分子生物学在内科领域的应用

分子生物学在内科领域的应用 近年来分子生物学的若干进展 人类基因组计划 蛋白质组计划（proteome） 转基因技术的发展与应用：为生命科学的研究与发展提供了一个前景广阔的应用平台。 1.促进生长 2.刺激肌肉发育 3.促进产毛 4.生产药物 5.抗病育种 6. 组织器官移植 7. 动物生物反应器 8. 英国培育出转基因羊可产人体血清白蛋白 基因诊断：高通量、高质量、快速、同步检测。 PCR， 基因芯片、时空优越性、在基础研究的基础上水平逐渐提高、应用越来越广泛 基因治疗： 任重而道远 基因治疗爱滋病的曙光、基因治疗帮助盲狗恢复了视力、基因治疗可望取代骨髓移植、试管婴儿经 基因治疗培育无癌娃娃、战胜流行病魔的尚方宝剑-基因工程疫苗、治疗性克隆获得进展、基因疫苗- -防治疾病的新武器 基因工程制药 份额越来越大 干细胞 世界首例成人神经干细胞自体移植成功（复旦大学附属华山医院） 胚胎性干细胞定向诱导分化-新崛起的细胞工程 干细胞帮助瘫痪小鼠行走 肠细胞移植至脊髓可使脊椎神经重生 单核苷酸多态性（SNP） 克隆（clone ）技术 端粒、端粒酶分子生物学研究进展 RNA 干扰技术 RNA 干扰（RNA interference ，RNAi）是指导入针对目标基因的特异性同源双链 RNA 引起目标基因的不 表达或减效表达. RNAi 在自然界中的作用? 生物体内的双链 RNA 可来自于 RNA 病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的 双链 RNA 诱发了细胞内的 RNAi 机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表 达被阻断，保护细胞免受影响。 参与 RNAi 反应的酶 RNA 酶是一种能切割双链 RNA 的酶，参与 RNAi 反应的 Dicer 酶是 RNA 酶家族的一个成员。 Dicer 酶广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物体内。 它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个 RNA 酶结构域，一个双链 RNA 结合位点。 在 Dicer 酶的作用下，双链 RNA 被裂解成 21 到 23 个核苷酸的片断，称为 siRNA（short interference RNA） ，它启动了细胞内的 RNAi 反应。 RdRP(RNA dependent RNA polymerase) 由于少量的双链 RNA 就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细 胞内存在 RNAi 效应的扩增系统。 在真核细胞中也存在能以 RNA 为模板指导 RNA 合成的聚合酶（RdRP ） 。 使异常的 RNA 转变为 dsRNA 扩增 dsRNA 或 siRNA 在 RdRP 的作用下，进入细胞内的双链 RNA 通过类似于 PCR 的反应过程，呈指数级的数量扩增。 但是目前认为这个现象并不存在于哺乳动物细胞中。 RNAi 的优势 dsRNA 作为干预对象 (稳定) 高度特异 作用力强 (少量 dsRNA 即可发挥) 在离开导入部位的细胞和组织中 dsRNA 也可发挥干预的活性 RNAi 的应用 高通量的研究基因功能 基因敲除 基因治疗：抗肿瘤治疗、抗病毒治疗 基因表达调控 基因敲除 对于哺乳动物，RNAi 能在体外培养的细胞达到基因敲除的效果，对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会 死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用 RNAi 技术研究它的功能。 由于 RNAi 能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。 RNAi 还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用 RNAi 来阻断某些基因的表达，来研究他们 是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。 基因治疗 2 目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争。这两种方法对基因表达 的抑制都不如 RNAi 高效特异持久。 作为基因治疗的工具，RNAi 既高效特异，又简便易行。RNAi 在某个基因表达异常增高引起的疾病 中会非常有用，如病毒感染，肿瘤等。 抗病毒治疗 同 RNA 核酶、反义 RNA 等相比，RNAi 具有高度特异性，一个碱基的不同就可导致作用的显著降 低。 具有高效性，少量 siRNA 分子就能较彻底抑制细胞内相应基因的表达。 因此，RNAi 被大量应用于抗病毒的研究中去。 基因表达调控 RNAi 在 Epigenetics 中发挥重要作用。 Epigenetics 是指至少一代的基因表达的改变，而基因的编码没有改变。epigenetics 调控的一种类型是 染色体的改变。通过改变染色体的空间构型，能够决定那一个基因表达。研究发现 siRNA 在染色体 空间构型的改变中起着非常重要的作用。 RNAi 能永久的关闭基因的表达，而不仅仅是短期的抑制它。通过在发育过程中关闭或开放基因的表 达，siRNA 可能指导着细胞的定向分化。RNAi 已被证实能引导植物干细胞的分化，因而研究者认为 RNAi 也可能参与指导人的干细胞的分化。由于 RNAi 在基因表达调控中发挥重要的作用，对 RNAi 微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。 问题与展望 目前 RNAi 在非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用已经取得了很多重要的成果，但在哺乳 动物中的应用刚刚兴起。 在哺乳动物细胞中，RNAi 并不能完全阻断基因的表达，特别是表达异常高的基因。Tuschl 等人的研 究工作中，有三个基因被抑制了 90%，但有一个基因没有被抑制，这就是一个表达很高的基因。 另外，运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链 RNA 高效特异的转入体内仍是一个难题。 RNAi 的作用机制仍很不明了。 但是，RNAi 是近年来发现的一项崭新的技术，在生物研究的各方面均有十分重要的意义，已成为国 内，外研究的热点，并有望成为病毒性疾病预防和治疗的新手段。 基因诊断 一、基因诊断：高通量、高质量、快速、同步检测。 PCR， 基因芯片、时空优越性、在基础研究的基础上水平逐渐提高、应用越来越广泛 二、基因诊断的主要技术 从基因诊断的短暂发展史来看，具有代表性的技术主要有三大类：核酸分子杂交、PCR 和 DNA 芯片 技术。 （一）核酸分子杂交 原理：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程 叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定 DNA 或 RNA 序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子 杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用 较广，有 Southern 印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交） 、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。 核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的 DNA 或 RNA，以及用于检测的 DNA 或 RNA 探针。探针 标记的好坏决定检测的敏感性 （二）PCR 原理 PCR 是近年来发展起来的一种快速的 DNA 片段扩增技术，它通过分别与双链目的 DNA 序列 两个 3端互补的寡核苷酸引物，由 Taq DNA 聚合酶从 5到 3进行一系列 DNA 聚合反应，扩增 出所需要的目的 DNA。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循 环中靶 DNA 的拷贝数几乎呈几何级数增长，因此，20 次 PCR 循环将产生约一百万倍（220）的扩增 产物。这种 1985 年由 Kary Mullis 建立的方法最早在美国 Cetus 公司人类遗传学研究室应用于人- 珠 蛋白 DNA 的扩增及镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。随后迅速发展起来，将基因诊断提高到一个崭 新的阶段。 （三）DNA 芯片（DNA chip ）技术 所谓 DNA 芯片，是指利用大规模集成电路地手段控制固相合成成千上万个寡核苷酸探针，并把它们 有规律地排列在指甲大小的芯片上，然后将要研究的材料如 DNA、RNA 或 cDNA 用荧光标记后在 芯片上与探针杂交，再通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对每一个探针上 的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所需的信息。所有这些探针的合成可在一天内完成，用 于检测的时间只需要 30 分钟甚至更少，比常规方法快几十至几千倍。 三、基因诊断的优点 传统的诊断方法是先发现疾病的表型，再把基因产物即蛋白质或其抗体氨基酸序列弄清楚，运用分 子生物学技术分离到该基因，并通过测序确定突变部位。适用于已知突变与疾病的关系时，但由于 80-90%的疾病表型或生化特征不明，用此方法显然不行。基因诊断又称逆向遗传学，先找出基因变 异，再分析基因产物，最终探明生理作用和临床机制。因此基因诊断往往在疾病出现之前就可以完 分子生物学在内科领域的应用 3/3 成，在诊断时间上存在显著的优越性，有利于及时治疗。 基因诊断检查的是基因 DNA，人体所有细胞的基因变化是一致的。因此，只要抽血检测血细胞，或 检测羊水中的脱落细胞，就可以进行基因诊断。而不需要对某一特定的组织或器官进行检测。因此， 亦不受空间限制，使用十分方便。 基因诊断在遗传病和产前诊断中的应用 基因诊断在感染性疾病中的应用 癌基因和抗癌基因的诊断 肿瘤细胞多药耐药基因的检测 端粒酶活性检测 基因治疗的若干研究进展 所谓基因治疗，是指采用一定的技术和方法将目的基因导入体内以纠正基因结构和功能异常的一种治疗疾 病的方法。 包括以下四种途径： 1、与宿主细胞基因组整合； 2、通过暂时表达的产物治疗疾病（基因疗法） ； 3、封闭致病基因； 4、核酶技术。 基因治疗的两个基本策略： 1、通过基因转移，在基因组中转转入致病基因的正常等位基因并使之受基因组的正常调节进行表达； 2、通过修饰致病基因中的缺陷，使之恢复功能。 基因治疗的四种主要方法：基因修正；基因置换；基因修饰；基因失活。 基因治疗的作用：免疫调节；纠正遗传缺陷；分泌治疗性的蛋白质；封闭有害基因的表达。 基因治疗的条件：1、目的基因的获得；2、靶细胞的选择；3、目的基因导入靶细胞的方法。 基因导入受体细胞的途径：细胞学方法、物理学方法、化学方法、生物学方法 基因治疗的安全性监测及疗效评价： 安全性：1、载体；2、目的基因表达水平对机体的影响；3、靶细胞在操作过程中的污染和突变等。 疗效评价：根据不同的疾病和所采取的测略进行评价。 慢性乙型肝炎的若干免疫发病机制 DC 是目前发现的功能最强的 APC。越来越多的基础研究说明：肝炎病毒感染肝细胞后，肝炎病毒抗原成 分经肝细胞处理、加工，并表达在肝细胞膜上，受 I 型 HLA 分子限制的肝炎病毒特异性 CTL 识别肝细胞 膜上肝炎病毒抗原，诱导肝炎病毒感染的肝细胞死亡. 抗原的提呈、CTL 的致敏都需要 DC 的参与。 持续性 HBV 感染时，HBV 特异性 CTL 应答较弱或根本无应答，处于免疫耐受或免疫紊乱状态，其机理 可能与 DC 的功能低下有关。已有多项研究发现，慢