动物遗传学实验考试

实验二 果蝇遗传性状的观察 一、实验目的 观察果蝇的野生型和常见的几种突变型的主要性状，全面了解果蝇在遗传学实 验中经常涉及到的遗传性状，为今后的实验奠定基础。 二、实验材料 品系名称 基因符合 表现型 野生型 + 红眼，直刚毛，长翅，灰身 白 眼 w 白眼 残 翅 vg 翅残缺，不能飞 卷刚毛 sn 刚毛卷曲 黑檀体 e 体乌木色，黑亮 棒 眼 B 眼棒状，小眼数少 小形翅 m 翅小，与腹部等长 黄 体 y 体呈浅黄色 果蝇的突变型影响部位 突变名称 基因符号 性状特征 染色 体号数 翅形 残翅 vg 翅退化 小翅 m 翅小 (X) 勺状翅 nub2 翅小似勺 翘翅 cy 翅后翻 眼 白眼 w 复眼白色 (X) 棒眼 B 复眼棒状 体色 黑檀体 e 体色黑亮 黑体 b 体色黑 黄体 y 体色浅橙黄色 刚毛 焦刚毛 sn3 刚毛卷曲 叉刚毛 f 刚毛近中部分叉 三、实验器具及试剂 1、器具 显微镜；放大镜；麻醉瓶；镊子；白瓷板；毛笔；吸水纸；果蝇瓶；棉花； 死蝇盛留器。 2 2、药品 乙醚。 四、实验内容 1、野 生型果蝇基本特征 的观察 野生型果蝇是指 没有发生任何基因 突变的果蝇品系， 它具有红眼、直刚 毛、长翅、灰身等 特征，并且已经对 其相对应基因进行 了定位，常常作为 果蝇杂交的亲本。 2、突变型果蝇的突 变性状观察 突变型果蝇与正常型野生型有明显的区别。果蝇的突变性状很多，已经育 成许多纯合性的突变系。根据已知定位的基因，可选用适当的品系进行杂交遗 传试验，观察和统计杂交后代的性状表现，从而验证遗传的基本规律。 五、作业描述所观察到的野生型和突变型果蝇的相对特征。 实验三 果蝇唾腺染色体压片及观察 一、实验目的 1.练习取出果蝇等幼虫唾腺的技术和制作唾腺染色体标本的方法。 2.根据唾腺染色体上带纹的形态和排列识别不同的染色体，也是进一步研究和 鉴别果蝇染色体结构变异的有用方法之一。 二、实验原理 1.果蝇的唾腺细胞中 8 条染色体之间以着丝粒相互连结在一起形成染色盘或异 染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色 较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的 5 条染色体臂。 2.在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同的横纹，被称为明带和暗带，这些 横纹的位置、宽窄、数目都具有物种的特异性，不同物种，不同染色体的不同 部位形态和位置是固定的 3.因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹的特征能准确识别各条染 色体。 4.在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的界旋、膨大形成的疏松区和巴 尔比尼环，其富含转录出来的 RNA ，因此不着色，是基因活动的区域。在个 体发育的不同阶段，疏松区或巴尔比尼环在染色体上出现的部位不同，因此可 以研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。 三、所需药品及材料 三龄幼虫，0.7%生理盐水，1MHCl，改良品红，解剖镜，牙签，吸水 纸。 四、实验步骤：解剖唾腺转到载玻片上加 1M HCl 酸解 1min 吸去 HCl 水洗醋酸洋红染色 10min 盖片、压片镜检. 1.把载坡片放于解剖镜载物台上(用黑背景)加上滴生理盐水，把果蝇三龄幼虫 突变性状 果蝇部 分突变性状 基因符合 性状特征 小 翅 M 翅膀小，长度不超过身体 白 眼 W 复眼白眼 黑 檀 体 E 身体呈乌木色，黑亮 黄 体 Y 全身呈浅橙黄色 残 翅 Vg 翅明显退化，部分残缺，不能飞 叉 毛 f 毛和刚毛分叉且弯曲 3 移入其中，左手持解剖针按住幼虫前端 13 处固定幼虫，右手持另一解剖针按 住幼虫头部，果断、快速、有力地向右拉，把虫体前端扯断，唾腺随之露出。 唾腺呈半透明，球棒状，前端较细，后端粗钝，有时成对粘在一起成“V” 字型， 其外侧有时附有乳白或淡黄色的脂肪， 此时应保留唾腺形态的完整，因为食道和肠管也是半透明的，如果唾腺 不完整，就很难判断唾腺和肠道的取弃。 2.把唾腺剔出移到玻片的干净处，并清除其余器官和组织。如果唾腺上附有脂 肪，应把乳白色或淡黄色的脂肪清除干净，保留半透明的唾腺。 3.把多余的生理盐水用吸水纸吸干，加一滴 1mol 盐酸；室温下水解 2 分钟， 然后吸干。 4.用蒸馏水一滴，清洗吸干 2 次。吸水纸不要太靠近标本，以免标本丢失。 5 .加一滴改良苯酚品红，染色 35 分钟。染色的同时，用镊子把唾腺稍捣碎。 6.用镊子取一盖玻片，以 45 度角缓缓落下，排净气泡，取少许吸水纸铺在盖玻 片上，用左手食指和拇指固定盖玻片位置，右手拇指使劲按压。为使染色体铺 展得舒张，可站起来把上半身的体重施于右拇指上，效果会更好。 五、作业 绘制所看到的果蝇唾腺染色体。 六、注意事项 1、一定加生理盐水，否则唾腺易干。2、将脂肪组织清除 干净。 3、水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。 4、染色时间不可过长，否 则背景也着色。5、压片时要揉。 6、染色完以后，将旧的染色液吸去， 加新的染色液，再压片。 实验四 小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体制片 一、实验原理 骨髓细胞具有高度分裂增殖能力，取材方便，不需灭菌培养便 可制备染色体标本。直接从小鼠骨髓中取出细胞，经压片法或空气干燥法制片。 为了提高有丝分裂的指数，在动物实验前，可在取材前经腹腔注射有丝分裂的 抑制剂，一般常用秋水仙素，将细胞经过秋水仙素处理-低渗-充分固定-滴片等 步骤后，在载玻片上得到染色体的制片。这些方法对动物的核型分析是非常有 用的。 二、实验目的 1、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方法及操作技术。2、进 一步观察了解畜禽染色体的形态学及遗传学特征。 三、实验器材 1、材料：健康成熟的小白鼠（65-90 日龄） 。2、器具：显微镜、 载玻片（冰冻） 、离心管、天平、试管架、5mL 注射器、恒温水浴箱、吸管、 4 量筒、小烧杯、解剖剪刀、镊子、解剖针、纱布等。 3、试剂：秋水仙素（100ug/mL） 、柠檬酸钠溶液、氯化钾、冰醋酸、甲醇等。 四、实验方法与步骤 1、按每克体重约 5ug 的剂量，在处死小白鼠前 34 小时经腹部注射秋水仙素 （课前教师准备） 。 2、颈椎脱臼法处死小白鼠：用左手拇指、食指捏住小白鼠头的后部，并用力下 压；右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，便可使小白鼠的颈椎脱臼，瞬时死亡。 3、取股骨：立即用剪刀剪去大腿处的皮肤和肌肉，连同关节头一起取下两后肢 的股骨和胫骨，剔去上面的肌肉，用蘸有 75的乙醇棉花来回搓，直至将附着 在骨骼上的少量肌肉除去。 4、收集骨髓细胞：用 2%柠檬酸钠溶液洗净股骨和胫骨，剪去关节头，暴露骨 髓腔。将吸有适量 2%柠檬酸钠溶液的注射器的针头从股骨和胫骨的一端插入 骨髓腔中，用 2%柠檬酸钠溶液将骨髓吹洗入离心试管中，反复冲洗到骨髓腔 呈现白色为止。用吸管吹打离心试管内的骨髓细胞，使其分散，1000r/min 离 心 10 分钟，弃去上清。 5、低渗处理：向细胞沉淀中加入 5mL 37预热的 0.075mol/L 氯化钾溶液，立 即用吸管将细胞团吹打均匀，放置于 37水浴中低渗处理 10min。 6、预固定：低渗处理后，1000r/min 离心 10 分钟，弃去上清，沿管壁加 5mL 新鲜配制的甲醇乙酸（3：1）固定液，立即将细胞团吹散打匀，静置 30min。 7、1000r/min 离心 10 分钟，弃去上清，按步骤 6 操作进行第二次固定。 1000r/min 离心 10 分钟，弃去上清，第 3 次固定改用新鲜配制的甲醇乙酸 （1：1）固定液再固定 20min（操作同上） ，然后离心去上清，留下 0.10.2mL 的沉淀细胞和上清液。 8、制备细胞悬液：视离心管底部细胞多少再加入甲醇乙酸（1：1）固定液 23 滴，吹打成悬液。 9、滴片：将载玻片放在洁净冰水中预冷，取出后放在桌面，稍倾斜。用吸管吸 取 1 滴细胞悬液，从载玻片上方适当高度处滴到载玻片上，立即对载玻片上的 细胞悬液吹气，将细胞悬液吹散吹匀，然后置空气中自然干燥。 10、染色：载玻片充分干燥后，平放，用新鲜配制的 1：10 的 Giemsa 磷酸缓 冲液覆盖载玻片，染色 10 分钟，流水缓缓冲去多余的染液，再用吸水纸吸干多 余水分，凉干后即可镜检。 （二）小白鼠骨髓细胞染色体的观察 1、将制备好的染色体标本片置于显微镜低倍镜下观察，选择染色体形态较好， 分散适中的分裂相移至视野中央换油镜仔细观察。 2、小白鼠染色体形态观察：小白鼠染色体较小，呈“U” 型。 低渗的作用？ 目的是使低渗液在一定温度、一定时间内渗入细胞内，使细胞涨大，细胞膜变 薄，在滴片时细胞才能破裂，染色体才能平铺在载玻片上。 实验证明小鼠和雏 鸡都用 37 2021 分钟最好。 预固定的作用？ 在低渗结束后，往细胞悬液中加入甲醇：冰醋酸（3：1）约 1ml，可以使细胞 表面轻微固定，以防止细胞结团。 固定的作用？ 5 为了除去染色体中的蛋白质，使得染色体分散良好清晰可见，在实验中如果发 现分散不够好，可采取延长固定时间或用甲醇：冰醋酸=3:1 再固定一次可以改 善染色体分散情况。 五、作业绘制小白鼠骨髓细胞中期分裂相图，注明染色体数、形态特征 和性别 小鼠二倍体细胞染色体数目为：2n = 40；染色体形态特征观察：小鼠 染色体形态全部为近端着丝粒染色体，呈“U”形，染色体核型按照染色 体从大到小分为四组。性染色体雌性为 XX，雄性为 XY， Y 染色体最 小，大小介于 1920 号之间；X 染色体大小介于 56 号染色体之间 （图16-1 ）。 实验五 绵羊特定基因的 PCR 扩增及琼脂糖电泳检测 一、实验方法 1、绵羊血液基因组 DNA 的提取； 2、目的基因的 PCR 扩增；3、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型） ； 二、实验目的 通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电泳技术、DNA 的分离鉴定 和 PCR 扩增技术方法。 三、实验材料、仪器和试剂 材料：绵羊血液基因组 DNA 样品 仪器：电泳仪、水平凝胶电泳槽、移液器、凝胶成像系统、PCR 仪等。 试剂 电泳缓冲液(1TAE)：0.04mol/L 三羟甲基氨基甲烷 -乙酸(tris- 乙 酸) ，0.01mol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 溴化乙锭(EB10mg/ml)：100ml 灭菌双蒸水中加入 1g EB 1%琼脂糖：100ml 1TAE 加入 1g 琼脂糖 上样缓冲液(溴酚蓝- 甘油溶液)：先配制 1%的溴酚蓝水溶液与等 体积的甘油即可 四、实验步骤 （一）绵羊全血基因组 DNA 的获取 1、绵羊全血的采集，血液抗凝剂，-20保存； 2、DNA 提取： 裂解样品 酚-氯仿去除蛋白质 酶解 RNA 获取 DNA （二）PCR 扩增 1、引物设计（Genbank） ； 2、聚合酶链反应（polymerase 6 chain reaction，PCR） （三）PCR 反应体系 DNA 模板：0.5 微升（50ng/uL ） ；缓冲液（Buffer）： 2.5 微升； Mg2+：1.5 微升； dNTP：2 微升；引物：正向和反向引物各 0.5 微升；Taq DNA 聚合酶： 0.5 微升；ddH2O：17 微升； （四）PCR 反应程序 预变性 94 35min 变性 94 30s 退火 5065 30s 延伸 72 30s 后延伸 72 10min 结束：4 保存 (五) 制胶 1.将 0.15g 琼脂糖加至 15 ml 1TAE 缓冲液中，配成 1%琼脂糖。琼脂糖在微 波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至 60。C 以下。 2.加入 5ul 溴化乙锭 （终浓度 0.5ug/ ml ）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。3.准备好凝 胶成型器。 4.将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶。5.在凝胶一侧放入成型梳，将 梳子夹在胶上方的桥上，并保证梳齿在塑料板稍上一点，但不要接触塑料板。6.待 胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约 20 分钟） ，轻轻去除梳子。配制 2L 1TAE 缓冲液，用于电泳槽。将缓冲液到入洁净的凝胶槽。 （六）电泳 1. 将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。2. 凝胶应完全侵入缓冲液， 但覆盖的缓冲液不要超过 1cm。 3. 取 5ul 样品加入上样缓冲液，小心的将样品加入每一样品槽内。 4. 接通电源，电压 4-5V/cm，DNA 从负极移到正极。时间 30-40 分钟。5. 关 掉电源，结束电泳。 五、结果分析 1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间 2.开通紫外光，在电脑中观察图像；3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图 像 PCR 产物电泳检测结果 实验六 基因克隆 一、实验目的 掌握分子遗传学实验仪器的使用方法，掌握基因克隆技术要点 及操作技能。 二、实验内容 掌握分子遗传学仪器使用方法，引物设计及其软件的使用，动物组织 DNA 的 提取，琼脂糖凝胶电泳、目的片段扩增（PCR） 。 三、实验仪器及材料 实验材料：动物组织 实验仪器：高速低温离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，PCR 仪， 微量移液器，制冰机，恒温水浴锅，微波炉，三