《环境微生物学》和《大气污染控制工程》实验教案

三、 环境微生物学和大气污染控制工程部分 实验一 水中细菌总数的测定 一、目的要求 l学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理 本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多， 它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条 件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出 来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉 膏蛋白胨琼脂培养基。 三、器材 l培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。 2.仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭 菌吸管，灭菌试管等。 3.玻璃器皿的洗涤和灭菌 3.1 玻璃器皿的洗涤 新购置的玻璃器皿，因含游离碱，应先在此 2%盐酸中浸泡数小时，用自 来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗 1-2 次并沥干。 培养细菌的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用热肥 皂水或洗涤剂洗刷残渍，再用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗 1-2 次，沥干。 洗涤剂吸管量，可先置 3%来苏液内浸 30min 或高压政策蒸汽灭菌，再用 洗涤剂洗涤，用清水及蒸馏水冲洗干净。 洗涤染色瓶时，可在 5%漂白粉中浸泡 24h 后，再用常规方法洗涤干净。 含油脂的玻璃器皿，应单独高压灭菌洗涤，趁热倒出污物，置 100干 燥箱内烘 0.5h，再放入 5%碳酸氢钠水中煮沸，先去脂再行常规洗涤。 3.2 玻璃器皿的灭菌 2 （1）高压蒸汽灭菌 这是应用研究最广泛的灭菌方法，灭菌是用高压蒸汽灭菌锅进行。手提式 高压蒸汽灭菌器，使用方便，其操作方法主注意事项如下： 打开锅盖或从加入口处向锅内加入适量的水。 加水后，将待灭菌器皿放入锅内，不要塞得过紧，以使锅内温度均匀， 再将锅盖盖好，拧紧螺旋，使其密封。 打开放气阀，打开热源加热至水沸腾，让锅内冷空气充分逸出。否则锅 内温度达不到压力表所指示的对应温度，灭菌不彻底。当冷空气由排气孔排尽 后，再关紧放气活塞。等锅内蒸汽压上升至所需压力时，控制热源，维持所需 时间，一般为 0.10343MPa(121)表压，保持 20min。 灭菌完毕，关闭热源，必须待压力自然降至“0”时，方可启盖取出灭菌 物品，否则易发生危险。 （2）干热灭菌 实验室中常用的还有热空气灭菌的方法，即将洗干净的待灭菌器皿均匀放 入恒温干燥箱内，便不得与内层底板直接接触。关闭箱门，开户电源开关，用 恒温调节器，使温度上升至 160-170，维持 2h，即可达到灭菌目的。灭菌完 毕后，需关闭电源开关，待温度降至 50以下时，方可开门取物，否则玻璃器 皿可因骤冷而爆裂。 4.培养基的制备 配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、调节 Ph、澄清过滤、分 装、灭菌、鉴定等步骤。 调配：按培养基配方准确称取各成分，用少量水溶解。对于肉膏之类粘、 胶状物，可盛在小烧杯或表面皿中称量，然后加水移入培养基中。此外，也可 放在称量纸上称量后直接放入水中，这时如稍微加热，肉膏便会与称量纸分离， 然后立即取出纸片。蛋白胨等极易吸潮物质，在称取时动作要迅速。此外，维 生素、氨基酸、无机盐等微量成分，可预先配制高深度的贮备液，在配制培养 基过程中再按配方比例取一定量加入培养液中即可。 3 融化：将各成分混匀于水中，最好以流通蒸汽融化 0.5h，如在电炉上融 化应随时搅拌，如有琼脂成分时，应注意防止外溢。融化后，应注意补充失去 的水分，补足至原体积。 制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热融化， 但不可用锅或铁锅，以免金属离子进入培养基中影响细菌生长。 调节 pH 值：一般细菌用的培养 pH 调整在 6.8-7.2 之间，但也有需要酸 性或碱性的培养基。培养基高压灭菌后，pH 值约降低 0.1-0.2，故调节时应比 实际需要的 pH 值高 0.1-0.2。但有时也可降低 0.4，因所使用的灭菌器不同而 不同。调节 pH 值，用盐酸和氢氧化钠，因为在相同 pH 值下，有机酸比无机更 易抑制微生物生长，因此，除非特殊情况，最好不要用乙酸等有机酸来调节 pH 值。一般用精密 pH 试纸调节（精确到 0.1pH 单位），必要时也可酸度计。调节 时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。 过滤澄清：培养基配成后，一般都有沉渣或混浊，需过滤，使其清晰透 明方可使用。液态培养基常用滤纸过滤；固态培养基如琼脂培养基，加热后需 趁热用脱脂棉或多层纱布过滤。 分装：将调节 pH 值后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免 琼脂冷凝。分装量不宜超过容器的 2/3，以免灭菌时外溢。分装时应注意勿使 培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌。 基础培养基一般常分装于三角瓶内，分装的量应根据使用目的和要求决定， 但必须定量分装，以便灭菌后使用。 琼脂斜面分装量为试管容量的 1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长度 约为试管长度的 2/3。 半固体培养基分装量约占试管长度的 1/3，灭菌后趁热直立，待冷却凝固。 高层琼脂分装量约为试管长度的 1/3，灭菌后直立凝固待用。 琼脂平板是将灭菌后的培养基，冷却至 50左右，在无菌条件下倾入灭菌 平皿内。内径 9cm 的平皿倾注培养基约 15ml 左右，使培养基平铺于皿底部， 凝固后即成。倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落 入。 4 新制成的培养平板，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒 扣置于 37培养箱内约 30min，待平板干燥后使用。 灭菌：加热配制培养基后，在 2h 内进行了灭菌处理。不要把未灭菌的培 养基冷藏或存放。绝大多数培养基都应放在高压灭菌器内于 121灭菌，并应 在达到这一温度后持续 15min。糖类液态培养基或含有其他特殊成分的培养基， 高压蒸汽灭菌会使其分解，一用滤膜过滤灭菌。或者将不耐热物质用其他方法 灭菌（如流通蒸汽灭菌）后，再加入已灭菌的培养基中。 保存：配制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤配制为宜。每批应注 明制作日期。已灭菌的培养基可在 4-10存放 1 个月。存放时应避免阳光直 射，并且要避免杂菌浸入和液体蒸发。 当发酵管中的液体培养基存放在冰箱或者适中的低温时，可能有空气溶解 进去，以致在 37培养时，会在管内形成空气泡。因此，凡存放在低温的发 酵管，使用前应先予以培养过夜，弃去有气泡的管子。 液态培养基在室温下存放超过一周，可能有水分蒸发，如果管内液体损失 10%，应弃去不用。 5.各种培养基的成分与制备 为减少配制中的误差，尽量选用市售已配好的综合培养基。 （1）营养琼脂培养基 蛋白胨 10 牛肉浸膏 3 氯化钠 5 琼脂 15-20 蒸馏水 1000ml 将上述成分混匀后，调节 pH 为 7.4-7.6，过滤去除沉淀，分装于玻璃容器 中，经 121高压蒸汽灭菌 15min，贮存于暗处备用。 （2）乳糖蛋白胨培养液 蛋白胨 10 牛肉浸膏 3 氯化钠 5 乳糖 5 1.6溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 1000ml 5 将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氧化钠加热溶解于 1000 ml 蒸馏水中，调节 pH 为 7.2-7.4，再加入 1.6溴甲酚紫乙醇溶液 1ml，充分混匀，分装于含有 倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在 115高压蒸汽灭菌 20min，贮于暗处备用。 此培养基适用于检验大肠菌群时作发酵试验用。根据实际需要，也可按上 述配方比例（除蒸馏水外）配成二倍、三倍或五倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液， 制法同上。 （3）品红亚硫酸钠培养基（多管发酵用） 蛋白胨 10 乳糖 10 琼脂 20-30 磷酸氢二钾 3.5 无水亚硫酸钠 5ml 蒸馏水 1000ml 5碱性品红乙醇溶液 20 ml 贮备培养基：先将琼脂加至 900 ml 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸 氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至 1000 ml，调节 pH 为 7.2-7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧 瓶内，置高压蒸汽器中，在 115高压蒸汽灭菌 20min。贮于暗处备用。 平板培养基：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养 基的容量，用灭菌吸管按 1：50 的比例吸取一定量的 5碱性品红乙醇溶液置 于灭菌空试管中；再按 1：200 的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌 空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸 10min 灭菌。用灭菌 吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡 红色为止（不宜多加）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分 混匀（防止产生气泡）。立即将此种培养基适量（约 15 ml）倾入已灭菌的空 平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保 存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 （4）伊红美蓝培养基（ERB 培养基） 蛋白胨 10 乳糖 10 琼脂 20 磷酸氢二钾 2.0 蒸馏水 1000ml 2伊红（曙红）水溶液 20ml 6 0.5美蓝（亚甲基蓝）水溶液 13 ml 贮备培养基：先将琼脂加至 900 ml 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸 氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至 1000 ml，调节 pH 为 7.2-7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧 瓶内，置高压蒸汽器中，在 115高压蒸汽灭菌 20min。贮于暗处备用。 平板培养基：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养 基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的 2伊红水溶液及 0.5美蓝水溶 液加入已融化的培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。当混合好的培养基 冷却至 45，便立即将此种培养基适量（约 15 ml）倾入已灭菌的空平皿内， 待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。 四、操作步骤 l水样的采取 (1)自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼 3min 灭菌，再开放水龙头使水流 5min 后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。 (2)池水、河水或湖水：应取距水面 l015cm 的深层水样，先将灭菌的带 玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中， 盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存 2细菌总数测定 (1)自来水 用灭菌吸管吸取 lml 水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 分别倾注约 15mL 己溶化并冷却到 45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基， 并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基 15mL 作空自对照。 培养基凝固后，倒置于 37 温箱中，培养 24h，进行菌落计数。 两个平板的平均菌落数即为 lml 水样的细菌总数。 (2)池水、河水或湖水等 稀释水样：取 3 个灭菌空试管，分别加入 9ml 灭菌水。取 lml 水样注入 第一管 9ml 灭菌水内、摇匀，再自第一管取 1ml 至下一管灭菌水内，如此稀释 到第三管，稀释度分别为 10-1、10-2 与 10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定， 7 以培养后平板的菌落数在 30300 个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的 菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。 一般中等污秽水样，取 10-1、10-2、10-3 三个连续稀释度，污秽严重的取 10-2、10-3、10-4 三个连续稀释度。 自最后三个稀释度的试管中各取 lmL 稀释水加入空的灭菌培养皿中，每 一稀释度做两个培养皿。 各倾注 15ml 已溶化并冷却至 45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即 放在桌上摇匀。 凝固后倒置于 37培养箱中培养 24h。 3菌落计数方法 (1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长 时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。 若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可 将此一半的菌落数乘 2 以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌 落数。 (2)首先选择平均菌落数在 30300 之间的，当只有一个稀释度的平均菌落 数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。 (3)若有两个稀释度的平均菌落数均在 30300 之间，则按两者菌落总数之 比值来决定。若其比值小于 2，应采取两者的平均数；若大于 2，则取其中较小 的菌落总数。 (4)若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落 数乘以稀释倍数。 (5)若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落 数乘以稀释倍数。 (6)若所有稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，则以最近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数。 五、实验报告 1结果 （1）自来水 8 （2）池水、河水或湖水等 2思考题 （1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？ （2）你所测的水源水的污秽程度如何？ （3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条 件（诸如培养温度，培养时间等）来测定水样总数呢？为什么？ 实验二、实验室环境和人体表面微生物的检查 一、目的要求 1.证明实验室环境与体表存在微生物。 2比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。 3观察不同类群微生物的菌落形态特征。 4体会无菌操作的重要性。 二、基本原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种 于培养基上，在适宜温度下培养 12d 内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而 进行繁殖，形成一个可见的细胞群体集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌 落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙 或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松 或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。 三、器材 l培养基：肉膏蛋白胨琼脂平板。 2仪器或其他用具：无菌水，灭菌棉签(装在试管内)，接种环，试管架， 酒精灯或煤气灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教 师指定分配，最后结果供全班讨论。 l写标签 9 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班 级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源(如实验室空气或无菌室空气或头 发等)，字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养 皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。 2实验室细菌检查 (1)空气：将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖， 使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无 人走动的其他实验室，移去皿盖。lh 后盖上两个皿盖。 (2)实验台和门的旋钮 用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 取棉签：左手拿装有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、 无名指夹持棉塞(或试管帽)，将其取出，将管口很快地通过煤气灯(或酒精灯) 的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。 塞回棉塞(或试管帽)，并将空试管放在试管梁上。 弄湿棉签：左手取灭菌水试管，如上法拨出棉塞(或试管帽)并烧灼管口， 将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将 棉签取出，烧灼管口，塞回棉塞(或试管帽)，并将灭菌水试管放在试管梁上。 取样：将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约 2cm2 的范围。 接种：在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，再将棉签 伸人，在琼脂表面顶端接种，即滚动一下，立即闭合皿盖。并按图 27-2E 和 F，将原放棉签的空试管拨出棉塞(或试管帽)，烧灼管口，插入用过的棉签，将 试管放回试管架。 划线：另取接种环在火焰上灭菌，按图 33 方法进行划线，整个划线操 作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。 3人体细菌的检查 （1）手指(洗手前与洗手后) 分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后(班级、姓名日期)。 10 移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上 皿盖。 用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平 板表面来回移动，盖上皿盖。 (2)头发：在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细 菌降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。 A.接种时，用左手将平皿开启一缝； B.棉签伸入平板接种； C.用己灭菌并冷却了的接种环划线； D.第二部分划线； E.最后部分划线 (3)咳嗽：将去皿盖的琼脂平板放在离口约 68cm 处，对着琼脂表面用力 咳嗽，然后盖上皿盖。 (4)鼻腔 按照实验台检查法的步骤和，取出棉签，并将其弄湿。 用湿棉签在鼻腔内滚动数次。 按实验台检查法的步骤和，接种与划线，然后盖上皿盖。 4将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放 37培养箱，培养 12d。 五、结果记录方法 (1)菌落计数 在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后 1/4 面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数 l/4 面积的菌落数。 (2)根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注 意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变 得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌 落。 菌落特征描写方法如下： 大小：大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下， 再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。 颜色：黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。 11 干湿情况：干燥、湿润、粘稠。 形态：圆形、不规则等。 高度：扁平、隆起、凹下。 透明程度：透明、半透明、不透明。 边缘：整齐、不整齐。 六、菌落总数计算方法 3ATN50空 气 中 细 菌 总 数 （ cfu/m） =N式 中 ： 平 皿 菌 落 数 ； 2A)c平 皿 面 积 （ ； T平皿暴露时间(分钟 ) 七、实验报告 1结果 （1）将你自已的平板结果记录于下表中。 （2）与其他同学所做的结果进行比较 2思考题 (1)比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？ (2)人多的实验室与无菌室(或无人走动的实验室)相比，平板上的菌落数与 菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？ (3)洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？ (4)通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些 什么？有什么体会。 实验三 大气环境中 TSP 的测定 一、目的要求 大气环境中 TSP 是一种常规的污染物，它们对人体健康、植被生态和能见 度等都有着非常重要的直接和间接影响。因此，对 TSP 污染物的浓度监测是环 12 境监测中一项重要的工作。 本实验在校园中及附近的工业区、公路傍进行采样分析。通过本实验，应 达到以下目的： （）掌握重量量测定大气环境中 TSP 浓度的方法； （）了解 TSP 污染物对人体健康的危害； （）学习环境监测中质量控制和保证的概念。 二、基本原理 通过具有一定切割特性的采样器，以恒速抽取一定体积的空气，空气中粒 径小于 100m 的悬浮颗粒物被截留在已恒重的滤膜上。根据采样前、后滤膜质 量之差及采样体积，计算总悬浮颗粒物的浓度。滤膜经处理后，可再进行组分 分析。 本方法适用于大流量或中流量总悬浮颗粒物采样器（简称采样器）进行空 气中总悬浮颗粒物的测定。方法的检测限为 0.001mg/m3。总悬浮颗粒物含量过 高或雾天采样使滤膜阻力大于 10kPa 时，本方法不适用。 三、实验仪器和材料 （1）大流量或中流量采样器：1 台，应按1.1-89总悬浮颗粒物采 样器技术要求（暂行） 的规定。 （2）大流量孔口流量计：1 个，量程 0.7-1.4m3/min，流量分辨率 0.01 m3/min，精度优于2。 （3）中流量孔口流量计：1 个，量程 70-160L/min，流量分辨率 1 L /min，精度优于2。 （4）U 型管压差计：1 个，最小刻度 0.1hPa。 （5）X 光看片机：1 台，用于检查滤膜有无缺损。 （6）打号机：1 台，用于在滤膜及滤袋上打号。 （7）镊子：1 个，用于夹取滤膜。 （8）超细玻璃纤维滤膜：10 片，对 0.3m 标准粒子的截留效率不低于 99，在气流速度为 0.45m/s 时，单张滤膜阻力不大于 3.5kPa，在同样气流速 度下，抽取经高效过滤器净化的空气 5h，1 cm 2滤膜失重不大于 0.012 mg。 （9）滤膜袋：10 个，用于存放采样后对折的采尘滤膜，袋面印有编号、 13 采样日期、采样地点、采样人等项栏目。 （10）滤膜保存盒：1 个，用于保存、运送滤膜，保证滤膜在采样前处于 平展不受折状态。 （11）恒温恒湿箱：1 台，箱内空气温度要求在 15-30范围内可调，控温 精度1；箱内空气相对湿度控制在（505），恒温恒湿箱可连续工作。 （12）总悬浮颗粒物大盘天平：1 台，用于大流量采样器滤膜称量，称量 范围10g，感量 1 mg，标准差2 mg。 （13）分析天平：1 台，用于中流量采样滤膜称量，称量范围10g，感量 0.1 mg，标准差0.2 mg。 四、实验方法和步骤 1.采样器的流量校准 新购置或维修后的采样器在启用前，须进行流量校准。其校准方法按仪器 使用说明书进行。 2.总悬浮颗粒物含量测试 （1）滤膜准备：每张滤膜均需用 X 光看片机进行检查，不得有针孔或任 何缺陷。在选中的滤膜光滑表面的两个对角上打印编号。滤膜袋上打印同样编 号备用。将滤膜放在恒温恒湿箱中平衡 24h，平衡温度取 15-30中任一点， 记录下平衡温度与湿度。在上述平衡长期保持下称量滤膜，大流量采样器滤 膜称量精确到 1 mg，中流量采样器滤膜称量精确到 0.1 mg。记录下滤膜质量 m0(g)。称量好的滤膜平展地放在滤膜保存盒中，采样前不得将滤膜弯曲或折 叠。 （2）安放滤膜及采样：打开采样头顶盖，取出滤膜夹。用清洁干布擦去 采样头内及滤膜夹上的灰尘。将已编号并称量过的滤膜绒面向上，放在滤膜 支持网上，放上滤膜夹，对正，拧紧，使不漏气。安装好采样头顶盖，按照采 样器使用使用说明，设置采样时间，即可启动采样。样品采完后，打开采样 头，用镊子轻轻取下滤膜，采样面向上，将滤膜对折，放入号码相同的滤膜袋 中。取滤膜时，如发现滤膜损坏，或滤膜上尘的边缘轮廓不清晰、滤膜安装歪 斜（说明漏气） ，则本次采样作废，需重新采样（记录表格见附录 C） 。 （3）尘膜的平衡及称量：尘膜在恒温恒湿箱中，与二次滤膜平衡条件相同 14 的温度、湿度下，平衡 24h。在上述平衡条件下称量滤膜，大流量采样器滤膜 称量精确到 1 mg，中流量采样器滤膜称量精确到 0.1 mg。记录下滤膜质量 m1(g) （记录表格见附录 D） 。滤膜增重，大流量滤膜不小于 100 mg，中流量滤膜不小 于 10 mg。 （4）计算： 103/NKmugQt总 悬 浮 颗 粒 物 含 量 （ ） 式中：t累积采样时间，min； QN采样器平均抽气流量，即式（1-3）或式（1-4）Q HN或 QMN的计算 值； K常数，大流量采样器 K=1x 106, 中流量采样器 K=1x 109。 （5）测试方法的再现性：当两台总悬浮颗粒物采样器安放位置相距不大于 4m，不少于 2m 时，同时采样测定总悬浮颗粒物含量，相对偏差不大于 15。 五、数据记录与处理 按下表进行。 15 六、问题分析与讨论 1.大气环境中的 TSP 的主要污染来源有哪些？ 2.大气环境中的 TSP 有哪些危害？ 3.如何预防 TSP 的污染？ 实验四 空气中甲醛污染的测定监测 一、目的要求 室内空气污染对人体健康的影响最为显著，与大气环境相比有其特殊性。 室内空气污染监测是评价居住环境的一项重要工作。 本实验选择刚装修完和装修已久的不同房间，或者在一个刚装修完房间的 不同通风条件下，进行采样分析。通过本实验达到以下目的： （1）掌握酚试剂分光光度法测定空气中甲醛浓度的方法； （2）初步了解影响室内空气质量的因素。 二、基本原理 甲醛与酚试剂反应生成嗪，在高铁分子存在下，嗪与酚试剂的氧化产物反 应生成蓝绿色化合物，在波长 630nm 处，用分光光度法测定。 采样体积为 5mL 时，村法检出限为 0.02g/m 3，当采样体积为 10L 时，最 低检出浓度为 0.01mg/m3。 三、实验仪器和试剂 1仪器 16 （1）大型气泡吸收管：10 只，10mL。 （2）空气采样器：1 台，流量范围 0-2L/min。 （3）具塞比色管：10 只，10mL。 （4）分光光度计：1 台。 2试剂 （1）吸收液：称取 0.10g 酚试剂（3-甲基-苯并噻唑胺，C 6H4SN(CH3) C：NNH 2.HCl，简称 MBTH） ，溶于水中，稀释至 100mL，即为吸收原液，贮 存于棕色瓶中，在冰箱内可以稳定 3 天。采样时取 5.0mL 原液加入 95mL，即 为吸收液。 （2）硫酸铁铵溶液（10g/L）：称取 1.0g 硫酸铁铵，用 0.10mol/L 盐酸溶 液溶解，并稀释至 100mL。 （3）硫代硫酸钠标准溶液（0.10mol/L）：称取 26g 硫代硫酸钠 （Na 2S2O3.5H2O）和 0.2 无水碳酸钠溶于 1000mL 水中，加入 10mL 异戊醇，充 分混合，贮存于棕色瓶中。 （4）甲醛标准溶液：量取 10mL 浓度为 36-38的甲醛，用水稀释至 500mL，用碘量法标定甲醛溶液浓度。使用时，先用水稀释至每毫升含 10.0g 甲醛的溶液，然后立即吸收 10.00mL 此稀释液于 100 容量瓶中，加 5.0 吸收原液，用水稀释至标线。此溶液每毫升含 1.0g 甲醛。放置 30min 后， 用此溶液配制标准色列，此标准溶液可稳定 24h。 标定方法：吸取 5.00mL 甲醛溶液于 250mL 碘量瓶中，加入 40.00mL0.10mol/L 碘溶液，立即逐滴加入浓度为 30%的氢氧化钠溶液，至颜色 褪至淡黄色为止。放置 10min，用 5.0mL 盐酸溶液（1:5）酸化（空白滴定时需 多加 2mL） 。置暗处放 10min，加入 100-150mL 水，用 0.1mol/L 硫代硫酸钠标准 溶液滴定至淡黄色，加 1.0mL 新配制的 5%淀粉指标剂，继续滴定至蓝色刚刚褪 去。 加取 5mL 水，同上述方法进行空白滴定。 按下式计算甲醛溶液浓度： 23015.0.NaSOfVc 17 式中： 被标定的溶液的浓度，g/L；f V0、V分别为滴定空白溶液、甲醛溶液所消耗的硫代硫酸钠标准溶液体 积，mL； 硫代硫酸钠标准溶液浓度， ；23NaSOc 15.0与 1L 1mol/L 的硫代硫酸钠标准溶液等当量的甲醛质量，g。 四、采样与测定 1.采样 用内装 5.00mL 吸收液的气泡吸收管，以 0.5l/min 流量，采气 10L 2.测定 （1）标准曲线的绘制：取 8 支 10mL 比色管，按表 2-1 配制标准系列。然 后向各管中加入 1%硫酸铁铵溶液 0.40mL，摇匀。在室温下（8-35）显色 20min。在波长 630nm 处，用 1cm 比色皿，以水作为参比溶液，测定吸光度。以 吸光度对甲醛含量（g） ，绘制标准曲线。 （2）样品的测定：采样后，将样品溶液移入比色皿中，用少量吸收液洗涤 吸收管、洗涤液并入比色儿，使总体积为 5.0mL。室温下（8-35）放置 80min 后，以下操作同标准曲线绘制。 表 2-1 甲醛标准系列 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 甲醛标准溶液/mL 吸收液/mL 甲醛含量/g 0 5.00 0 0.10 4.90 0.10 0.20 4.80 0.20 0.40 4.60 0.40 0.60 4.40 0.60 0.80 4.20 0.80 1.00 4.00 1.00 1.50 3.50 1.50 五、实验结果计算 fNmV 式中： 空气中甲醛的含量，mg/m 3；f m样品中甲醛含量，g； VN标准状态下采样体积，L。 18 六、实验注意事项 （1）绘制标准曲线时与样品测定时温差不超过 2。 （2）标定甲醛时，在摇动下逐滴加入 30氢氧化钠溶液，至颜色明显减 退，再摇片刻，待褪成淡黄色，放置后应褪至无色。若碱加入量过多，则 5mL 盐酸溶液（1：5）不足以使溶液酸化。 （3）当与二氧化硫共存时，会使结果偏低。可以在采样时，使气样先通过 装有硫酸锰滤纸的过滤器，排除干扰。 实验五 大气环境中氮氧化物的测定 盐酸萘乙二胺分光光度法 一、目的要求 空气中氮氧化物的种类很多，如亚硝酸、硝酸、 N2O、NO、NO 2、N 2O4、N 2O5 等。其中 NO2 和 NO 是大气中的主要污染物质。 通常所指的氮氧化物即为中 NO2 和 NO。 测定环境中的氮氧化物常用的化学分析法为盐酸萘乙二胺分光光度法，其 采样与显色同时进行，操作简便、方法灵敏，目前被国内外普遍采用。 盐酸萘乙二胺分光光度法有两种采样方法：方法一吸收液用量少，适用于 短时间采样，测定空气中氮氧化物的短时浓度；方法二吸收液用量大，适用于 24 小时连续采样，测定空气中氮氧化物的日平均浓度。 二、实验原理 二氧化氮被吸收液吸收后，生成亚硝酸和硝酸。其中亚硝酸与对氨基苯磺 酸起重氮化反应，再与盐酸萘乙二胺偶合，呈玫瑰红色，根据颜色深浅，于波 长 540 处用分光光度法测定。反应方程式如下： 19 空气中的氮氧化物包括 NO 及 NO2 等。在测定氮氧化物时，应先用三氧化 铬将 NO 氧化成 NO2，然后测定 NO2 的浓度。 短时间采样（方法一）检出限为 0.01 g/mL（按与吸光度 0.01 相对应的 亚硝酸根含量计） ，当采样体积为 6L 时，氮氧化物（以二氧化氮计）的最低检 出浓度为 0.01 mg/m3。24 采样（方法二）检出限为 0.01 mg/L（按与吸光度 0.01 相对应的亚硝酸根含量计） ，当用 50 mL 吸收液，24 h 采气样 288 L 时，氮氧化 物（发二氧化氮计）的最低检出浓度为 0.002mg/m3。 三、实验仪器和试剂 1仪器 （1）多孔玻板吸收管：10 只，用于短时间采样，10 mL。 （2）多孔板吸收瓶：10 个，用于 24 h 采样，75mL。 （3）双球玻璃管：10 只。 （4）恒温自动连续空气采样器：1 台，流量范围 0-1 L/min。 （5）分光光度计：1 台。 （6）具塞比色管：10 只。用于短时间采样，10 mL。 （7）具塞比色管：10 只。用于 24 h 采样，25 mL。 （8）容量瓶：10 只。用于 24 h 采样，50 mL。 （9）移液管：若干，各种。 2试剂 所用试剂 均用不含亚硝酸根的重蒸馏水配制，即所配吸收液的吸光度不 超过 0.005。 20 （1）吸收原液：称取 5.0 g 对氨基苯磺酸，通过玻璃小漏斗直接加入 1000 mL 容量瓶中，加入 50 mL 冰乙酸和 900 mL 水的混合溶液，盖塞振摇使其 溶解，待对氨基苯磺酸完全溶解后，加入 0.050 g 盐酸萘乙二胺溶解后，用水 稀释至标线。此为吸收原液，贮于棕色瓶中，在冰箱中可保存两个月。保存时 岢用聚四氟乙烯生料带密封瓶口，以防止仰不愧天民吸收液接触。 （2）采样用吸收液：按 4 份吸收原液和 1 份水的比例混合。 （3）三氧化儿海砂（河砂）氧化管：筛取 20-40 目海砂（河砂） ，用盐 酸溶液（1：2）浸泡一夜，再用水冲洗至中性，烘干。把三氧化铬及海砂（河 砂）按质量比 1：20 混合，加少量水调匀，放在红外灯下或烘箱里于 105烘 干，烘干过程中应搅拌几次。制备好的三氧化铬海砂是松散的，若黏在一起， 说明三氧化铬比例太大，可适当增加一些砂子，重新制备。 称取约三氧化铬海砂装入双球玻璃管中，两端用少量脱指棉塞好，并用 乳胶管或塑料管制的小帽将密封。使用时氧化管与吸收管之间用一小段乳胶管 连接，采集的气体尽可能少和乳胶管接触，以防止氮氧化物被吸附。 （4）亚硝酸钠标准贮备液：称取 0.1500 g 粒状亚硝酸钠（NaNO 2，预先在 干燥器内放置 24 h 以上） ，溶解于水，移入 1000 mL 容量瓶中，用水稀释至标 线。此溶液每毫升 100.0 g 含亚硝酸根（NO 2-） ，贮存于棕色瓶并保存冰箱中， 可稳定 3 个月。 （5）亚硝酸钠标准溶液：临用前，吸取 5.00 mL 贮备液于 100 mL 容量瓶 中，用水稀释至标线。此溶液每毫升含 5.0 g 亚硝酸根（NO 2-） 。 四、采样与测定 1采样 短时间采样：将一支内装 5.00 mL 吸收液的多孔玻板吸收管进气口与氧化 管连接，并使氧化管稍微向下倾斜，以免当湿空气将氧化剂（Cr 2O3）弄湿时， 污染后面的吸收液。以 0.2-0.3 L/min 流量，避光采样至吸收液呈微红色为止， 记下采样时间，密封好采样管，带回实验室，当日测定。采样时，若吸收液不 变色，采样量应不少于 6L。 长时间采样 ：将一个内装 50 mL 吸收液的多孔玻板吸收瓶进气口与氧化 管连接，并使氧化管稍微向下倾斜，以免当湿空气将氧化剂（Cr 2O3）弄湿时， 21 污染后面的吸收液。用恒温、自动连续空气采样器以 0.2 L/min 流量采样 24h， 采气体积约为 288 L。采样后，将样品带回实验室，如当天不测定，样品溶液 保存在冰箱中，于 3 天内测定。 2测定 （1）标准曲线绘制：分别取 7 支 10 mL 或 25 mL 具塞比色管，按表 1-1 和表 1-2 分别配制短时间和 24 h 采样的标系列。 表 1-1 亚硝酸钠标准系列（短时间采样） 表 1-2 亚硝酸钠标准系列（24 h 采样） 各管摇匀后，避开直射阳光，放置 15 min，在波长处 540 nm，用 1 cm 比 色皿，以水为参比，测定吸光度。以吸光度对亚硝酸根含量（ g） ，绘制标准 曲线或用最小二乘法计算回归方程式： ybxa 式中：y 标准溶液吸光度（ A）与试剂空白液吸光度（A 0）之差； x 亚硝酸根含量， ； b回归方程式的斜率； 管号 0 1 2 3 4 5 6 亚硝酸钠标准溶液/mL 吸收原液/mL 水/mL 亚硝酸根含量/ g 0 4.00 1.00 0 0.10 4.00 0.90 0.5 0.20 4.00 0.80 1.0 0.30 4.00 0.70 1.5 0.40 4.00 0.60 2.0 0.50 4.00 0.50 2.5 0.60 4.00 0.40 3.0 管号 0 1 2 3 4 5 6 亚硝酸钠标准溶液/mL 吸收原液/mL 水/mL 亚硝酸根含量/ g 0 20.00 5.00 0 0.50 20.00 4.50 2.5 1.00 20.00 4.00 5.0 1.50 20.00 3.50 7.5 2.00 20.00 3.00 10.00 2.50 20.00 2.50 12.5 3.00 20.00 2.00 15.0 22 a回归方程式的截距。 （2）样品测定： 对短时间采样，采样后，放置 15 min，将样品溶液移入 1 cm 比色皿中， 用绘制 标准曲线的方法测定试剂空白液和样品溶液的吸光度。若样品沉沦的 吸光度超过标准曲线的测定上限，可用吸收液稀释后，再测定吸光度，计算结 果应乘以稀释倍数。 对 24 h 采样，采样后，将样品溶液移入 50 mL 具塞比色管中或容量瓶中， 用少量吸收液洗涤吸收瓶，使样品溶液定容至 50.0 mL，混匀，放置。将样品 移入 1 cm 比色皿，用绘制曲线的方法测定样品溶液的吸光度。若样品溶液的吸 光度超过曲线测定上限，可用吸收液稀释后再测定吸光度。 五、实验结果计算 20.76stNONkABV 式中： 空气中 NO2 的含量，mg/m 3；2 A 样品溶液吸光度； A 0 试剂空白液吸光度； B s 校正因子（1/b） ； 0.76 （气）换为（液）的系数； b 回归方程式的斜率； V t 样品溶液总体积， V s 测定时所取样品溶液体积， V N 标准状态下的采样体积 k 采样时溶液的体积与绘制标准曲线时溶液体积的比值，短时间采 样为 1，采样时为 2。 六、实验注意事项 （1）吸收液应避光，并避免长时间暴露于空气中，以防止光照使吸收液显 色或吸收空气中的氮氧化物而使试剂空白值偏高。 （2）氧化管适于在相对湿度为 30-70时使用，当空气中相对湿度大于 23 70时，应勤换氧化管；相对湿度小于 30时，则在使用前用经过水面的潮湿 空气通过氧化管，平衡 1 小时。使用过程中，应注意氧化管是否吸湿引起板结 或变绿。若板结，会使采样系统阻力增大，影响流量；若普绿则表示氧化管已 失效。 （3）亚硝酸钠固体应妥善保存。氧化成硝酸钠或呈粉末状的试剂都不适用 直接配制标准溶液。若无颗粒状亚硝酸钠试剂，则可用高锰酸钾容量法标定出 亚硝酸钠贮备液的准确浓度后，再稀释成每毫升含 5.0 g 亚硝酸根的标准溶液。 （4）在 20时，以 5 mL 样品计，其标准曲线斜率 b 为(0.1900.003) x106吸光度/g，要求截距的绝对值 ，若斜率达不到要求，应检查亚硝0.8a 酸钠试剂的质量及标准溶液的配制，重新配制标准溶液；若截距达不到要求， 应检查蒸馏水及试剂质量，重新配制吸收液。性能好的分光光度计的灵敏度高， 斜率略高于 0.193。 （5）吸收液若受三氧化铬污染，溶液呈黄棕色，该样品应报废。 （6）绘制标准曲线时，应以均匀、缓慢的速度向各管中加亚硝酸钠标准使 用液，否则将影响曲线的特性。 （7）空气中二氧化硫浓度为氮氧化物浓度的 10 倍时，对氮氧化物的测定 无干扰；30 倍时，使颜色有少许减退。 实验六 环境空气中 SO2 浓度的测定 盐酸副玫瑰苯胺法 一、目的要求 空气中的硫氧化物有二氧化硫、硫化氢、二硫化碳、羰甚佳硫、硫酸、硫 酸盐及微量有机硫等。在环境监测中，对二氧化硫的测定具有代表性，其污染 源多来自煤和矿物油的燃烧等。 空气中二氧化硫的测定方法较多，主要有分光光度法、紫外荧光法、气相 色谱法、电导法、库仑滴定法等。下面重点盐酸副玫瑰苯胺法介绍。 二、实验原理 24 盐酸副玫瑰苯胺法系国际上采用的标准方法。其灵敏度高，适用于瞬时采 样，样品采集后稳定。缺点是使用四氯汞钾吸收液，毒性较大。 该法有两种操作方法：方法一所用的盐酸副玫瑰苯胺使用液含磷酸量少， 最后溶液的 pH 为 1.60.1，其灵敏度较高，但试剂空白值高；方法二所用的盐 酸副玫瑰苯胺使用液含磷量多，最后溶液的 pH 为 1.20.1，其灵敏度低，但试 剂空白值低。方法一的溶液呈红紫色，最大吸收峰在 548 nm 处；方法二的溶液 呈蓝紫色，最大吸收峰在 575 nm 处。目前我国多采用方法二。 二氧化硫被四氯汞钾溶液吸收形成稳定的络合物，再与甲醛及副玫瑰苯受 作用，生成玫瑰紫色化合物。在波长 548nm 处（方法一）或 575 nm 处（方法 二）测定，根据颜色深浅比色定量。反应式如下： HgCl42- + SO2 + H2O HgCl 2SO32- + 2 Cl- + 2 H+ HgCl2SO32- + HCHO + 2 H+ HgCl 2 + HOCH2SO3H 最低检出限： 方法一：当采样体积为 30L 时，最低检出浓度为 0.025g/m 3。 方法二：当采样体积为 10L 时，最低检出浓度为 0.04mg/m3。 三、实验仪器和试剂 1仪器 （1）多孔玻板吸收管：10 个，用于短时间采样，10mL。或多孔板吸收瓶： 10 个，用于 24h 采样，75-125mL。 （2）空气采样器：1 台，流量 0-1L/min。 （3）分光光度计：1 台。 （4）具塞比色管：10 mL，10 只。 （5）容量瓶：25 mL，10 个。 （6）移液管：若干，各种。 2试剂 （1）四氯甲汞（TCM）吸收液(0.04mol/L)：称取的 10.9 g 的 HgCl2、6.0 g 的 KCl 和 0.070 g 的 Na2EDTA，溶解于水，稀释至 1000 mL，在密闭容器中贮 存，可 6 稳定个月，如发现有沉淀，不可再用。 （2）甲醛溶液（2.0 g/L）：每天新配。 25 （3）氨基磺酸胺溶液（6.0 g/L）：每天新配。 （4）盐酸副玫瑰苯胺（PRA，即对品红）贮备液（2 g/L）：称取经提纯的 0.20g 对品红，溶解于 100 mL 浓度为 1.0 mol/L 的盐酸溶液中。 （5）对品红使用液（0.016%）：吸取 2 g/L 对品红贮备液 20.00 mL 于 250 mL 容量瓶中，加 3 mol/L 磷酸溶液 25 mL，用水稀释至标线，至少放置 24h 方 可使用，存于暗处，可稳定 9 个月。 （6）碘贮备液（0.010 mol/L） 。 （7）碘溶液（0.010 mol/L） 。 （8）淀粉指示剂（3 g/L） 。 （9）碘酸钾标准溶液（3.0 g/L）：用优级纯 KIO3 于 110烘干 2 h 后配制。 （10）盐酸溶液（1.2 mol/L） 。 （11）硫代硫酸钠溶液（0.1 mol/L）：用碘量法标定其浓度。 （12）硫代硫酸钠标准溶液（0.01mol/L） 。 （13）亚硫酸钠标准溶液：称取 0.20 g 的 Na2SO3 及 Na2EDTA，溶解于 200 mL 新煮沸并已冷却的水中，轻轻摇匀，放置 2-3h 后标定，此溶液相当于每毫 升含 320-400g 的 SO2。 （14）磷酸溶液（3mol/L） 。 四、采样与测定 1采样 短时间采样：20 min-1 h，采用多孔玻板吸收管，内装 10 mL（方法一）或 5 mL（方法二）四氯甲汞吸收液，流量为 0.5 L/min，采样体积依大气中 SO2 浓 度增减。本法可测 25-1000g/m 3 范围的 SO2。如采用方法二，一般避光采样 10-20L。 长时间采样：24 h，采用 125 mL 多孔玻板吸收瓶，内装 50 mL 甲氯汞钾吸 收液，采样流量为 0.2-0.3 L/min。 2测定 （1）标准曲线绘制：配制 0.10%亚硫酸钠水溶液，用碘量标定其浓度，用 四氯汞钾溶液稀释，配成 2.0g/