组分及其含量进行分析，研究表明脂肪酸组分成为芽胞杆菌化学分类的重要指征。 et 1999）研究发现利用脂肪酸利用区分 大部分种类，利用脂肪酸成 分建立准确的该属细菌自动鉴定系统。 et 2007）研究证明脂肪酸分析可以快速灵敏的鉴定 1970）提出多相分类（ 概念， 即利用微生物的多种信息（传统分类、数值分类、分子分类、化学分类等），包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统发育途径，目前已被广泛应用（ et 1999）。（ 2004）综合利用形态、脂肪酸及 16S 统发育分析将 新划分为 （ et 2004）。多相分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统发育关系（ et 2004）。最近的新种大都是根据多相分类法进行鉴定的。 由于芽胞杆菌遗传背景的多样性和复杂性，至今为止，尽管采用多相分类研究方法，芽胞杆菌属的分类地位仍然处于变化之中。 芽胞杆菌系统发育研究现状与发展动态 。 芽胞杆菌传统分类主 要依据形态学特征，如菌落的培养特征、细胞形状等对未知菌进行分类鉴定。 （ 1973）提出芽胞形态群体概念，将芽胞杆菌分为三个类群（ et 1973）；数值分类学是 20 世纪 50 年代后期随着电子计算机技术的兴起而逐渐发展起来的 （ et 2001） ；数值分类学通常也称为统计分类学 （ et 1973； et 1984） ，伯杰氏鉴定细菌学手册第九版将数值分类学列为细菌分类学方法之首。 （ 1988）对 368 株芽胞杆菌进行数值分类，将这些菌株按 距离值进行了系统发育分群研究 （ et 1988） 。随着分子生物学的发展，芽胞杆菌的分类逐渐由表型分类转化为分子分类 （ et 2009） ，如 G+C 交、 术、 16S 列比对、多位点序列分型等等。 交通常被认为是微生物鉴定的黄金标准 （ et 1972； et 1994）。借助于分子手段，许多新的物种也被发现出来 （ et 2011） ； 2006）从宇宙飞船分离到一种芽胞杆菌，经 16S 列系统发育分析表明与 相近但又有很多表型不同的地方，通过 析表明该菌株应是芽胞杆菌属的一个新种，并将此命名为 （ et 2006） 。 生物信息学是系统发育研究中重要的分析手段， 它通过 列间的差异计算出核苷酸多态性，并由此构 建分子谱系树，推断群体的扩张模式、历史动态，推算群体起源、分歧的大致时间以及群体的进化速率、基因混合程度，甄别物种序列等，并可以给出统计学上的量化结果。它可以从分子水平上探讨群体进化的规律，并可将这些规律以直观、形象的方式表现出来。进化的实质，在一定程度上可以说是群居遗传构成上或基因频率上的变化和累计，通过计算等位基因频率等指标，可以了解其遗传进化关系。在进化分析时，我们通常要选择一个 进化时钟 ，就是在选择序列分析时，要选取不同的物种的同源序列，这样结果才有可比性，这些被选取的序列就成为 进化时钟 。现在 科学家们已经发现了各种各样的进化时钟，例如脂肪酸分析，同工酶分析，核糖体 析，免疫分析等等。小亚基核糖体 其独特优势被较广泛的作为进化时钟。小核糖体亚单位 括 5S 16S 18S 糖体 有以下优点：具有重要且恒定的生理功能；普遍存在于真核生物和原核生物中，而且在系统发育上具有适当的保守性；分子量大小适中，在细胞中含量大 (约占细胞中 90%)；高度保守，中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。不同物种的 因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，它们在种属界等水平上表现出结构与功能的高度保守性，序列的相似性程度可以反映它们的系统发育关系。特别是 16S 于分子大小适中（ 右），既能体现不同种属之间的差异，用能利用测序技术较容易地得到其序列而得到有关系统发育分析的充足信息。故被大多数生物学家所接受。 16同源性分析最适合于属及属以上的远缘关系。 为了更好研究亲缘关系比较近微生物的系统发育关系，许多研究者逐步地采用多位点序列分型（ 进行分析 （ et 2011） 。众所周知，蜡状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌无论是从形态还是通过 交都很难将其区分开来，利用多位点序列分型法解决了这个问题，这个方法可以用来区分亲缘关系极相近的菌株 （ et 2007） 。 自 20世纪 60 年代以来， 交（ 使用 是 细菌分类学家 以确定菌株之间关联，在划定 细菌种类 中， 仍然是最重要的标准。由于对菌株之间的杂交的程度最终是由各自的基因组序列中 保守的 似性 决定的。 et （ 2007）选择了 7 个属的细菌，包括 28 个种， 考 查它们 和 基因组 核心基因 （ 平均 核苷酸一致性 （ 之间的定量关系 ， 结果显示 每对菌株之间 和 关系非常密切 。 当分析限于编码蛋白质的部分基因组时 ， 70 的 当于 85的 et 2007）。许多研究者研究 代 为细菌鉴定的标准， 得出 结论 细菌基因组序列 可以准确取代 ，作为细菌种类鉴定的黄金标准 （ et 2006； et 2010； et 2012； et 2012） 。然而，关于整个芽胞杆菌属种类 研究未见报道。 国内外芽胞杆菌系统分类的理论和实践为本项目的研究提供了理论指导和研究方法。基于基因组学的 系统生物学不仅在芽胞杆菌系统发育等方面具有重要的应用前景，更重要的是它代表了生命科学理论的重大发展，在生物进化的研究方向上就提出了 许多新的发现。如基因平行转移的发现、最小基因组与生命起源的关系、生物体可进化性概念的提出、无尺度网络生物模型的建立、蛋白质网络中与进化有关的各种节点（ 发现等等。这些新的概念和进化模型的提出，都揭示了生物系统在分子相互作用下的演化规律，并在不同程度上对其它层次上的演化具有非常重要的启发意义和应用价值。 本申请 芽胞杆菌属种类全基因组序列相似性及其分子系统发育研究 ， 通过国际合作研究，引进德国菌种保存中心（ 胞杆菌属种类标准菌株， 利用收集到的芽胞杆菌属 160 多种标准菌株，进行全属芽胞杆菌种 类（ 160 种） 的全基因组测序，利用芽胞杆菌全基因组 序列 ，计算 芽胞杆菌属种间的 基因组核心基因（ 的 平均核苷酸一致性 （ 并与芽胞杆菌属种间 交相似性 值进行平行比较 ， 建立 与 交相似性值相关模型， 确定 的种的鉴定界限，作为芽胞杆菌种类 鉴定的黄金标准，替代 交。 利用全基因组序列，初步 分析芽胞杆菌 的生理分化（嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热、嗜金属、好氧、厌氧、耐高压、耐低压等）基因序列特征，利用多位点序列分型 技术 （ 对芽胞杆菌属的生理分化进行分析，建立 芽胞杆菌属 种类与生物学特性紧密相关 的分子系统发育分类体系， 如基于生理分化的芽胞杆菌亚属或群划分， 为 芽胞杆菌属 种类基因 资源 的挖掘提供科学依据， 为我国芽胞杆菌理论研究和实际应用奠定科学基础。 申请者具备较好的研究基础，能够完成本项目的研究目标。 参考文献 1 .， .， . 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