[综述]一氧化氮的生理病理作用及其检测方法

一氧化氮的生理病理作用及其检测方法 孙文清 北京市通州区潞河医院 摘 要 一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种由内皮细胞释放的血管活性物质,在生物 体内具有广泛而多样的生物学效应。近年来,人们对其进行了许多广泛而深入的研究,发现 其与多个系统疾病都存在着密切的关系。并阐述了血清NO 的各种测定方法。 关键词 NO;生理功能；疾病；检测 NO作为2 次获得诺贝尔奖的明星分子, 长期以来一直得到科学家的广泛关注。而自从 1992 年NO 被Science杂志评为该年度的“明星分子”以来 1 , 关于NO 文章就层出不 穷, 现今许多国家投入大量的人力物力研究NO 的生理作用。在国外每月约有50 篇关于NO 在各种生理途径中的论文发表, 其所涉及的领域很广, 从药物、生理到生化各个领域, 因 此可以说NO 已成为生命科学界研究的热点之一。 一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种由内皮细胞释放的血管活性物质,可介导血管的舒 张反应,在生物体内具有广泛而多样的生物学效应。体内血管内皮细胞、血小板、中性粒细 胞、巨噬细胞、神经组织在一定刺激下均可产生NO。近年来,人们对NO进行了许多研究,本 文就NO在人体多个系统疾病发病过程中的作用机制进行分析。 1 NO 的合成及代谢 NO 是一种亲脂性的小分子化合物,分子量为30 ,难溶于水,因此NO 在细胞内产生后,可以透 过生物膜自由扩散进入周围的靶细胞,进而执行信号分子的功能。在生物体内左旋精 氨酸(L - Arg) 在NO 合酶(NOS) 作用下与O2结合生成左旋胍氨酸(L - Cit) 及NO。生物体 内许多细胞是通过此途径来合成NO 的,如中枢神经元、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、 血小板、肝细胞及肿瘤细胞等。催化此反应的NOS 有三种同功酶:主要存在于内皮细胞中的 eNOS (endothelial nit ric oxide syn2thase) ,存在于神经细胞中的nNOS (neuronal nit ric oxide syn2thase) ,以及存在于巨噬细胞、胶质细胞中的iNOS (inducible nit ric oxide synthase) 。eNOS 和nNOS 均为构成型酶,统称为cNOS (constitutive nit ric oxide synthase) 。前2 种催化生成的NO 量较少,仅在10 - 12 mol/ L 水平,主要调节细 胞的信息传递;iNOS 催化生成的NO 约在10 - 6 mol/ L 水平,具有细胞毒素或细胞防护功 能 2 。此外,临床上应用的硝基扩血管物质(如硝酸甘油) 进入机体后,也可以通过一系 列生化反应释放NO ,是局部产生NO 的化合物 3 。生成的NO 在生物体液中的半衰期很短,很 快就转变为硝酸盐/ 亚硝酸盐的代谢产物。 NO 在生物体中的作用 近年来的研究表明,NO 作为1 种新型的细胞内信使分子, 广泛参与机体心血管、神经 和免疫系统的生理和病理调节。它能舒张血管、降低血压、抑制血管平滑肌细胞的增值和 血小板粘附, 并作为1 种神经递质, 在神经元的信息传递中起重要作用。 2.1 调节血压 4 调节血压是NO 的1 项重要生化功能。血管内皮细胞含有它们自己的NO S, 生成的NO与 邻近的平滑肌细胞里的鸟苷酸环化酶作用, 使肌肉松弛, 血管扩张, 增加血流量, 从而在 临床心血管系统、消化系统、泌尿系统中发挥重要作用。在生理状况下,NO 对大血管的血 流量、流速, 以及血管阻力起调控作用。NO 也在大脑血液循环调节中起重要作用。NO 还 是1 种内源性抗血栓剂, 能抑制血小板凝集和粘附到血管内皮细胞上。 2.2 作为神经递质 4 NO在中枢神经系统和外周神经系统中都有广泛分布, 具有信息传递功能, 是1 种新的 神经递质。它对许多神经活动有影响, 既可以从轴突前膜向后膜传递信息, 也可以从轴突 后膜向轴突前膜反向扩散来传递信号。大量实验证明,NO 是1 种介导兴奋性氨基酸, 以及 介导其它与cGM P 浓度升高相关因子的调节分子。NO 介导兴奋性氨基酸并引起cGM P 浓度 增加的基本过程是: 从突出前膜释放出来的兴奋性氨基酸结合到突出后膜的NMDA 受体上, 引起后膜的去极化, 造成Ca2+ 内流, 使Ca2+ 结合钙调蛋白, 刺激了NO S, 引起NO 合成。 NO 通过简单扩散, 作用于邻近的突出前或突出后部位的可溶性鸟苷酸环化酶, 从而提高 cGMP 水平, 产生相应的生理效应。目前的研究表明,NO 还在生殖器、肺等器官中都有递质 的功能。 2.3 抗血小板活性 5 当血管受损时, 血液中的血小板会凝结形成塞子凝结在血管壁, 阻止过多的血流, 而 进一步的凝结, 就会使血液凝成血块, 阻止血液流动。如心肌梗塞就是由于粥样硬化的心 血管中血流的不正常凝结形成的。而NO 能抑制血小板进一步凝结和粘结的作用, 从而可以 预防心肌梗塞的发生。 2.4 其他生理功能 5 (1) 免疫调节功能:NO 可通过几种方式起到免疫作用: 一是靠自身毒性直接杀死细菌; 二是可激活巨噬细胞吞噬入侵的有害物质; 三是NO 的配位作用使它可与某些酶中的金属离 子结合导致酶畸变, 病毒细胞无法分裂和生长。 (2) 抗溃疡作用: 通过对胃粘膜保护药肝珀酸钠的药理作用机制的研究发现, 该药的 保护作用与引起粘膜细胞内源性NO 释放, 进而使局部血管扩张, 血流量增加有关。 (3) 调节性功能:NO 调节性功能也与它的扩血管作用有关。若NO 生成出现障碍, 使血 管不能扩张, 就会导致阳痿。此外也有实验证明NO 参与了神经递质对男性射精功能的调控, 由于NO S 的抑制剂阻断男性生殖器合成NO 而抑制射精过程。 3 病理生理作用 NO的病理生理作用参与许多疾病过程, 这一发现使人们从一个全新的视角去看待那些 常见疾病。 3.1 高血压和肾功能 抑制NO产生是一种新型高血压模型建立的基础。某些高血压主要是由于缩血管物质占 优势引起的。NO依赖的高血压是由于内源性扩血管物质缺乏NO所致。目前还不知道究竟是 高血压还是NO的缺乏在先。一方面NO缺乏可触发高血压急症的发生另一方面, 慢性高血压 可使NO 合成酶“ 超负荷” , 最终耗竭L-精氨酸(NO合成的底物)。 有研究发现NO可以调节肾素的分泌。严重的慢性肾功能衰竭时, 体内天然的NO合成酶 抑 制剂N,N -二甲基精氨酸的肾清除率减少, 可能是引起高血压的一种机制。既然高血压可因 NO缺乏引起, 理论上NO合成酶抑制剂可用于治疗低血压。平衡血管及肾脏系统的NO, 可能 在治疗血管疾病中有巨大的潜力, 而不会产生严重的不良反应 6,7 。 3.2 心血管系统疾病 第 3 页 共 5 页 NO是存在于心血管系统中,是重要的生理性调节分子,与心血管系统密切相关的主要是 eNOS和iNOS。动脉粥样硬化(AS)和冠心病(CHD)病变发生过程中,血管内皮细胞受损, eNOS 的表达明显降低 8 ,NO生成释放减少,致血小板活化,并释放血栓素、52羟色胺、腺嘌呤核 苷酸、血小板源性生长因子等引起血管收缩,VSMC增生并向内膜下迁移,白细胞向内膜粘附, 破坏内皮细胞功能,促进AS的发生和发展。正常状态下,由血管内皮细胞分泌释放的血管收 缩因子的内皮素( ET)和内皮依赖性舒血管物质NO在体内保持动态平衡,当二者间动态失衡, ET引起血管强烈收缩,冠状动脉血流量明显下降,主动脉压明显升高;另外在生理条件下释放 的NO使血小板处于较低水平的活化状态,防止其粘附聚集,当内皮细胞功能不良时,NO合成减 少,局部血管收缩,血小板粘附、聚集功能增强,血液粘滞性增高,加重微循环障碍,增加外周 阻力,导致血压升高,促使冠状动脉内血栓形成,血管腔闭塞从而阻断冠脉血流 9 。 3.3 消化道疾病 健康人胃粘膜对刺激的反应是增加局部血流和形成粘膜屏障, 这种保护机制依赖NO起 作用。NO与前列腺素衍生物及其他保护性因素一起可预防胃粘膜溃疡的产生。NO除了局部 作用外, 还参与胃肠道的神经调节。食物进人胃内及幽门, 通过NO作用机制使收缩的胃及 幽门扩张。返流性食管炎可能是由于舒张物质NO占优势引起的。相反, 责门失弛症, 可能 是NO缺乏, 有文献报道, 有机硝酸酷药物可成功治疗这种疾病。 3.4 肺功能 NO调节肺血管张力。吸人NO气体可能降低肺动脉血压。实验表明, NO可缓解支气管痉 挛, 而无明显耐药性。用NO气体治疗成人呼吸窘迫综合征(ARDS)目前取得可喜的效果。 3.5 其它方面 体内其他与NO有关的作用: 动物实验表明抑制NO合成酶增加可的松和或雄激素水平。 子宫收缩及舒张通过NO途径调控, 因此NO调节物质在妇产科有一定地位。 4 血清NO 的测定方法 根据NO 在生物体内的合成及代谢特点,文献常以其代谢产物间接反应NO 的浓度。目前 文献报道的测定血清NO 应用的方法有: 硝酸盐还原酶法、镀铜镉振荡还原法、改良的 Griess 法、催化光度法、示波极谱法、分光光度法、化学发光法。 下面就每种测定方法做一介绍。 4.1 硝酸盐还原酶法 董燕等 10 利用NO 在体内被氧化成NO 2- 和NO 3- ,可用硝酸盐还原酶(NR) 将NO 3- 还原 成NO 2- ,再用Griess 试剂与NO 2- 反应生成有色偶氮产物的原理来测定NO。在反应中,用葡萄 糖- 6 - 磷酸脱氢酶( GD) 使NADP + 还原生成NADPH ,这样,NADPH 被循环使用,反应体系 中的NADPH 就保持在较低浓度,从而避免了高浓度的NADPH 对NO 2- 重氮反应的干扰。 利用测定液生成的有色偶氮产物在540560 nm 处最大吸收,测定其吸光度值。该方法 的线性回归方程为: Y =120. 8 X - 2. 2 , r = 0. 997 5 ;平均回收率为93. 8 %;测得健 康人血清NO 的正常参考值范围为:5. 748. 7mol/ L 。 4.2 镀铜镉振荡还原法 郑晖等 11 用Zn (OH) 2 将血清中的蛋白沉淀,利用镀铜镉颗粒将去蛋白血清中的NO 3- 还原成NO 2- , ,再用Griess 试剂与NO 2-反应生成有色偶氮产物的原理来测定NO(NO 2- / NO3-)。 该法测定NO(NO 2- / NO3-) 的线性回归方程为: Y = 0. 012 2 + 0. 012 2 X , r = 0. 999 , P 0. 01 ;平均回收率为94. 2 %;按两倍试剂吸光度对应NO 2- 浓度计算,检测下限为1. 1 mol/ L ;测得健康人血清NO(NO 2- / NO3-)的正常参考值范围为:38 14. 2mol/ L 。 4.3 改良的Griess 法 李恩民等 12 通过锌粉还原反应使血清中的NO 3- 还原成NO 2- ,正丁醇萃取去除血清中 的干扰物质,然后进行Griess 显色反应,最终把显色物萃取到正丁醇相中进行比色测定。该 法测定NO 的线性回归方程为: Y = - 8. 10 10- 4 + 6. 14 10- 4 X , r = 0. 999 5 , P 0. 001 ;检测下限浓度为3. 04 mol/ L ,平均回收率为98. 5 %; 测得健康人血清 NO(NO2- / NO3-)的正常参考值范围为:30. 60 16. 16mol/ L 。 4.4 催化光度法 李桂兰等 13 先用镀铜镉颗粒将血清中NO 3- 还原成NO 2- ,再根据NO 2- 对溴酸钾氧化 还原型罗丹明B 生色有强烈催化作用,进行NO 2- 的催化光度法测定。这一类催化体系检出限 最低可达10 - 12 g/ mL 14 。该方法的平均回收率为104. 1 % ,测得的健康人血清 NO(NO2- / NO3-)的参考值范围为:54. 2 16. 9mol/ L 。 4.5 示波极谱法 孙成均等 15 选择示波极谱法利用二阶导数极谱仪在盐酸- 磺胺- 盐酸萘乙二胺- 氨 水体系中测定血清中的NO 2- ,以测定NO 2- 量间接推算NO 的量。此方法原理为:血清中的 NO2- 在稀盐酸介质中与磺胺和盐酸萘乙二胺反应生成偶氮化合物,在氨碱性介质中生成的 偶氮化合物可产生灵敏的极谱波,波高与NO 2- 含量在一定范围内成正比关系,并利用峰高计 算血清中的NO 2- ,该方法血清中的NO 2- 的计算式为:血清中NO 2- 含量(mol/ L) = hx/ b 1/ (0. 10 46) 式中hx 为样品峰高,b 为工作曲线斜率,0. 10 为取样品量(mL) ,46 为NO 2- 摩尔质量 ;本法检出限为0. 56 g/ L ,相应血清浓度为0. 61 mol/ L ,该方法平均 加标回收率为100. 6 %;测得健康人血清NO(NO 2- ) 的正常参考值范围为:0. 85 0. 22mol/ L 。 4.6 分光光度法 李恩民等 16 利用自制的氢氧化铝Al(OH) 3 凝胶清除血清中的有色成分,得到无色透 明的血清脱色液。利用醋酸钠、对氨基苯磺酸及- 萘胺溶液使标准管中NO 2- 标准使用液 和样品管中血清脱色液分别显色,利用分光光度法检测血清脱色液中的NO 2- 。本方法的检测 下限是0. 043mol/ mL ,回收率是93. 5 % ,正常人血清NO 含量是0. 323 0. 022mol/ mL 。 4.7 化学发光法 邓学良等 17 建立了Luminol - I - - NO2- 化学发光系统间接测定血清中NO 2- ,此方 法的回归方程为 Y = 7. 62 X - 0. 22 , r = 0. 991 2 , 测定NO 2- 的线性范围为(0. 018300) g/ L , 检出限为0. 026 g/ L 。这种方法与文献 18 中介绍的化学发光 法(鲁米诺法) 不同。鲁米诺法的原理是NO 可被H 2O2强烈的氧化生成ONOO -,而ONOO -可使鲁 米诺氧化并在溶液中发出很强的光。因为只有NO 可以激发这一光化学反应,而NO 2- 和NO 3- 则不能,所以该方法是可对溶液中的NO 进行实时测定且检测灵敏度最高的方法,其检出限可 达10 -13 mol/ L ,是直接测定NO 的方法。 5 小结 综上所述,NO是一种重要的病理生理因子,在人体多种系统疾病中发挥着作用。只有充 分认识到其治病机制才能为疾病的治疗提供正确的理论基础。目前在NO研究中仍有许多问 题需要解决,如:如何寻找一种选择性抑制i2NOS的物质,使体内NO产生适量并发挥生理作用。 阐明NO与疾病发病过程中炎细胞介质和细胞因子之间的关系,确定NO在发病机制中的地位。 相信随着对NO研究的不断进展,这些问题会逐步得到解决,从而为许多疾病的研究和预防治 疗提供新的思路。 第 5 页 共 5 页 1 Ko sh land D E. 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