人源化单克隆抗体的研究进展

论人源化单克隆抗体的研究进展 * （生物工程一班 生命科学学院 *大学 哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治 疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工 程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单 克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体 人源化 临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress * (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, * University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合， 形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖 ，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术 1，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应 用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于 B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功 2，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医 药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克 隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应 3，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人 体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性 单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免 HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生 物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一些技术突破，如用 PCR 方法扩增抗体可变区基因、大肠杆菌表达功能性抗体片段以及噬菌体展示抗体 功能片段等，这些技术为抗体人源化和人抗体的研究奠定了基础。 1、人源化单克隆抗体的构建 鼠抗体人源化的构建就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极 其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导 HAMA 反应。当用人的序列代替鼠的框架时，其氨基酸残基的接触作用发生改变，进 而影响鼠抗体互补决定区 ( Complementaritydeterm ining re ign, CDRs)的空间构型而使其抗原亲和力降低或消失 4。人源化单克隆抗体的构建经 历了非人源抗体、人- 鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体等的先后发展，最终制备全人源化单 抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库。 1.1、嵌合抗体 20 世纪 80 年代中期开始研制的第一代人源化抗体, 即简单的嵌合抗体, 是利用 DNA 重组技术将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体 中, 转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体 , 其人源化程度达到 70% 左右。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性, 又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。“Rituximab” 作为第一个用于肿瘤治疗的 基因工程抗体, 就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区( V) 约占整个抗体的30% , 鼠源性抗体 V 区中的框架区 ( FR) 仍残留一定的免疫原性, 可诱发 HAMA 反应 5。虽然嵌合抗体仍有 30%左右的鼠源性成分，但 90%的 HAMA 反应是针对抗体恒定区的 6。为了降低在嵌合抗体中鼠源部分 , 只移植鼠抗体互补决定区 ( Complementaritydetermining reign, CDRs), 而不移植整个抗体可变区, 所构建的“嵌合”抗体随后就成为了研究热点。 1.2、CDR 移植的人源化抗体 由于鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体，即鼠源单抗上六个 CDR 通过 PCR 等方法克隆到人抗体相应的框架区(FR) 上构建成新抗体。与嵌合抗体相比, CDR 移植进一步减少了抗体中异源序列的含量, 降低了抗体异源性, 其人源性可达 90% 以上 7。但对于特定的抗原分子来讲，FR 并不是可以随意替代的。具有支持作用的 FR 不仅为 CDR 的构象提供了环境, 有时还参与抗体结合位点正确构象的形成, 甚至参与抗原的结合。因此, 简单 CDR 移植到人抗体FR而忽略某些关键位点的氨基酸残基，往往会明显降低抗原- 抗体反应的亲和力, 甚至丧失与抗原结合的能力 8。多数情况下, 仅仅移植 CDRs到人抗体FR 上产生的改型抗体将丧失全部或大部分抗原亲和力, 只有同时再移植某些关键位点的氨基酸残基后才能保持改型抗体的抗原亲和力 。 所以，在抗体重构试验中, 识别人源抗体框架区中影响 CDR构象的氨基酸残基位点非常关键。近年来人们利用抗体基因库，通过对抗 原-抗体相互作用的计算机模拟, 并分析氨基酸残基、CDR的几何距离和分子间氢键作用力, 可以推测出这些关键氨基酸残基的位点, 指导抗体重构试验。袁清安等 9对肝细胞癌特异性抗体HAb52可变区进行了同 源模建，然后分析决定CDR初始构象的可能残基，对所有的暴露残基都进行人 源化，改构后的抗体的免疫原性明显地降。 尽管人源化单克隆抗体人源化程度达到 70%左右, 在抗原特异性和亲和力方面都较好地保留了亲代抗体的特征, 而免疫原性则降低至 12%左右, 在体内的半衰期和效应功能也更加接近于人抗体。但由于人源化单克隆抗体( 嵌合或 CDR 移植抗体) 内还含有 10%30%的鼠源蛋白, 因而在临床应用时, 或多或少地存在一些免疫排斥反应, 没有达到治疗性抗体发展的最终目标 抗体完全人源化。 1.3、全人源化抗体 全人源化抗体是治疗性抗体的发展趋势，随着抗体工程的快速发展，目前 生产全人抗体的方法已达到比较成熟的阶段, 主要包括抗体库技术和转基因小鼠技术 10。 抗 体 库 技 术 主 要 是 将 抗 体 重 链 可 变 区 ( V H ) 和 轻 链 可 变 区 ( V L ) 基 因 与 噬 菌 体 的 外 壳 蛋 白 ( P ) 或 外 壳 蛋 白 ( P ) 基 因 随 机 重 组 , 继 而 感 染 大 肠 杆 菌 , 经 增 殖 并 在 噬 菌 体 表 面 以 抗 体 片 段 Fab或 ScFv- 外 壳 蛋 白 融 合 蛋 白 的 形 式 表 达 11， 从 而 获 得 相 应 的 特 异 性 抗 体 。 抗体库技术 的发展使体外不经过免疫获得抗体成为可能，即用 PCR 技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列, 克隆到噬菌体载体上, 并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面, 用固相化抗原 ,通过反复吸附- 洗脱- 扩增的过程, 从而筛选出特异性PhAb片段 12。此项技术不仅可以获得具有人体性质的单克隆 抗体, 而且利用抗原可直接从抗体库中筛选出所需基因, 而不需要细胞融合, 甚至不需经过免疫动物, 实验周期短, 过程较简单, 这是人源抗体制备技术的重大突破。此 外 ， 由 于 细 菌 细 胞 增 殖 快 ， 培 养 成 本 低 廉 ， 利 于 大 量 制 备 高 纯 度 抗 体 ， 进 行 蛋 白 晶 体 结 构 研 究 和 应 用 。 因 此 ， 抗 体 库 技 术 将 对 生 物 学 和 医 学 的 发 展 起 着 重 要 的 推 动 作 用 。 另一条生产人源化单克隆抗体的途径是通过基因敲除技术, 使小鼠自身的基因失活, 并导入新基因, 创造出携带人抗体重轻链基因簇的转基因小鼠。这种转入抗体基因的小鼠所携 带的人DNA片段具有完备的功能, 可有效地进行同种型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠， 使其产生高亲和力的人抗体。该领域的最新进展是所谓“转染色体小鼠”的产 生。这种小鼠携带人微小染色体, 即从人14及2号染色体上分离的含有全部人抗体重轻链胚系基因簇(包括所有的V 、D、J 片段和抗体恒定区) 的染色体片段。这种携带微染色体的小鼠能够提供几乎完全相同的人免疫球蛋 白基因环境并在鼠体内精确的重现了人抗体的产生过程。另外, 利用该技术还获得了抗表皮生长因子受体(EGRF) 、TNF-、CD4 等的完全人抗体 13。 2、人源化单克隆抗体的临床应用 近十几年来，随着分子生物学技术和抗体工程技术的快速发展，人源化抗体和 人抗体的出现为临床应用带来了新的希望。当前正处于临床研究的多种抗体中 ，嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于70% 14。目前的人源化抗体主要用于肿 瘤、自身免疫性疾病的治疗以及抗病毒感染等临床治疗。 2.1、在肿瘤治疗方面的应用 人源化单克隆抗体的研制的主要任务之一就是治疗肿瘤疾病，人源化抗体 药物是针对那些与肿瘤发生、发展相关的靶分子，这些靶分子在正常组织或细 胞中就存在一定的表达，但在许多肿瘤细胞中过度表达，因此可作为肿瘤特异 的标志物。如Herceptin是 1998年9月被FDA批准上市的人源化IgG1单抗，用于转 移性乳腺癌的治疗，其靶向抗原为人类表皮生长因子受体- 2( HER- 2)。Colomer等 15试验表明， HER- 2 在乳腺癌细胞表面的过表达与细胞的恶性转化相关，使其成为肿瘤治疗的靶点 。另据 Bucbler 等 16报道，Herceptin还可用于胰腺癌的治疗，Herceptin 对与高表达HER- 2抗原的胰腺癌细胞有抑制生长作用。Campath是一个由大鼠抗CD52 抗体Campa th- 1G经CDR 移植改造成的人源化抗体, 靶向抗原是在大多数正常和恶性成熟淋巴细胞膜表面高表达的CD52 抗原。2001年5月7日美国 FDA 正式批准其上市，用于传统治疗无效的慢性淋巴细胞白血病(CLL) 17。表 1概括了近年来美国 FDA 批准上市的 5 种治疗肿瘤的单克隆抗体药物的基本情况 18。 2.2、在自身免疫性疾病方面的应用 近十几年来, 单克隆抗体治疗自身免疫性疾病已成为研究热点，这些单克隆抗体通过不同的 机制发挥作用, 包括结合可溶性细胞因子和生长因子, 调节受体和受体信号, 以及通过抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用、抗体介导的细胞吞噬作用、补体 依赖的细胞毒作用耗竭异常的免疫细胞及介导细胞信号等 19。在自身免疫疾病 的治疗过程中，单克隆抗体药物通过清除激活的细胞，阻滞其功能，或将升高 的促炎细胞因子水平降至正常水平而抑制过度的免疫病理学反应。目前，美国 已将抗肿瘤坏死因子的嵌合mAb( inflixi mAb) 和人源化 mAb CDP571 用于克隆病(Crohns disease, CD) 和类风湿关节炎 ( rheumatoidarthr itis, RA ) 的临床研究，InfliximAb 是由美国 Johnson和 Centocor 联合开发的嵌合型抗 TNF- 单抗，能够有效地改善CD和有瘘管并发症的CD 病情 20。 2.3、在抗病毒感染方面的应用 预防病毒病主要以病毒疫苗为主, 而病毒病的治疗则主要以特异性抗病毒抗体为主。特异性抗体在病毒感染早期 和从感染靶细胞释放出病毒时期是重要的防御屏障, 因为在此期间, 病毒处于细胞之外, 抗体可与之结合, 抗体主要通过中和、调理作用、补体激活及抗体依赖性的细胞介导的溶细胞效 应等途径发挥作用 21。人类呼吸道合胞病毒(RSV )是全世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，至今没有特异性治疗方法 22。目前，在预防呼吸道合胞病毒感染过程中, 具有中和活性单克隆抗体具有用量少、特异性高及半衰期与人自身抗体相当的 特点, 并可减少了通过血液传播疾病的因素。因此，应用单克隆抗体被动免疫是RSV 易患者的有效预防方法。 3、展望 全人源化单克隆抗体是治疗性抗体的发展趋势，不仅具有较长的半衰期， 低免疫原性，还能与天然效应因子相互作用。因此，人源化抗体和人抗体的出 现为治疗性抗体的广泛应用带来了新的希望, 但人源化抗体是否可以解决鼠抗体临床应用中出现的所有问题, 还有待大量临床试验的检验。随着分子生物学技术的发展, 尤其是鼠抗体人源化技术、抗体库技术、转基因技术的迅速发展, 以及对疾病的机理不断深入研究, 人源化单克隆抗体在临床应用中将会更加广泛。 参考文献 1 邢海权,闫梦菲 ,赫晓燕. 单克隆抗体的研究进展.畜牧兽医科技信息,2011,7:1-2. 2 J Wong, Reiko F, et al. 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