专业发展动态作业

红豆杉中紫杉醇的研究进展 段莉萍 08 生物科学一班 20085889 【摘要】：紫杉醇是存在于红豆杉树中的一种化学物质，其独特的 抗癌疗效日益被人们重视，被誉为20世纪90年代国际上的抗癌药三 大成就之一。紫杉醇的新的生产技术介绍，以及生态环境对紫杉醇 的影响，对紫杉醇未来的展望。 【关键字】：红豆杉；紫杉醇；抗癌；生产；展望； 一.红豆杉和紫杉醇简介 止于 G2M 期，最后导致肿瘤细胞凋亡【4】。1992 年 12 月 29 日，美国食品药品管理局(F 红豆杉为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属 (Taxus)植物，是一类珍贵的木本裸子植物。该属植物在全世界大约 有 11 个种及一些变种、杂交种和栽培种。我国有 4 个种和 1 个变种， 即中国红豆杉(Taxus chinensis)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis)、 西藏红豆杉(Taxus waIlichinana)、东北红豆杉(Taxus cuspidata) 和南方红豆杉(Taxuschinensfs varmairei) 【1】各个种分布于我 国的西藏、云南、贵州、四川、广东、湖南、湖北、江西、福建、 浙江、安徽、河南、山西、陕西、吉林、甘肃等地【2】。 紫杉醇(Paclitaxel，商品名为 Tax01)分子式为 C47H5lNOl4，是 1963 年美国化学家 Wall 和 w 疵等首先从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出来的具有独特抗癌活性的二萜类化合物， 命名为紫杉醇【3】，并于 1971 年利用 X 射线确定了它的结构。直至 1J1979 年 SchiffPB 等才发现了紫杉醇的独特作用机理。即它可 以直接作用于细胞微管，并与微管结合，使细胞微管稳定，并阻止 其解聚，从而抑制纺锤丝和纺锤体的形成，使肿瘤细胞有丝分裂停 DA)正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物【5】。随着对 紫杉醇研究的不断深入，紫杉醇很快被批准用于治疗其它癌症。目 前，众多临床试验己证明紫杉醇在治疗妇科癌症(如转移性乳腺癌、 晚期卵巢癌、子宫颈癌等)、呼吸道消化道癌症(如小细胞肺癌、胃 肠癌、食管癌等)、恶性肿瘤(如头颈部肿瘤、恶性黑色肿瘤、淋巴 肉瘤、恶性滋养细胞肿瘤等)，身免疫系统疾病(如类风湿性关节炎、 疟疾等)以及中风、早老性痴呆和先天性多囊肾病等中具有目前其它 任何抗癌药物难以达到的疗效【6】。因此，紫杉醇成了癌症治疗中 又一重要的抗肿瘤新药，在国际市场售价高达每公斤 22 万美元。 目前供临床使用的紫杉醇主要从红豆杉树皮中提取。然而，红豆 杉在世界范围内的数量很少，而且生长缓慢，通常直径为20 cm的大 树需生长100年【7】。并且紫杉醇的含量极低，大约从56棵100年 生大树中才能提取到1 g紫杉醇，可用于一个癌症患者的治疗【8】。 当前，癌症正愈来愈严重地威肋着人类的生命。据报道，在美国每 年约有3万名妇女被确诊为卵巢癌，死于此病的人数达12万人，每 年死于晚期乳腺癌的妇女达45万人，每年死于肺癌的达10万人。 在加拿大，每年有15万人患乳腺癌，每年死于此病的人数达5200 人【9】，每年紫杉醇的需要量为上千公斤。由于早期开发的不规范 性，仅80年代中初期， 红豆杉自然资源毁灭近23t【8】。伐树生 产紫杉醇的方法使红豆杉这一珍稀植物濒临灭绝的边缘。为保护植 物资源，我国在1991年林业部公布的珍稀保护树木中，南方红豆杉 被列为一级保护树种【10】.各国也把对红豆杉的采伐做了严格规定。 这更加大了紫杉醇供需之间的尖锐矛盾，使紫杉醇的价格不断上升。 二.紫杉醇抗癌机制 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。近年来从本属植物的茎 皮中得到紫杉醇(商品名tax01)具有明显的抗肿瘤作用，引起了全世 界医药界的广泛关注。作为一种从红豆杉TaXUSchinemsis(pliger) Rehd)树的树皮中分离得到的双萜类天然产物，紫杉醇及紫杉烷类化 合物不仅可治疗常规化疗无效的卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌， 而且对食管癌、头颈癌等其他一些恶性肿瘤也有一定疗效。裂过程 中纺锤体的形成密切相关。微管主要成分是微管蛋白，分为Ot微管 蛋白和13微管蛋白两种。a微管蛋白和13微管蛋白彼此间具有很强的 亲和力，故常以二聚体的形式存在，是构成微管的亚单位。在适宜 的条件下，只要二聚体达到一定的浓度，就可以自我组装成微管。 细胞中的微管装配所需要的微管蛋白来自细胞质中的微管蛋白库， 而原有的微管解聚又是细胞质微管蛋白库中的微管蛋白二聚体的重 要来源，可随时被用来装配纺锤体等微管。紫杉醇是一种高效细胞 毒素，与已上市的其他化学合成抗肿瘤剂或植物抗癌药相比，具有 独特的抗癌机理。紫杉醇能结合到肿瘤细胞的微管的特定部位上， 防止细胞中原有的微管解聚，使微管稳定，细胞内积累大量的微管。 这样，肿瘤细胞微管蛋白库中的微管蛋白二聚体含量达不到一定浓 度，肿瘤细胞在有丝分裂时就不能由微管蛋白迅速重新装配形成纺 锤体微管，抑制了细胞分裂和增殖，使癌细胞停止在G2和M期，直到 死亡，从而阻止癌细胞的生长，进而起到抗癌的作用。 三.紫杉醇生产 近年来，国内外在红豆杉人工栽培、紫杉醇化学半合成、红豆杉细 胞培养、产紫杉醇内生真菌培养、代谢工程方面的研究取得了很大 进展，使紫杉醇的供需矛盾得到了一定程度的缓解，但远未真正、 彻底解决红豆杉资源的供应与紫杉醇需求之间的矛盾。要解决这个 矛盾，需要全社会的共同努力，需要有多条技术途径，需要对人工 栽培、紫杉醇化学半合成、红豆杉细胞培养、产紫杉醇内生真菌培 养、代谢工程方面的关键技术继续进行深入的研究，并力争在规模 和生产成本方面取得突破。随着红豆杉和产紫杉醇内生真菌基因组 学研究工作的开展，红豆杉和有关内生真菌产紫杉醇的秘密及其调 控机制将会逐渐被揭开，有目地的培育红豆杉高产细胞系、优良个 体和优良真菌株系将成为可能。到那时红豆杉资源利用与保护的矛 盾将很可能不再是人们关注的焦点。 3.1发酵生产紫杉醇 美国俄勒冈州波特兰大学的化学家安杰拉霍夫曼和她的同事最早 发现生长在榛树上的真菌也可合成紫杉醇。1991年，美国蒙大拿州 立大学植物病理学家Gary Strobel和化学家安德里亚斯带尔勒检 验了从20多个样点的25棵大树上分离出的200多个微生物，结果有一 种真具有合成紫杉醇的能力。把该菌放在合成培养基中培养，发现 该菌合成紫杉醇能力十分稳定，经鉴定是一个新物种，他们把该菌 命名为安德列亚菌。目前该菌合成紫杉醇的能力只有2450ngL， 科学家正努力优化其发酵条件，并通过诱变和基因工程技术全面提 高其紫杉醇生产能力。尽管其产率很低，但由于真菌的基因操作比 植物容易得多，因而有可能通过传统的方法和基因工程的方法来增 加紫杉醇在真菌中的产量。另据报道，我国西安一枝刘制药公司的 研究人员从中国红豆杉树皮中分离出一种真菌，对其重组诱变，通 过菌种优化培养，紫杉醇和Baccatin在培养液中的浓度均达到 210。gL，有望实现产业化6 3.2细胞工程培养紫杉醇 近年来美国百时美施贵宝公司进一步研发出利用最新植物细胞工程 培养生产紫杉醇技术：培养特定的紫杉细胞愈伤组织，直接萃取其 中的紫杉醇，经纯化与结晶分离而成。它的优点是植物细胞可以大 量培养。在工厂里用大的培养罐培养红豆杉树细胞，工业化规模生 产紫杉醇，这种生产方式不受气候、温度、地理条件的限制，解决 了药物来源问题。据估计，在我国红豆杉仅有1(90万株左右，而如 果用直接提取紫杉醇的方法，治疗一个病人需要6棵百年树龄的红豆 杉。由于全世界的红豆杉资源非常有限，植物细胞工程培养法，具 有非常重要的现实意义不但解决了紫杉醇来源问题，而且能大大降 低紫杉醇的生产成本，泽惠广大低收人癌症患者。但到目前为止， 国内外红豆杉培养细胞中紫杉醇产量通常都不高，即使是偶尔报道 获得较高的产量也都存在产量不稳定的问题。究其原因，主要是由 于人们对紫杉醇生物合成的部位、途径及其调控机制还不甚清楚， 特别是对紫杉醇生物合成途径中的关键步骤及其调控机制了解不多 所致。此外，利用基因工程提高细胞中紫杉醇含量也是一条诱人的 途径，但是同样是由于紫杉醇生物合成的具体途径不甚清楚，加之 紫杉醇的合成可能需要多个基因(或一组基因)参与，所以还有待于 进一步研究。 3.3一种适合红豆杉资源的紫杉醇生产新方法紫杉烷木糖苷的生 物转化 紫杉醇是目前临床上用于治疗卵巢癌、乳腺癌及非小细胞肺癌等 恶性肿瘤的“一线”药物，需求量巨大。现有的紫杉醇规模化生产 工艺主要是直接提取法和半合成法，主要利用植物中的紫杉醇或10 去乙酰巴卡亭III。尽管我国已大面积种植的红豆杉，但是我国品种 (云南、南方红豆杉)与国外主要种植品系完全不同，其(枝叶)中的 上述两种物质含量(特别是紫杉醇)极低。此外，半合成法由于受国 外大公司专利保护。非法使用必然引发知识产权争端。因此，资源 与生产工艺相互不匹配、资源和技术合法性等多原因制约了我国紫 杉醇产业的健康发展。 我们在经过大量调查和研究发现，云南和南方红豆杉中7木 糖10一去乙酰紫杉醇(10一DAXT)含量极高，可达到植物干重的1 以上。为能够将10一DAXT转化为紫杉醇，我们筛选了大量的木糖水 解酶和具有相关活性的微生物，获得一株高产外分泌水解活性的菌 株，该工艺使10一DAXT顺利转变成lO去乙酰紫杉醇(10DAT)，后者 经乙酰化顺利转变成紫杉醇。整个工艺共申请了12项专利，具有完 整的知识产权，彻底解决资源紧缺的问题，形成我国自主的知识产 权，使我国的资源优势得到最大限度的释放。 四.生态环境对紫杉醇的影响 4.1多样性和居群分化程度 吴丽圆和陈少瑜(2001a)用同工酶研究过金沙江流域的4个云南红豆 杉天然群体的遗传变异，物种水平上遗传多样性水平比较高，4个小 群体间遗传分化很小(q=0071)。本研究用AFLP方法对云南省的西 北部、西部、南部和中部的7个居群(包括来自禄丰的一个栽培居群) 进行测定，物种水平上遗传多样性水平比较高，居群间遗传分化很 显著(q=05545)。综合两者结果，我们认为云南红豆杉天然群体的 遗传多样性水平比较高，在小群体范围内居群间遗传分化小，变异 成分主要出现在居群内，大范围内居群间分化显著，变异成分主要 出现在居群之间。在采集中发现部分地区的云南红豆杉遭到严重的 人为破坏，有的居群云南红豆杉植株呈零星分布状态，种群密度较 小。如此高水平的遗传多样性可能与云南红豆杉有比较丰富的遗传 基础有关，人为破坏还没有影响到丰富的遗传基础。云南红豆杉为 风媒传粉植物，分雌雄同株和雌雄异株，本研究中发现居群之间基 因交流水平低(N。=O4018)。这可能由于花粉的传播距离有限，居 群间存在地理隔离，花期风力可能达不到所需的强度，影响了正常 的传粉，最终导致了居群间的基因交流受限(Tauber，1967；Levin andKerster1974；矾eeler等，1995；Xing，2000)，使居群间产 生一定程度的遗传分化。如此丰富的遗传多样性和遗传变异是植物 适应外界环境变化的物质基础，也给选育优良的种质资源提供了丰 富的遗传背景和研究材料。 4.2紫杉醇含量 苏建荣等(2006)曾测定过藏东南云南红豆杉树皮、三年生小枝和当 年生叶的紫杉醇，平均含量分别是00058、O0075和 00049；王达明等(2004)测定的云南红豆杉小枝叶中紫杉醇的平 均含量为0102。本实验测定的当年生小枝叶中紫杉醇平均含量 为00132，略高于上述结果，这可能与材料来源、取材时间不同 (Cameron等，2008)及分析误差有关。各居群间和居群内个体紫杉醇 含量差异很大，其中腾冲、禄丰和潞西居群导致居群间紫杉醇含量 差异达到显著水平。紫杉醇是红豆杉属植物中重要的药用成分，与 遗传因素、环境密切相关，多数研究者认为次生代谢物质的差异主 要是受不同地理环境影响而产生。苏建荣等(2006)认为“温度因子” 、“营养因子”和“光照因子”对云南红豆杉紫杉醇含量的影响很 大。本研究中禄丰栽培居群的紫杉醇平均含量00225，无论和其 它居群之间或是居群个体之间含量都差异较大。可能在人工栽培管 理的过程中，一定程度地改变了群体生长的营养条件，同时对个体 产生特定的刺激，从而引起植物群体和个体的次生代谢物含量上的 差异。结果也表明人工栽培的云南红豆杉中紫杉醇的含量不比天然 群体低，可能人工栽培过程中利于其生长因子促进了紫杉醇的形成， 要确定具体的因素还要作进一步的跟踪分析。 4. 3变异与紫杉醇含量的关系 吴丽圆等(200lb)采用同工酶技术研究过不同基因型个体与紫杉醇含 量之间的关系，发现个体的紫杉醇含量与单一酶基因座并无直接关 系，与多个酶基因座的综合效应有一定关联。本研究发现遗传变异 大的居群在紫杉醇含量差异方面比较显著，遗传变异小的情况下紫 杉醇含量差异性也比较小，如禄丰、腾冲和潞西三个居群在遗传变 异上与其它大部分居群都有极显著的差异，而在紫杉醇含量方面也 与其它居群有显著差异。在居群水平上，遗传变异某种程度上反映 出紫杉醇含量的差异，但在个体水平上明显无直接关系。禄丰和腾 冲两个居群的谱带式样一致并且比较特殊，但在紫杉醇含量方面却 截然不同，这可能受环境的影响。同时在紫杉醇含量高的居群和低 含量的居群内部没有发现独特的特征谱带，通过扩大引物筛选范围 或许能找到相关的特征带，在植株生长的一定时期用作直观辨识。 影响红豆杉紫杉醇含量的因素较多，包括植株的年龄、器官、种 和变种，还包括采摘季节、生长环境等。虽然不同醣研究结果存在 一定差异，但都基本反映了红豆杉中紫杉醇含量静一般趣律。从树 龄看，紫杉醇含量随着植株年龄的增长而增加，而不同部位含量并 未随年龄增长呈现规律性变化。同一植株不同部位之间紫杉醇含量 同样存在差异，一般认为树皮树叶木质部。国内不同种红豆杉紫 衫醇含量存在一定差异，冒翁研究结果表鹱，云南红豆杉紫杉醇含 量最高，南方红豆杉次之，东北红豆杉最低。采摘季节也影响了紫 杉醇含量，植株非生长季的紫杉醇含量一般会高于生长季。如何保 障充足的紫杉醇原料是大量生产紫杉醇及其产品面临的关键问题， 虽然已开发出多种生产紫杉醇的途径，包括化学全合成、化学半合 成、生物合成、糕因工程、细胞组织培养等，但都难以实现产业化。 相对而言，人工：种植红豆杉是最现实、最快捷和成本最低的一种 生产紫杉醇的方法，目前国内已有多家红豆杉的人工种植基地。细 胞培养研究显示【11】。30l，某些稀土元素如Yb、La、Tb、ce等均会 促进紫杉醇合成，从而达到提高紫杉醇含量的目的，但目前这些方 法尚未在人工种植红豆杉中实现，这也将成为开展提高红豆杉紫杉 醇含量研究的一个重要方向。 紫杉醇是一种重要的次生代谢产物，是具有五甲基十五碳烯骨 架的二萜类化合物。紫杉醇在植株体内的生物合成不仅受遗传控制 【12】，而且与所处生境条件和育林措施有关【1 3-14】南方红豆杉药 用林不仅要求生物收获量大，同时要求紫杉醇及其前体含量高，这 就必须采取科学的栽培和采收措施。对人工栽培的不同年龄南方红 豆杉幼树及其不同器官和组织的紫杉醇含量检测结果表明，2年生幼 树的紫杉醇含量明显高于34年生幼树，这是由于2年生幼树枝条和 根部所占的比例较高，而枝条和根部的紫杉醇含量又显著地高于叶 片和树干木质部等器官的缘故。2年生幼树生物收获量也很高，单株 鲜生物量达509 g，若采用30 cnl30 em的栽植密度，每公顷定植 61 050株，可产鲜生物量31 000 kgL4J。经过几年的反复实验，作 者认为农田设施栽培的南方红豆杉药用林2年生即达到了工艺、数量 和经济成熟年龄，为最佳的采收年龄。南方红豆杉幼树枝叶的紫杉 醇含量在不同生长季节变化较大，以气候条件适宜的5月及秋冬季的 1月与9一12月时的枝叶紫杉醇含量较高，而在气温高、光照辐射强 的7q月幼树枝叶紫杉醇含量低。因截干是南方红豆杉药用林的主要 采收方式，ll12月及次年的1月时进行截干采收不仅紫杉醇含量较 高，而且有利于促萌经营。栽植地的海拔高度对幼树枝叶的紫杉醇 含量影响显著，主要是与不同海拔地气温等气候条件有关，在较高 海拔地营建药用林基地，因夏季平均气温低、昼夜温差大、紫外线 辐射弱而有利于南方红豆杉幼林紫杉醇的合成，因此应尽可能地选 择较高海拔地营建南方红豆杉药用林基地。为实现南方红豆杉短周 期药用林的高产高效经营，施肥是一个重要的生产环节【15】过试验 发现，施用复合肥虽能显著促进南方红豆杉幼林的生长，但却明显 地降低其紫杉醇含量，同时还不利于土壤肥力的长期维持，而使用 有机肥不仅可促进南方红豆杉幼林的生长和生物量积累，同时不影 响紫杉醇的合成，因此在生产上提倡施用有机肥为主，施用复合肥 为辅。为提高南方红豆杉药用林的紫杉醇含量，下一步还应加强紫 杉醇在植株体内富积规律以及如何利用诱导和代谢调控措施增加紫 杉醇积累等研究，进而通过增施诱导剂和代谢调控剂以提高植株的 药用成分含量与产量。 五.紫杉醇研究展望 紫杉醇为90年代国际上抗肿瘤药三大成就之一紫杉醇乍为一种新型 广谱抗肿瘤药物已广泛用于临床，特别是在晚目卵巢癌、乳腺癌、 非小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗中具有明效【16】药无论是在一线治 疗还是二线治疗，单用或与毒他抗癌药联合应用都得到临床实践证 明。同时作为腹化疗用药比静脉化疗的毒副作用小，局部抗肿瘤作 用增加，但由于紫杉醇单用或联合用于腹腔化疗的临床研究尚不邑， 仍有待于进一步研究。不过通过近几年的临床研究结果，笔者相信， 紫杉醇作为腹腔化疗用药在提高患者生存率和改善生活质量方面将 会有很好的前景。目前，紫杉醇仍主要来自于植物提取，但红豆杉 为国家一级保护植物野生的红豆杉是不允许砍伐的。因此必须大力 加强红豆杉的人工栽培，才能缓解药源的紧张形势。与此同时，相 关部门也应该加大对红豆杉资源的保护力度。再者，对紫杉醇的基 础研究还有待加强，如细胞培养人工合成等，随着科学的发展及各 学科的交叉配合，相信对紫杉醇的研究会越来越深入，治疗方案会 不断得到优化，众多患者将摆脱癌症之痛苦。 参考文献 【1】张志军珍稀药用植物一红豆杉J中国西部科技2004，6(1)：6869 【2】郑万钧，傅立国中国植物志【M】北京：科学出版社，1978：212217 【3】ward。C,aylor H L，Wall ME et a1Plant antitumor agents：ne isolation and structure oftaxol。a nord antilekekemie and anrtitumor agent from Taxus brerifaliaJAm them Soc，1971，93：23252327。 【