乙酰胆碱酯酶抑制剂

上海应用技术学院 研究生课程高等天然产物化学试卷 2014 / 2015 学年第 1 学期 课程代码： NX0702013 论文题目： 乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展 姓 名： 芮银 146061414 康满满 146061409 专 业： 制 药 工 程 学 院： 化 工 学 院 课程（论文）成绩： 课程（论文）评分依据（必填）： 1.熟练掌握文献检索方法，并能对其进行综合分析整理，论文结构规范，选材精简得当，条理清晰， 语言流畅， 版面整洁美观。得分为 90-100 分。 2.掌握文献检索方法，并能对其进行相应的分析整理，论文结构较规范，材料组织得当，条理清晰， 语言流畅。得分为 80-89 分。 3.掌握基本的文献检索方法，并能对其进行一般性分类整理，论文结构基本规范，内容有小问题， 条理较清晰，得分为 70-79 分。 4.一般性罗列检索文献，论文结构基本规范，内容未经认真整理，得分为 60-69 分。 5.达不到上述第 4 点要求的论文，得分为 0-59 分。 任课教师签字： 日期： 年 月 日 I 乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展 芮银，陈祎桐，康满满 摘要：本文阐述了乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)的研究进展，介绍了用于药物治 疗的乙酰胆碱酯酶抑制剂的各种来源如植物、微生物等，及其抑制乙酰胆碱的 活性物质。在此基础上，总结了几种现代分析技术，对 AChEIs 进行筛选，大 大加快 AD 药物资源的开发利用进程。这些方法主要有基于比色法的 Ellmans 法及相关的改进方法、薄层显色法、荧光显色法、电喷雾质谱法等。但是，到 目前为止，现代分析技术在 AD 药物资源中的应用还处在起步阶段。 关键词：乙酰胆碱酯酶抑制剂，筛选方法，薄层显色法，荧光显色法 III The progress of acetylcholinesterase inhibitors Rui Yin, Chen Yitong, Kang Manman Abstract：In this artical, the research elaborates progress of acetylcholinesterase inhibitors (AChEI), and introduces a variety of sources for drug treatment acetylcholinesterase inhibitors such as plants, microorganisms, and its active ingredients. On this basis, the review summarizes several modern analytic techniques such as Ellmans method which based on the colorimetric method, TLC chromogenic method, fluorescent color method, Electrospray ionization mass spectrometry and so on. However, at present, the application of modern analytic techniques in AD drug resources is still in infancy. Key word: Acetylcholinesterase inhibitors, Screening Methods, TLC chromogenic method, Fluorescent color method 目 录 摘要 .I AbstractII 1. 简介 .1 2. 植物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂 .1 2.1 抑制乙酰胆碱酯酶的植物资源 1 2.2 植物中抑制乙酰胆碱酯酶的活性成分 2 2.2.1 生物碱类 3 2.2.2 萜类 4 2.2.3 香豆类、黄酮类和其他 4 3. 微生物来源乙酰胆碱酯酶抑制剂 .5 4. 乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法 .6 4.1 基于比色法的 Ellmans 法 .6 4.2 薄层色谱生物自显影法 7 4.3 荧光显色法 8 4.4 液相色谱及液相色谱质谱联用技术 8 5. 总结 .10 参考文献 10 1 1. 简介 阿兹海默症（AD），一般俗称老年痴呆症，是一种以进行性认知功能(包 括学习、记忆、判断及抽象思维等)障碍为特征的中枢神经系统退行性疾病，是 一种持续性神经功能障碍，也是失智症中最普遍的成因，好发于 65 岁左右的老 人 1。AD 的发病机制复杂，目前较能被接受的病理为胆碱能缺失学说，该学 说认为患者记忆功能障碍是大脑皮层、海马、核基底等区域的神经递质乙酰 胆碱缺失的结果。乙酰胆碱酯酶可催化乙酰胆碱裂解，导致乙酰胆碱的缺失， 直接造成神经信号传递失败，从而导致老年痴呆症 2,3。目前，治疗老年痴呆症 最有效的方法之一是抑制 AChE，AChE 抑制剂是美国 FDA 唯一允许作为治疗 老年痴呆症的药物，且目前只有 4 种药物获得 FDA 许可，分别为：Tacrine ( 他克林) 、Donepezil( 多奈哌齐)、Rivastigmine(利斯的明)、Galantamine (加兰他 敏) 4,5。但上述 4 种应用于临床的 AChE 抑制剂大多存在半衰期短、较严重的 外周胆碱能系统副作用等缺点 6。所以从大自然中开发、寻找具有适宜患者长 期服用、毒副作用小、作用面广等优点的 AChE 抑制剂受到科学研究者的广泛 关注。 乙酰胆碱酯酶抑制剂又称为抗胆碱酯酶药，通过对乙酰胆碱酯酶的可逆性 抑制，达到使乙酰胆碱(ACh)在突触处的积累，延长并且增加了乙酰胆碱的作用， 属于间接拟胆碱类药物，临床主要用于治疗重症肌无力和青光眼及抗老年性痴 呆。目前，全世界正在开发研制的乙酰胆碱酯酶抑制剂有 40 多个，本文主要对 植物、微生物中的乙酰胆碱酯酶抑制剂进行综述。 2. 植物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂 自然界具有丰富的生物资源多样性，大量研究表明：天然植物药用成分具 有疗效好、副作用小、作用面广、适宜长期服用等优点。因而，从植物中寻找 具有抗早老性痴呆症的乙酰胆碱酯酶抑制剂，已成为当今医药研究方面的热点 课题 7。 在这资源丰富的大自然环境中，现已报道很多种植物中具有抑制乙酰 胆碱酯酶的活性成分，并有望用来治疗 AD。 2.1 抑制乙酰胆碱酯酶的植物资源 我国是一个中草药大国，也是中草药的发源地。目前，中国有大约 12,000 种药用植物，丰富的草药资源为天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的寻找提供了得天独 厚的资源优势。 张翼 8等采用乙酰胆碱酯酶抑制剂活性筛选模型对采自青岛沿海的 22 种海 藻样品提取物的石油醚组分和乙酸乙酯组分进行了活性筛选。结果表明，22 种 海藻的石油醚组分均具有不同程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中亮管藻、海 头红、鸭毛藻和孔石莼表现出较强的活性，在浓度为 50 g/mL 时的抑制率均 大于 50.0% ，分别为 50.5% 、55.5% 、56.6% 和 65.8% ；其他大部分海藻的 抑制率在 30.1% 48.9% 之间。与石油醚组分不同的是，只有少数海藻的乙酸 乙酯组分表现出乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中鸭毛藻的活性最为显著，在浓度 为 25 g/ mL 时抑制率高达 71.8%。 金虹等 9对益智仁、丹参、远志、熟地黄、钩藤、川芎、白芍和石菖蒲8 种中药材的水和乙醚提取物进行乙酰胆碱酯酶体外抑制实验，结果表明这8种中 药的水和乙醚提取液均有不同程度的抑制乙酰胆碱酯酶活性，其中以益智仁、 丹参和钩藤抑酶活性较强，其乙醚提取部分有多种乙酰胆碱酯酶抑制剂活性成 分。 当然，除了中国之外，其他的一些国家如泰国、印度、缅甸、朝鲜、新加 坡等国家也有丰富的植物资源，从中也可以提取到上好的乙酰胆碱酯酶抑制剂。 朝鲜族医学中的白菖蒲、石菖蒲、柴胡、山药、朝鲜淫羊藿、茯苓和红枣具有 提高记忆力和老年人认识力的功效，Oh M H等 10对这7种中草药甲醇提取物进 行乙酰胆碱酯酶体外抑制实验，发现白菖蒲和朝鲜淫羊藿的甲醇提取物对乙酰 胆碱酯酶有很强的抑制活力。Ingkaninan K 等 11收集了32种泰国传统的神经治 疗类药材，对这 32 种药材采用甲醇浸提，提取物通过Ellman的方法进行乙酰 胆碱酯酶体外抑制实验，结果表明马蹄花和Stephania suberosa Forman根部的甲 醇提取物能力最强，0.1 mg/mL 时对乙酰胆碱酯酶的抑制力分别为93.500.37%和 91.9310.80%；另外，疏果胡椒茎、胡椒种子、葛根根皮和腊肠树根的甲醇提 取物在0.1 mg/ mL时对乙酰胆碱酯酶的抑制力都大于50%。 除此之外，不同的研究者先后采取不同的方法在臭牡丹、苍耳、一年蓬、 3 紫茉莉、鬼针草、东风菜、麦冬、荷花玉兰、白玉兰、凹叶厚朴、深山含笑等 不同的植物中提取到乙酰胆碱酯酶抑制剂。 2.2 植物中抑制乙酰胆碱酯酶的活性成分 在研制作为药物的乙酰胆碱酯酶抑制剂的过程中，大多数都是经过一个先 从植物提取，后人工合成的过程。例如 Galantamine 是从雪花莲属植物以及我 国石蒜植物内分离到的生物碱，石杉碱甲是从中药石杉属千层塔中分离得到的 生物碱；从柑桔属植物葡萄柚中分离得到萜类；同样也可以从唇形科丹参等植 物中分离提取到香豆类、黄酮类等成分。因此，大自然植物物种丰富，是开发 研制乙酰胆碱酯酶抑制剂的宝库。 2.2.1 生物碱类 石蒜科文殊兰属植物 C. jagus 和 C. glaucum 在尼日利亚作为治疗老年性痴 呆的传统用药，从中分离得到的网球花碱(H aemantham ine)、Hamayne、Crinam ine 和石蒜碱 ( Lycorine)能提高脑内乙酰碱胆碱含量 12 。 石杉碱甲是从石杉属植物千层塔中分离得到的一种新型生物碱有效单体， 对脑内乙酰胆碱酯酶具有极高的选择性抑制性和可逆性抑制，但其在植物中的 含量很低，不易提取。同时，由于其结构的复杂性，全合成也不是一件容易的 事。 加兰他敏是从石蒜科植物中分离得到的一种生物碱，主要来源于黄花、石 蒜、石蒜及白水仙鳞茎、夏雪片莲、雪片莲、沃氏雪花莲的叶、球茎、克氏雪 花莲、雪花莲的全草、斯特伦伯石蒜球茎和波斯石蒜叶等。加兰他敏是一种可 逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，能刺激烟碱受体，提高胆碱功能和记忆，其疗效与 他克林相似， 稍弱于毒扁豆碱，有效时间长，半衰期 5-6 h，不良反应少，且 无肝毒性。 中草药及其制剂含有丰富的活性生物碱，是我国研究最多的 AChE 抑制剂 来源。张东博 13等从 5 种中草药中筛选出的元胡与黄柏生物碱提取物显示了显 著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，抑制率分别达到（96.60.6）%和（91.60.9）% ；这两种中草药的生物碱提取物对乙酰胆碱酯酶的半数抑制浓度各是 （1.90.1）g/mL 和（4.90.3）g/mL 。说明这两种中草药的生物碱提取物中 可能存在着高活性的生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂，能为开发治疗阿尔茨海默 病的新药提供有用的先导化合物。殷帅文 14等对井冈山区 63 种植物不同溶剂 萃取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了初步研究，结果发现：乙酸乙酯萃取物 中，供试量浓度在 1mg/mL 时，剪刀草和戟叶蓼表现出较强的 AChE 抑制活性， 抑制率均大于 90%，供试量浓度在 0.025mg/mL 时，蛇莓等 6 种植物的抑制率 大于 60%；在正丁醇萃取物中，供试量浓度在 1mg/mL 时，紫萼变种、活血丹、 菟丝子等植物的抑制率 大于 80%；在石油醚萃取物中，供试量浓度在 1mg/mL 时，紫萼变种、紫茎前 胡、博落回等植物的抑制率大于 90%，供试量浓度在 0.025 mg/mL 时，紫茎前 胡等 17 种植物抑制率大于 70%。 2.2.2 萜类 从柑桔属植物葡萄柚(C itrus parad isi )中分离得到的倍半萜 Nootkatone， 有抑制红细胞 AChE 的活性 15。从丹参中分得的二氢丹参醌和隐丹参醌具有较 强的 AChE 抑制活性，IC 50 分别为 1.07.0mol /L，系首次关于二萜成分 AChE 抑制活性的报道 16。 从棘枝属植物 Lippia stoechadifolia 中分离得到的 Pulegone-1,2-epoxiode 是 一种杀虫剂，其具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性。人参皂苷 Rb1 和人参皂苷 Rg1 是人参属植物人参、三七等的主要成分，既可提高乙酰胆碱含量使胆碱能 M 受体数增加，又能促进核酸和蛋白质的合成。Miyazawa M 等从柑桔属植物葡 萄柚中分离得到的倍半萜：香柏桐（Nootkatone），具有抑制红细胞 AChE 的 活性。Chung Y. K.等发现甘牛至的乙醇提取物表现出很强的 AChE 抑制能力， 进一步分离鉴定活性成分为熊果酸，其 AChE 的 IC50 为 7.5nM。Ren Y H 等从 丹参中分离得到的二氢丹参醌和隐丹参醌具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性， IC50 分别为 1.0 和 7.0 umol/L，是首次关于二萜成分 AChE 抑制活性的报道。 2.2.3 香豆类、黄酮类和其他 木兰属植物厚朴(Magnolia off icinalisR ehder)中分离得到的厚朴酚(Magnolol)可 抑制海马趾的 AChE，提高乙酰胆碱含量 17。金丝桃属贯叶金丝桃(Hyp ericum 5 perforatum )和萼状金丝桃(Hypericum calycimum )中分离得到的金丝桃素 (Hyperforin)能改善东莨菪碱所致大鼠记忆衰退，增强认知功能 18。蛇床子素是 从伞形科蛇床属植物蛇床的成熟果实蛇床子中提取的香豆素，并且能抑制小鼠 脑内胆碱酶活性和延缓衰老。Klusa V 等从金丝桃属贯叶金丝桃和萼状金丝桃中 分离得到金丝桃素，并发现其可以改善东莨菪碱所致的大鼠记忆衰退，增强认 知功能。Dae Keun Kim 等从当归的甲醇提取物中分离出三种具有很强 AChE 抑制活性的呋喃香豆素类化合物，分别为异前胡醚、欧前胡素和氧化前胡素， 且都表现出剂量依赖性抑制，IC 50 分别为 74.6、63.7 和 89.1 uM。Manh Hung 等从五味子果的正己烷提取物中分离出 14 种乙酰胆碱酯酶抑制剂成分，均为 木质素类，IC 50 分布在 6.55-13.28uM 之间。 以下是从植物中提取的一些植物碱类物质： H2N NH O H3CO O H OHH NCH3 O O H2N NCH3 H3C N CH3 石杉碱甲 加兰他敏 毒扁豆碱 OOO OH OOHO HON OHOHO OO N O CH3 O O 中乌碱 蒎烯 原鸦片碱 N+ O O H3CO OCH3 O O O O O O CH3 O CH3 小霹碱 欧前胡素 熊果酸 N+OO OO HO COH O O O 巴马亭 二氢丹淡参醌 隐丹参醌 3. 微生物来源乙酰胆碱酯酶抑制剂 20 世纪 90 年代后期，在植物来源和有机合成来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂 开发的同时，日本的科技工作者 Izaw a 等在筛选杀虫剂的过程中，从淡紫灰链 霉菌 NK90109393 中分离出 Cy clo phost in 乙酰胆碱酯酶抑制剂，IC 50 为 7. 6*10- 10 mol/ L。Omura 等从青霉和曲霉中分离的一组化合物 A risugacin 和 Territ rem 具有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性，分别是他克林的 200 和 29 倍； 此外董悦生等从放线菌株 N98- 1021 的发酵液中分离得到 N98- 1021A 化合物对 乙酰胆碱酯酶的 IC50 为 2. 010- 5 mol/ L。 魏玉珍等从 1200 株细菌中筛选到一株革兰氏阴性细菌 CPCC10056，16S rRNA 基因序列分析发现该菌株为玫瑰单胞菌属( Roseomonas)。承曦等 19对蛇 足石杉的 29 株内生真菌菌株发酵液醇提物进行了酶抑制活性的初步筛选，结果 得到 xg、g8、g5、xgc2 、 xy7 对乙酰胆碱酯酶具有较高的抑制率，其 IC50 分别 是 285. 62、293. 53、434. 17、6 68. 82、856. 21g/ mL。邹磊等 20对 9 种市售豆 豉体外乙酰胆碱酯酶抑制能力进行了测定，结果表明 9 种豆豉 80%乙醇提取液 抑制乙酰胆碱酯酶的 IC50 值范围为：0. 033 1.110 mg / mL。 7 4. 乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法 近年来，随着科学技术的进步，现代分析技术得到了快速发展。采用各种 现 代分析技术，对 AChEIs 进行筛选，大大加快了 AD 药物资源的开发利用进 程。这些方法主要有基于比色法的 Ellmans 法及相关的改进方法、薄层显色法、 荧光 显色法、电喷雾质谱法等。但是，到目前为止，现代分析技术在 AD 药物资源 中 的应用还处在起步阶段。 4.1 基于比色法的 Ellmans 法 Ellmans 法是胆碱酯酶活性检测中应用最广泛的一种技术，同时也是评估 乙酰胆碱酯酶活性的经典方案。 最初的乙酰胆碱酯酶抑制剂的检测是通过对临床标本采用肠道浴的药理学 技术方法进行的，但是该方法的实验周期长，且所使用的动物组织和试剂都较 昂贵。目前，该方法已经被灵敏的化学方法取代，如 Ellmans 法就得到广泛的 使用。这是一种快速测定乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，具有操作简单、灵敏度 高和专属性高等优点。其原理为：乙酰胆碱酯酶水解底物硫代乙酰胆碱，生成 的产物硫代胆碱再与显色剂 5 , 5 -二硫二硝基苯甲酸 5 , 5 -d ithiob is - (2 nitroben zoic acid)，DTNB反应生成在 410 nm 处有特征吸收的化合物 2-硝基-5- 巯基苯甲酸( 5 -thio-2-nitroben zoic acid)，通过可见分光光度计或酶标仪测定 410 nm 处的吸光度的增量，进而间接测定 AChE 的活性 21。 乙乙乙乙乙乙+乙乙乙乙乙乙乙 乙乙+乙乙乙乙+乙乙乙乙乙乙乙乙 2-乙乙-5-乙乙乙乙乙 目前，基于比色法的 Ellmans 法已广泛应用于乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选 和检测。许雪梅等 22用改良的 Ellmans 比色法测定了乙酰胆碱酯酶的活性，建 立乙酰胆碱酯酶体外筛选模型，并随机筛选多种植物浸膏，并对有抑制作用的 浸膏进一步进行活性追踪，筛出了需要的活性物质，最终得到了东茛菪内酯抑 制率超过 50% 的单体化合物，这为研发 AD 的新药提供了先导化合物。蒋玉仁 等采用 Ellmans 法比色法，检测了合成的潜在高活性化合物对乙酰胆碱的抑制 效能。结果显示，其抑制活性是现有药物加兰他敏的 3 倍。朱剑翔等以几种有 机磷杀虫剂为供试药剂，以乙酰胆碱酯酶为靶标酶，用 Ellmans 法建立了用于 农药的乙酰胆碱酯酶抑制剂的离体酶筛选方法，为今后乙酰胆碱靶标的酶筛法 做了准备。何玲等 23采用乙酰胆碱酯酶试剂盒和改良的 Ellmans 比色法测定了 乙酰胆碱酯酶的活力，检测了芥子碱对大鼠血清和脑匀浆乙酰胆碱酯酶的抑制 作用，结果发现芥子碱能明显抑制大鼠大脑匀浆乙酰胆碱酯酶的活力，而对血 浆乙酰胆碱酯酶活性的抑制相对较弱，说明了芥子碱有可能作为中枢乙酰胆碱 酯酶抑制剂具防治 A D 的应用前景。张蓝江等选择了 AD 患者和健康老年人的 血清，采用了改良的 Ellmans 比色法分别测定了血浆中乙酰胆碱酯酶及丁酰胆 碱酯（BuCh ）的活性，并进行相关比较分析，得出了血浆中 AChE 及 BuCh 活 性的测定可作为 AD 的一种辅助诊断指标。刘佳莉等 24利用改良的 Ellmans 法， 分别以电鳗、人源红细胞、大鼠海马区和纹状体匀浆液中的 AChE 为酶源，检 测了他克林和石杉碱甲对不同酶源 AChE 的抑制作用，同时对植物提取物样品 的 AChE 抑制作用也进行了检测，为新药发现阶段乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选 提供了经济快速的微量筛选方法。陈军辉等 25以氨基化硅胶(APS-Si)微球为载 体，对 AChE 进行了交联固定化，以改进的 Ellmans 法测得了能重复使用的固 定化 AChE 的活性，同时研究了 AChE 的最佳固定化条件和固定化酶的性质， 为天然产物复杂体系中乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选新方法的发展奠定了基础。然 而，Ellmans 法会被自身的低敏感度所限制，导致一些错误的结果。 4.2 薄层色谱生物自显影法 薄层色谱生物自显影法是在 Ellmans 法和色谱分离法基础上建立的。它的 原理主要是：溶解后的提取物点养育博层板，用适量的溶剂使得提取物中的化 学成分子薄层板上分离。底物在乙酰胆碱酯酶的存在下发生水解反应，接着生 成胆碱和显色剂 DTNB 迅速作用，产生黄色化合物，具有酶抑制剂活性的化合 物将显示出白色的斑点。由于 20-30min 以后，结果会自动消失，所以该反应现 象一般应在 15min 以内观察完毕 26。该方法的优点是操作简单，不需要特殊的 9 仪器设备且分析成本低等。但是，它也有一定的局限性，如：误差大、容易出 现假阴性结果、不能反映被筛选物质的生物活性和显色剂缺乏专属性等。 薄层色谱生物自显影法集鉴定、分离和活性检测于一体，可用于药物的筛 选。有研究员就是采用薄层色谱生物自显影法筛选了浙江天台产乌药等物质中 的天然抗氧化活性物。同时，薄层色谱生物自显影也可以对具有胆碱酯酶抑制 活性的化合物进行筛选。另外，有的研究人员采用薄层色谱生物自显影法检测 了利用微生物发酵制成的一种传统调味品豆豉中的乙酰胆碱酯酶抑制剂。 结果显示与微孔板法相比，薄层色谱生物自显影法最终检出所需试剂量却更少， 采用薄层色谱生物自显影法检测豆豉中乙酰胆碱酯酶抑制剂是一个快捷、简便、 高效的方法。除此之外，还有许多研究员也研究了利用该方法提取乙酰胆碱酯 酶抑制剂，并且达到很好的效果。 4.3 荧光显色法 用荧光显色法检测乙酰胆碱活性的灵敏度一般要比用比色法检测的灵敏度 高出几个数量级。该方法的原理是利用无荧光的底物被乙酰胆碱酯酶水解后产 生有荧光的物质进行检测。常被乙酰胆碱酯酶水解后产生荧光的底物有试卤灵 酯、吲哚乙酸酯、1-甲基- 7-乙酰基喹啉、 或 -乙酸萘酯等。荧光显色法灵敏 度高，可应用于天然产物的检测，但是该方法的稳定性不是太好 27。有人采用 热水偏磷酸提取了水果中叶酸，用荧光显色法测定了提取出的叶酸含量，并以 正交试验设计方法对提取分离条件进行优化，详细研究了果蔬中叶酸的提取分 离和方法的测定。荧光显色法也可以用于乙酰胆碱酯酶的检测，如：利用荧光 燃料与反应生成物结合产生荧光来检测乙酰胆碱酯酶，为荧光显色法检测乙酰 胆碱酯酶奠定基础。 4.4 液相色谱及液相色谱质谱联用技术 高效液相色谱法（HPLC ）是近代发展起来的一项分析分离技术。该方法采 用高压输送流动相，分离效能高的固定相及高灵敏度的检测器，实现试样的分 离。该方法具有高效、高速、高灵敏度等优点，但该法对仪器设置要求较高， 且对操作人员也有一定的要求 28。HPLC 具有高效分离和成分分析的功能，在 医药、食品、化工等行业中广泛应用。赵仁邦等 29用 HPLC 测定了枣样品中的 单糖和木糖，结果表明，用 HPLC 测定枣中的糖类物质分离纯度高、重现性好 且易于识别。 超高效液相色谱（UPLC）采用小颗粒填料色谱柱、快速检测手段及超高压 系统的新型液相色谱技术，该法具有高柱效、高分离度、高灵敏度和分析周期 短等优点，为复杂体系的分离分析提供了良好的平台，为代谢组学、蛋白组学 的研究提供了方便的条件 30。现已经广泛的应用与农药残留检测、水质和环境 检测、化妆品质量控制等各个领域。刘少华等 31利用 UPLC 技术，对农药丹参 粗提物成分进行指纹图谱研究，并进行方法学考察，为丹参药材质量控制奠定 了研究基础。同样，也有一些研究人员用 UPLC 测定了蔬菜中氨基甲酸酯类农 药残留，结果显示，该方法可满足蔬菜中多种氨基甲酸酯类农药残留量的测定， 即乙酰胆碱酯酶抑制剂的测定。 高效液相色谱-质谱法联用技术以高效液相色谱为分离手段，以质谱为鉴定 工具，以其灵敏、快速的特点，在对含量低、不易分离得到或缺乏特征紫外吸 收的物质的分析中显示出了独特的优势。HPLC-MS 联用技术集 HPLC 的高分 离与 MS 的高灵敏度，在含量低、难分离化合物中有显著地优势，该技术将高 效液相色谱对复杂样品的高分离能力与质谱技术的高灵度、高灵敏度以及结构 鉴定功能成功结合，特别适用于天然产物复杂基质中化学成分的分离分析，成 为应用广泛、潜能巨大的分离分析技术 32。目前，HPLC-MS 联用技术已广泛 应用于农药、中草药、天然产物中活性成分的分离以及筛选。史倩 33等采用该 技术对龙须菜特征峰进行快速分析，获得特征峰的质谱信息，实现了共有峰和 特征峰的准确定位。陈军辉等 34采用高效毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱联用 技术，得到了黄连中生物碱类化合物的色谱峰紫外光谱和质谱，进而得出生物 碱类化合物的精确分子量。表明该法可对黄连中生物碱类化合物进行快里、鉴 定。王虹等 35建立了基于高效液相色谱-大气压化学电离质谱法检测茶叶中茶氨 酸含量的新方法。结果表明，该方法重现性好、灵敏度高、可用于微量茶氨酸 的快速检测。Jone 等 36建立了用高效液相色谱-质谱联用技术在天然产物中筛选 乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过测定产物的减少值来确定乙酰胆碱酯酶抑制剂的量。 同时，测定加兰他敏、石杉碱甲 A 等的 IC50 值，结果表明水仙的粗提物对乙酰 胆碱酯酶也有一定的抑制活性。 11 5. 总结 乙酰胆碱酯酶抑制剂仍然是目前临床上应用最广泛、研究最多的治疗 AD 的一类药物，但是有些应用于临床的乙酰胆碱酯酶抑制剂多半存在半衰期短、 较严重的外周胆碱能系统副作用，当一些副作用较大的乙酰胆碱酯酶抑制剂在 早期被作为杀虫剂和 AD 治疗使用后，在最近几十年内，寻找新的乙酰胆碱酯 酶抑制剂成为医药研究的热点。大量研究表明：天然植物中药用成分具有疗效 好，副作用小，作用面广，适宜长期服用等优点；同时，天然产物化学成分复 杂，含有大量结构新颖、功能独特的次生代谢产物，因此，是研究发现乙酰胆 碱酯酶抑制剂的宝贵资源。随着科学技术的不断创新，科学仪器的不断更新， 以及一种又一种新结构和作用机制的乙酰胆碱酯酶抑制剂的发现，同时，对 AD 的进一步了解，相信战胜 AD 指日可待。 参考文献 1 沈来凤. 老年痴呆症的研究进展. 现代医药卫生, 2010, 26(4): 542-544. 2 李前, 朱振霞 , 孙曼霁. 乙酰胆碱酯酶与老年性痴呆关系的研究进展J. 中 国老年学志, 2002, 22(4): 325-326. 3 刘艳玲, 李奴英. 乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗老年痴呆症的研究进展J. 山西 医药杂志, 2008, 37(1): 64-66. 4 李前, 朱振霞 , 孙曼霁. 乙酰胆碱酯酶与老年性痴呆关系的研究进展J. 中 国老年学杂志, 2002, 22(4): 325-326. 5 Bernd Ibach, Ekkehard Haen. 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