全自动生化仪参数设置

自动生化分析仪的分析参数设置 自动生化分析仪是一种把生化分析中的取样、加试剂、去干扰物、混合、恒温反应、 自动监测、数据处理以及实验后清洗等步骤进行自动化操作的仪器，它完全模仿并代替了 手工操作，目前已经成为医疗机构进行临床诊断所必可不少的仪器之一。它的应用大大提 高了生化检验的准确性、精密度和工作效率，适应了临床医学发展对检验医学的要求，然 而这一切不仅需要生化分析仪的技术基础，也需要仪器内每个项目都有一组最优化的分析 参数。并且目前大多数生化分析仪为开放式，封闭式的仪器一般也会另外留一些检测项目 的空白通道由用户自己设定分析参数，因此我们有必要了解生化分析仪各个分析参数的基 本含义以及设置方法。 1.试验名称 常以项目的英文缩写来设置，如总蛋白设置为 TP，白蛋白设置为 ALB 等。 2.方法类型 生化分析仪常用的方法有终点法、连续监测法、比浊法等，根据被检物质的检 测原理等选择其中一种分析方法。 2.1 终点法 又称为平衡法，是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收 强度的大小对物质进行定量分析的一类方法，有一点终点法和两点终点法两类。一点终点 法的特点是使用一种或两种试剂，当待测物与试剂反应达到终点时，测定混合溶液的吸光 度来计算待测物的浓度，该法常用的有总蛋白双缩脲法、白蛋白溴甲酚绿法、葡萄糖氧化 酶法等，手工操作的大多数方法都是一点终点法。两点终点法也称固定时间法，如果是单 试剂分析，当测定波长同干扰物质的吸收光谱有重叠时，通过选用两点终点法可消除样品 空白引起的干扰，其分析过程是在样品与试剂混合后经过一段延滞期读取一个点 A1，一定 时间后再读取 A2，然后比较标准和测定的 A （A=A 2-A1）值，求得待测物的浓度。肌 酐苦味酸法就是一个典型的单试剂两点法的例子。如果是双试剂分析，选用二点终点分析 法除了可消除样品空白引起的干扰外，还可消除内源性干扰物质的干扰，其分析过程是加 入试剂 1 后读取 A1，加入试剂 2 后读取 A2，A 1 相当于读出样品空白值，A 2 才是实际呈色 反应，然后比较标准和测定的 A （A=A 2-A1）值，求得待测物的浓度。为了提高终点 法检测的准确性，选择该法时应设置终点法零点读数、样品空白等两个分析参数，前者是 在反应前即开始读数，可以扣除反应前试剂和样品混合液的空白读数；后者是样品加空白 试剂所得到的吸光度，反应需要占用一个比色杯。 2.2 连续监测法 又称动态分析法、速率法等，基本原理是在酶促反应的最适条件下，用物 理、化学或酶促反应的分析方法，在反应速度恒定期（零级反应期）内连续观察和记录一 定反应时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速度计算出酶活力的大小和代谢 物的浓度。具体方法有两点速率法和多点速率法：两点速率法是通过观察在零级反应期内 两个时间点的吸光度，用两个点的吸光度的差值（A ）除以时间（分） ，计算出每分钟的 吸光度变化值；多点速率法是在零级反应期内每隔一定时间（2-30s)进行一次监测，连续 监测多次，求出单位时间内的反应速度，这种方法又可分为最小二乘法、多点 法、回归 法、带速率时间法等。该法具有明显的优点就是大大提高了分析速度和准确性，主要适用 于酶活性及其代谢产物的测定。在连续监测法过程中，即使不加样品，试剂中的底物也会 自动降解得到一个结果，因此应设置试剂空白速率，不同批号试剂的试剂空白速率不一样， 其值为以水代样品测得的项目结果，样品测定结果应扣除试剂空白速率的数值。 2.3 比浊法 自动生化分析仪一般只能做透射免疫比浊分析，当光线通过一定体积的含免疫 复合物的溶液时，由于溶液中存在的抗原-抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射 光的减少，测定的光通量和抗原抗体复合物的量成反比。它常用于终点法测定，目前主要 用于血清特种蛋白的检测，如载脂蛋白、微量蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白以及 某些药物监测等。但是如果样品中待测抗原浓度过高，抗原与抗体形成的免疫复合物分子 将会变小，而且易发生解离，使浊度反而下降，因此免疫比浊分析过程中必须设置前区检 查，比较分析过程中后两个读数点的差别，如果后一点比前一点的吸光度低，则表示抗原 已过剩，应将样品稀释后重测。 3.反应温度 自动生化分析仪通过温度控制系统保持温度恒定，以保证反应的正常进行， 其保持恒温的方式有三种：干式恒温器加热、水浴式循环加热、恒温器循环间接加热。恒 温控制器可以对 25、30、37三种温度进行恒温，根据需要可以任意选择，半自动生 化分析仪恒温器属于这种。全自动生化分析仪的温度控制器一般只能控制 37一种温度， 少数也可以控制 30和 37两种温度。 4.反应波长 当测定体系中只有一种组分或混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的 吸收波长无重叠时，可选用单波长，如果待测物质有几个吸收峰，可选用吸光度最大的一 个波长，或者选择在吸收峰处吸光度随波长变化较小的某个波长。当被检溶液混浊或存在 较多的干扰物质时，测定过程中会出现光散射和非特异性光吸收，从而影响测定结果的准 确性，此时可用双波长甚至多波长测定，以提高测定结果的准确性，而在实际应用中选择 辅助波长主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。由于脂质、血红蛋白、胆红素在较宽的 波长范围内有较强的光吸收，常常同测定波长有重叠，此时测得的吸光度包含待测物质的 吸光度和干扰物质的吸光度，因此必须选用合适的辅助波长来消除干扰物质的吸光度。辅 助波长的设置原则是根据测定波长选择辅助波长，要求干扰物质在测定波长同辅助波长有 相同的吸光度。 5.反应方向 有正向反应和负向反应两种，反应过程中吸光度增加为正向反应，吸光度下降 为负向反应。 6.样品量与试剂量 样品与试剂量的确定一般按照试剂说明书上的比例，并结合仪器的特性 进行设置，亦可根据手工法按比例缩减或重新设计，但要考虑到检测灵敏度、线性范围， 尽可能将样品稀释倍数大些，以降低样品中其他成分的影响。在样品与试剂量的设置过程 中主要应注意以下几个方面：稀释水量，添加样品稀释水的是为了洗出粘附在采样针内 壁上的微量血清，减少加样误差，添加试剂稀释水是为了避免试剂间的交叉污染，两种稀 释水的量应在复溶试剂时按比例扣除。如果采用液体试剂盒时因不再用水，无法扣除稀释 水量，所以两种稀释水应尽量减少，以免试剂被过量稀释。最小样品量，即分析仪进样 针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量，随着技术的不断改进，仪器的最小样品量逐 渐减小，目前有少至 1.6l的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需 采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使仪器的检测范围上限得以扩大。总反应 容量，在不同的分析仪有一个不同的规定范围，在设置的时候样品量和试剂量之和不能超 过这一范围。该值受仪器的光路系统所影响，直射式光路由于光束较宽，难于减少所测试 反应液体积，集束式光路则是通过一个透镜使光束变窄，可检测低至 180l的反应液混合 体，近年来又出现了点光源技术，它的光束更小，照射到样品杯时仅为一个点，可使反应 液的量降至 120l。试剂量/样品量比值，不要为节省试剂而过分地减少试剂用量，因为 在终点比色法中，缩小试剂量/样品量比值会降低线性范围，遇高浓度样本会因试剂量不足 而使结果偏低。 7.分析时间 分析时间包括孵育时间、延迟时间、监测时间等，选择不同的分析方法应选 择相应的分析时间。 7.1 孵育时间 选择终点法时设置，在一点终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的 时间，在两点终点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。在设 置孵育时间时，有些分析方法要特别注意，如选择溴甲酚绿法测定血清白蛋白时，由于血 清中 1-球蛋白、转铁蛋白等也可与溴甲酚绿呈色，尽管其反应速率较白蛋白为慢，但是 实际上当血清与白蛋白混合时， “慢反应”已经发生，因此为减少非特异性结合反应，应在 溴甲酚绿与血清混合后 30s 读取吸光度。当选择酶法的 Trinder 反应测定葡萄糖、总胆固醇、 甘油三酯时，由于 37酶反应较慢，因此必须测定这些酶试剂反应达到终点的时间，自动 分析仪用试剂盒一般可以在全部加样后 5 分钟内反应完全，所以应选择分析仪的最大反应 时间。 7.2 延迟时间 选择连续监测法或两点终点法时设置，即在样品与反应试剂（第二试剂）混 匀开始至第一个吸光度选择点之间的时间。在连续监测法过程中，当酶与底物混合后需要 一定的时间让酶激活，直至线性反应期才能开始监测，有的项目需要用工具酶将内源性代 谢产物耗尽，消除干扰。一般单试剂法只需要 30s，常用项目中谷氨酸氨基转移酶、天冬 氨酸氨基转移酶需要特别注意，但是对于双底物反应或需要辅酶参与者，通常为 1-3min。 7.3 监测时间 酶促反应延滞期后，在过量底物的存在下，反应速率加快并达到稳定的阶段， 即酶促反应以恒定的速率进行，不受底物浓度的影响，这段时间称为线性反应期或零级反 应期，自动生化分析仪的监测时间即为此期。连续监测法在零级反应期至少应监测 90-120s 或至少 4 点（3 个 A） ，少于 3 个 A 不能称为连续监测法，因为不能计算线性度；监测 时间过长则容易发生底物耗尽，可测范围变窄。 8.计算因子（F 值）和实测 F 值 用连续监测法进行酶活性测定时，不需作标准管或标准曲 线，根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。先测定在线性范围内每分钟吸光度 的变化（A/min） ，以 U/L 代表酶活性浓度时，则可按下式进行计算：/miniUL6 A V10F= vL 式中 V：反应体系总体积（ml ） ；10 6：将 mol 换算成 mol ；：摩尔吸光系数 （cm 2/mol） ； v：样品体积（ml） ；L：比色杯光径（cm） 。当条件固定时，从理论上讲 V、v 和 L 均为固 定值， 值为常数，所以 F 值是恒定的。F 值对酶的测定十分重要，过高虽然测定的线性 较宽，但重复性差，反之精密度虽好，但检测线性窄，因此应根据实际情况进行合理的设 置和应用。但是在临床实际工作中，仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小、比色 杯光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会影 响指示物的 值或上述公式中的相关项，因此应在具体仪器条件下，定期检查和实际测定 指示物的实测 值和 F 值。因为纯 NAD（P）H 溶液不稳定，所以 NAD（P）H 的 值 需用葡萄糖己糖激酶法实测，实际操作为将某一浓度的葡萄糖溶液重复 5-10 次测定，得到 相应的一组吸光度 A 值，求出 s，注意 s 必须低于规定的批内允许值，再根据下面两个A 公式分别计算出 NAD（P）H 的实测 值和 F 值：V =vCL ； 6610VFA CvL 式中 C 为标准液浓度（mol/L） 。其他一些色素源指示物在不同的介质环境中，其 值会 发生程度不等的变化，对 5-硫代 -2-硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺等这些可得到高 纯而稳定的指示物，可将其配制在一定的介质中，按临床标本用的现场试剂和仪器测定吸 光度求实测 值及 F 值。 9.线性度 是非线性比率的界线，常用%表示，其计算公式为 120%3k ， 式中：k1 为连续监测时间 2/3 内前读数时间的斜率， k2 为后 2/3 读数时间的斜率， k3 为总的斜率， 一般设置为 15%。对一些酶活性项目，可以适当放宽，当不需要设置检查界限时，设置其 为 0。线性百分数大，说明 k 之间已不成线性；超过极限值说明底物不足，检测结果会 变低，应稀释后重测。 10.底物耗尽限额 选择连续监测法或两点终点法时设置，不同型号分析仪的设计不一样， 有的为零点与监测第一点吸光度的差额，有的为吸光度上升或下降至指定吸光度（MAX- OD/MIN-OD）的数值。超过限额说明样品的酶活性非常高，底物消耗太快，在仪器程序规 定的线性反应期内吸光度的变化往往不代表真正的酶活力，导致结果偏低，该样品应稀释 一定的倍数重新测定。此参数对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要，下面以丙氨酸 氨基转移酶为例简述设置 MIN-OD 的步骤，选择一份高活性酶的混合血清，用生理盐水稀 释，得到一组从低浓度至高浓度的丙氨酸氨基转移酶溶液；把这一组溶液按仪器设定的程 序进行测定，并打印出反应曲线；从曲线中可以发现当酶活力达到一定临界浓度时，该临 界浓度的反应曲线在连续监测时间内成线性，但是在监测时间后成非线性，即连续监测时 间的最后一个读数点正好是线性与非线性的临界点，所以该点的吸光度是在连续监测时间 内酶促反应没有发生底物耗尽时所能达到的最小吸光度值，这个最小吸光度值也就是 MIN- OD。当酶活力高于上述临界浓度时，反应曲线在连续监测期内已不呈线性反应，有些仪器 自动选择弹性速率功能，能自动选择反应曲线上连续监测期内仍呈线性的吸光度数据计算 结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大，可以减少稀释及重测次数、降低成本。 11.试剂吸光度上限、下限 试剂吸光度上限为正向反应用，可参考试剂盒说明书数值折算 成所用比色杯的光径。如试剂盒要求上限为 0.4，比色杯光径 0.6cm，则试剂吸光度上限设 置为 0.24。试剂吸光度下限为负向反应用，设置法同试剂吸光度上限。每种试剂都有一定 的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质，此时应更换合格试 剂。 12.线性范围