胰岛素受体底物1 rs1801278基因多态性taqman―mgb双荧光探针法的建立与验证

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 胰岛素受体底物 1 rs1801278 基因多 态性 TaqManMGB 双荧光探针法 的建立与验证 摘要 目的 建立一 N 适合临 床常规检测胰岛素受体底物 1（IRS1） rs1801278 基因多态性的实验方法。 方 法 随机收集 2015 年 3 月2016 年 6 月 解放军第三二医院 200 名健康体检者 的外周血标本，设计针对 IRS1 rs1801278 基因多态性位点的特异性引 物和荧光探针，通过 TaqMan-MGB 实 时荧光聚合酶链反应法检测 rs1801278 基因多态性，以基因测序法（金标准） 进行验证，同时初步探讨 IRS1 rs1801278 不同基因型在本研究人群中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 的分布频率。 结果 TaqMan-MGB 双荧 光探针法鉴别 IRS1 rs1801278 的 3 种基 因型，与基因测序法结果一致率为 100%。 IRS1 rs1801278 基因多态性中 T/T、C/T 和 C/C 基因型在本研究人群 中的分布频率分别为 0%、1%和 99%。 结论 根据单核苷酸多态性基因型特异 性探针和引物所建立的 TaqMan-MGB 荧光探针法能快速有效地进行 IRS1 rs1801278 基因多态性分型，结果可靠， 操作易行，然而对中国汉族 2 型糖尿病 患者个体化治疗效果的预测价值有限， 不建议临床常规开展。 中国论文网 /6/view-12954758.htm 关键词 TaqMan-MGB 实时荧光 聚合酶链反应；胰岛素受体底物 1；2 型糖尿病；单核苷酸多态性；基因型 中图分类号 R587.1 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 10（c）-0004-05 Establishment and verification of TaqMan-MGB two-color fluorescent -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 probe method for detecting the gene polymorphisms of insulin receptor substrate 1 rs1801278 ZHAO Yangyang1，2 XU Zhihui2 LIU Yan2 WU Rongrong3 LIU Xinguang1 XU Dongping2 HAN Jin3 1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics Institute of Biochemistry and Molecular Biology， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.Administration Center of Clinical Research， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China； 3.Department of Pharmacy， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China Abstract Objective To establish an experimental method suitable for clinical routine detection of the gene polymorphisms of insulin receptor -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 substrate 1 （IRS1） rs1801278. Methods The peripheral blood samples of 200 healthy controls in 302 Military Hospital of China from March 2015 to June 2016 were collected， the specific primers and fluorescent probe aimed at the polymorphic sites of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278 were designed， and the gene polymorphisms of rs1801278 were detected by the TaqMan-MGB real- time fluorescence polymerase chain reaction and validated by gene sequencing method （golden standard）. The distribution frequencies of different genotypes of IRS1 rs1801278 in this population were discussed as well. Results The TaqMan-MGB two-color fluorescent probe method could identify 3 genotypes of IRS1 rs1801278， achieving 100% consistence with gene sequencing method. The distribution frequencies of T/T， C/T and C/C genotypes of gene polymorphisms -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 of IRS1 rs1801278 in this population were 0%， 1% and 99%， respectively. Conclusion The established TaqMan-MGB fluorescent probe method based on the specific probe and primer of single nucleotide polymorphisms is rapid and effective in identifying the genotypes of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278， the results are reliable， and the operation is easy， but the predictive value for the individualized therapeutic effect of Chinese Han type 2 diabetes patients is limited， which is not recommended for clinical routine practice. Key words TaqMan-MGB real-time fluorescence polymerase chain reaction； Insulin receptor substrate 1； Type 2 diabetes mellitus； Single nucleotide polymorphism； Genotype 胰岛素受体底物 1（IRS1）是胰 岛素受体的酪氨酸激酶底物，是介导胰 岛素信号传导途径的关键蛋白，与导致 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 2 型糖尿病发病的胰岛素抵抗关系密切 1。胰岛素抵抗指胰岛 B 细胞分泌受 到干扰，功能减退而不能产生足量的胰 岛素，表现为早期胰岛素相对不足和后 期胰u 素绝对不足 2。单核苷酸多态 性（single nucleotide polymorphism，SNP）是不同个体基因 组 DNA 序列同一位置上的单个核苷酸 的差别，包括单碱基的转换、颠换以及 单碱基的插入或缺失等。近年来研究发 现，rs1801278（CT）位点基因 SNP 影响胰岛素抵抗过程，参与 2 型糖尿病 的发生发展1-3。本研究旨在以 IRS1rs1801278（CT）作为研究对象， 建立 TaqMan-MGB 双荧光探针法，指 导 2 型糖尿病临床个体化用药。 1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器 全血 DNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，批号 51104） ；T-easy 克隆试剂盒 （Promega 公司，批号 A1360）和 JM109 感受态细胞（Trans 公司，批号 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 CD301-02） ；质粒 DNA 提取纯化试剂 盒（Qiagen 公司，批号 12181） ；PCR 扩增试剂（Takara 公司，批号 RR014A） ；胶回收试剂盒（Qiagen 公司， 批号 28704） ；Probe qPCRSuperMix 试 剂（Trans 公司，批号 AQ401-01） ；其 他生化试剂均为国产分析纯，引物及 MGB 荧光探针由上海生工合成；台式 高速冷冻离心机（Thermo 公司） ；荧光 定量 PCR 反应仪（上海宏石） 。 1.2 研究对象 选取解放军第三二医院检验科 2015 年 3 月2016 年 6 月体检健康者 EDTA 抗凝全血标本 200 例，其中男 59 例，女 141 例，平均年龄 31 岁，血常 规和生化各项指标都在正常范围内。本 研究经医院伦理委员会批准，并获得研 究对象的知情同意，样本于-40保存。 1.3 方法 1.3.1 引物和探针设计与合成 从 GenBank 收录的人基因组序列中查询包 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 含 IRS1 基因的染色体 2 基因组序列 （NG_015830.1） ，利用 Vector NTI 分 析软件对其进行比对分析，选择 IRS1 基因 SNPrs1801278 位点设计双色 6-羧 基荧光素 FAM（6-carboxy-fluorescein） 通道和六氯-6-甲基荧光素（Hexachloro fluorescein）HEX 通道特异性荧光 MGB 探针引物和 PCR 探针，利用 Primer 5.0 软件设计合成对应引物，并由上海生工 生物公司合成。引物/探针名称及序列见 表 1。 1.3.2 基因组 DNA 提取 严格按 照 Qiagen 全血基因组 DNA 提取试剂和 说明书操作（该提取试剂盒说明书显示 脂血和溶血对提取 DNA 几乎没有影响） ， 提取的基因组 DNA 测定浓度和 A260/A280 OD 值都在标准范围内，置 于-20 备用。 1.3.3 标准质粒构建及鉴定 PCR 反应总体积 50 L。反应条件：94 3 min（94 35 s56 35 s72 20 s）35 个循环72 10 min。将扩增片 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 段回收后克隆于 PGEM-T Easy 载体中， 转化到 JM109 大肠埃希菌感受态细胞中。 挑取经菌落 PCR 鉴定为阳性的单菌落， 测序，鉴定序列正确后，通过定点突变 将 IRS1 基因 rs1801278 位点 C/G 突变 为 A/T 获得突变质粒样本，提纯获得野 生型（C/G ）标准质粒和突变型（A/T） 标准质粒。 1.3.4 IRS1 基因 rs1801278 位点 TaqMan-MGB 双荧光探针法的建立与优 化 以制备的野生型（ C/G）和突变型 （A/T）标准质粒为模板，对反应体系 中引物、MGB 荧光探针、 dNTP、Mg2+的浓度以及退火温度进行 筛选，选择灵敏度高、背景信号低、扩 增荧光信号曲线呈典型 S 型的反应条件 作为最适反应条件。反应条件：94 30 s94 5 s65 30 s（采光）40 个 循环。结果判定：根据典型的特异性扩 增曲线判读相应型别，FAM 扩增为野 生型，HEX 扩增为突变型。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 1.3.5 IRS1 基因 rs1801278 位点突 变 TaqMan-MGB 双荧光探针法特异性 检验 将野生型（C/G ）和突变型 （A/T）标准品稀释至相同拷贝数 108 copies/mL6.0210 的 23 次拷贝数/摩尔） （浓度 g/mL）/（MW g/mol）= copies/mL，按不同百分比混合，用 TaqMan-MGB 双荧光探针法检测，获取 按不同百分比混合的质粒扩增曲线。 1.3.6 健康人群样本检测及 DNA 测序验证 200 份样本提取基因组 DNA 后，用确定的 TaqMan-MGB 双荧光探 针法对其进行 IRS1 基因 rs1801278 位点 分型，将 198 份扩增曲线显示为野生型 样本全部测序，同时将应用 TaqMan- MGB 双荧光探针法检测结果为突变杂 合型（C/T）的 2 例外送，要求对目标 序列 SNP 位点进行测序检测，最终两 种方法结果一致，说明采用 TaqMan- MGB 双荧光探针法检测 IRS1 基因 rs1801278 基因多态性结果的正确性。 2 结果 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 2.1 TaqMan-MGB 双荧光探针法 建立及特异性检验结果 野生型质粒由 FAM 荧光探针识 别并发绿光，由通道 1 接收，在图 1 上 由直线表示。突变型质粒由 HEX 荧光 探针识别并发粉红色，由通道 2 接收， 在图 1 上由虚线表示。荧光阈值一般在 0.12 左右，循环阈值（Ct 值）为每个反 应管内的荧光信号值达到荧光阈值时所 经历的循环数。图 1A 为检测 100%野 生型标准质粒扩增曲线，直线在 32 循 环（循环阈值）处超过荧光阈值，高幅 度上升，虚线一直在荧光阈值下。图 1B 为 75%野生型质粒和 25%突变型质 粒混合扩增曲线，直线和虚线均超过荧 光阈值。图 1C 为 50%野生型质粒和 50%突 变型质粒混合扩增曲线，虚线和直线同 幅度上升，均明显超过荧光阈值。图 1D 为 25%野生型标准质粒和 75%突变 型标准质粒混合扩增曲线，直线和虚线 均超过荧光阈值。图 1E 检测 100%突变 型标准质粒扩增曲线，虚线在 25 循环 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 （循环阈值）处超过荧光阈值，高幅度 上升，直线一直在荧光阈值左右。当标 本为纯合突变型（T/T）时，代表 HEX 信号的虚线上升并超过荧光阈值，代表 FAM 信号的直线在荧光阈值之下；当 标本为突变杂合型（C/T）时，代表 HEX 信号的虚线和代表 FAM 信号的直 线均上升并远远高于荧光阈值；当标本 为野生型（C/C ）时，代表 FAM 信号的 直线上升并超过荧光阈值，代表 HEX 信号的虚线在荧光阈值之下。 2.2 TaqMan-MGB 双荧光探针法在健康 人群 IRS1 rs1801278（CT）多态性中 的检验结果 IRS1 rs1801278（CT）SNP 分 型以 C/C 基因型（野生纯合型）为主， 占 99%；C/T 突变杂合型仅检出 2 例， 占 1%；未见 T/T 突变纯合型。见表 2。 2.3 基因测序法对突变杂合型和 野生型 IRS1 rs1801278（CT）SNP 的 验证结果 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 测序结果为反方向测序，原 C/T 结果显示为 G/A，如图 2 所示，2 份用 TaqMan-MGB 双荧光探针法检 y 的突 变杂合型 C/T 测序结果显示为 G/A（图 2A） ，相同方法检测野生纯合型 C/C 测 序结果显示为 G/G（图 2B） ，测序结果 与本方法结果显示一致。 3 讨论 全球糖尿病发病率达到 3.82 亿例， 估计到 2035 年将增加到 5.92 亿。其中 2 型糖尿病最常见，占全世界糖尿病患 者的 90%1。 转染研究表明，IRS1 基因的 rs1801278（CT）位点单核苷酸多态性 可使细胞胰岛素刺激信号下降 32%，同 时通过 PI3 激酶途径，使磷脂酰肌醇激 酶活性下降 36%，IRS1 表达细胞下降 25%，可在正常人和 2 型糖尿病患者人 群中导致胰岛素抵抗2-3。亚洲人数据 显示不同人种正常人群中突变杂合型为 1.1% 31.4%，突变纯合型为 0%0.69% 。 不同人种 2 型糖尿病患者中突变杂合型 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 为 1.2%32.0%，突变纯合型为 0%0.84%4-10。rs1801278（CT） 位点单核苷酸多态性在国外报道有较高 的变异率，对指导 2 型糖尿病和妊娠期 糖尿病用药均有一定价值11-12，但国 内相关研究十分有限，因此开展了此项 研究。 临床上多种检测方法相继建立， 其中基于凝胶电泳的检测方法包括限制 性片段长度多态性法、单链构象多态性 法、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异 性 PCR13-14；基于基因组核酸检测方 法包括 TaqMan 探针法检测、实时荧光 定量 PCR 技术、普通 DNA 测序法、焦 磷酸测序法、高分辨率通解度曲线法、 DNA 芯片检测、飞行质谱仪检测15。 直接测序法是应用最为广泛的经典检测 手段，是目前 SNP 检测的 “金标准”，但 其检测灵敏性较低，所需时间较长。基 于凝胶电泳的方法分辨率较低，操作步 骤繁琐，容易污染，不适合大规模的临 床筛查。基于基因检测的方法灵敏性高， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 但需要昂贵的设备和专业的技术人员 16。 TaqMan-MGB 双荧光探针法是在 TaqMan 法的基础上优化而成的 SNP 检 测方法，使用了 MGB 标记的 TaqMan 双荧光探针，在原 TaqMan 探针荧光淬 灭基团旁连上一个 MGB 分子，该分子 可结合于 DNA 小沟，