制备软骨组织工程支架的方法

中国组织工程研究 第 18 卷 第 3 期 20140115 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 15, 2014 Vol.18, No.3 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 446 www.CRTER.org 倪硕，男，1988 年生，浙 江省金华市人，汉族，大 连医科大学在读硕士，主 要从事骨外科研究。 通讯作者：李澎，博士，主 任医师，硕士生导师 ，大 连医科大学第二附属医院 骨外科，辽宁省大连 市 116027 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.03.019 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)03-00446-06 稿件接受：2013-11-25 Ni Shuo, Studying for masters degree, Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China Corresponding author: Li Peng, M.D., Chief physician, Masters supervisor, Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China Accepted: 2013-11-25 制备软骨组织工程支架的方法 倪 硕 1，李 澎 1，张卫国 2，李鹏声 1，贵浩然 1 (1大连医科大学附属第二医院关 节外科， 辽宁省大连市 116027；2大连医科大学附属第 一医院骨外科，辽 宁省大连市 116023) 文章亮点： 1 此 问 题 的 已 知 信 息 ： 组 织 工 程 化 软 骨 研 究 为 解 决 软 骨 损 伤 修 复 提 供 了 新 的 治 疗 方 法 ， 软 骨 组 织 工 程 支 架 作 为 软 骨 细 胞 外 基 质 的 替 代 物 ， 其 外 形 和 孔 结 构 对 实 现 其 作 用 和 功 能 具 有 非 常 重 要 的 意 义 。 支 架 制 备 方 法 的 选 择 在 一 定 程 度 上 决 定 了 支 架 的 力 学 性 能 及 生 物 相 容 性 。 2 文 章 增 加 的 新 信 息 ： 通 过 溶 液 浇 铸 /粒 子 沥 滤 法 、 气 体 发 泡 法 所 制 备 的 软 骨 组 织 工 程 支 架 孔 径 大 小 在 100- 250 m 这 一 合 适 的 范 围 内 ； 将 多 种 方 法 结 合 起 来 ， 能 制 备 出 生 物 和 力 学 性 能 方 面 更 加 仿 生 的 软 骨 组 织 工 程 多 孔 支 架 。 3 临 床 应 用 的 意 义 ： 进 一 步 探 索 适 合 软 骨 组 织 工 程 支 架 的 制 备 方 法 ， 对 于 提 高 支 架 的 稳 定 性 及 生 物 相 容 性 有 着 重 要 的 意 义 ， 寻 求 组 织 工 程 化 软 骨 从 实 验 室 研 究 走 向 临 床 应 用 ， 为 软 骨 损 伤 修 复 提 供 了 新 的 治 疗 措 施 。 关键词： 生物材料；软骨生物材料；软骨组织工程；制备方法；支架材料；多孔支架；辽宁省自然科学基金 主题词： 生物相容性材料；软骨；组织工程；支架 基金资助： 辽宁省自然科学基金资助项目 (2013023034)，项目负责人：李澎 摘要 背景：软骨组织工程支架作为软骨细胞外基质的替代物，其外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要 的意义。 目的：回顾目前若干种常用软骨组织工程中三维多孔支架的制备方法。 方法：由第一作者检索 2000 至 2013 年 PubMed 数据库，ELSEVIER SCIENCEDIRECT、万方数据库、中 国知网数据库。英文检索词为“Cartilage tissue engineering；scaffolds ；fabrication”，中文检索词为“软 骨组织工程；制备方法；支架材料；多孔支架”。 结果与结论：制备软骨组织工程支架的方法有相分离/冷冻干燥法、水凝胶技术、快速成型技术、静电纺丝法、 溶剂浇铸/粒子沥滤法及气体发泡法等。目前研究发现，支架中孔径的大小对组织的重建有着直接的影响，孔 径为 100-250 m 的孔有益于骨及软骨组织的再生。通过溶液浇铸/粒子沥滤法、气体发泡法所制备的支架孔 径大小在这一范围内，因此比较适合用于骨、软骨组织工程支架的构建。研究人员通常将多种方法结合起来， 以期能制备出生物和力学性能方面更加仿生的组织工程多孔支架。 倪硕，李澎，张卫国，李鹏声，贵浩然 . 制备软骨组织工程支架的方法 J.中国组织工程研究， 2014， 18(3): 446-451. Fabrication technologies of tissue-engineered cartilage scaffolds Ni Shuo1, Li Peng1, Zhang Wei-guo2, Li Peng-sheng1, Gui Hao-ran1 (1Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China; 2Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: Cartilage tissue engineering scaffold is a substitution for extracellular matrix, and there is a great significance on the shape and pore structure of the scaffold. OBJECTIVE: To retrospectively focus on the fabrication technology of three-dimensional porous cartilage tissue engineering scaffolds. METHODS: The first author searched PubMed, ELSEVIER SCIENCEDIRECT, Wanfang and CNKI databases (2000/2013) to retrieve relevant articles about the fabrication technology tissue-engineered cartilage scaffolds. The key words were “cartilage tissue engineering; scaffolds; fabrication” in English and Chinese, respectively. RESULTS AND CONCLUSION: The fabrication technologies of three-dimensional porous cartilage tissue engineering scaffolds are as follows: Phase separation/freeze-drying, hydrogels, rapid prototyping manufacturing, electrospinning, solvent casting/particulate leaching, gas foaming. The current cartilage studies have demonstrated that the pore size has a significance on the regeneration of the cartilage tissue, the pore size ranging from 100-250 m allows for the regeneration of bone and cartilage tissue. The scaffold fabricated by the 倪硕，等 . 制备软骨组织工程支架的方法 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 447 www.CRTER.org solvent casting/particulate leaching and gas foaming technology at a pore size of 100-250 m is suitable for the bone and cartilage tissue regeneration. To obtain the adequate biological and mechanical properties, researchers usually combine a variety of methods to fabricate the cartilage tissue engineering scaffolds. Subject headings: biocompatible materials; cartilage; tissue engineering; stents Funding: the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 2013023034 Ni S, Li P, Zhang WG, Li PS, Gui HR. Fabrication technologies of tissue-engineered cartilage scaffolds. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(3):446-451. 0 引言 Introduction 退 变 、创 伤 等 导 致 的 关 节 软 骨 损 伤 是 骨 科 常 见 病 ，也 是 临 床 治 疗 的 难 点 1-3。修 复 缺 损 的 关 节 软 骨 ，对 于 恢 复 关 节 生 理 解 剖 的 完 整 性 和 维 持 生 物 力 学 的 稳 定 性 具 有 决 定 性 的 作 用 4。然 而 关 节 软 骨 周 围 无 血 管 和 淋 巴 管 ，依 靠 关 节 液 营 养 ，其 自 我 修 复 能 力 有 限 ，所 以 一 旦 损 伤 ，难 以 修 复 5。目 前 临 床 上 关 节 软 骨 损 伤 的 修 复 仍 未 得 到 很 好 的 解 决 6。组 织 工 程 技 术 的 发 展 ，为 解 决 软 骨 损 伤 的 修 复 这 一 难 题 提 供 了 可 能 性 7-8。目 前 研 究 证 明 ，组 织 工 程 包 含 3大 要 素 ：合 适 的 种 子 细 胞 、理 想 的 支 架 及 具 有 生 物 活 性 的 细 胞 因 子 。其 中 细 胞 支 架 是 基 础 ，它 为 种 子 细 胞 和 生 长 因 子 提 供 适 宜 的 微 环 境 ，完 成 组 织 或 器 官 的 再 生 过 程 9。文 章 从 细 胞 支 架 的 制 备 方 法 入 手 ，综 述 了 目 前 常 用 的 软 骨 组 织 工 程 细 胞 支 架 制 备 技 术 的 最 新 进 展 。 1 资料和方法 Data and methods 1.1 资料来源 由 第 一 作 者 检 索 2000至 2013年 PubMed 数 据 库 ，ELSEVIER SCIENCEDIRECT、万 方 数 据 库 、中 国 知 网 数 据 库 文 献 。英 文 检 索 词 为 “Cartilage tissue engineering；scaffolds；fabrication”，中 文 检 索 词 为 “软 骨 组 织 工 程 ；制 备 方 法 ；支 架 材 料 ；多 孔 支 架 ”。检 索 文 献 量 总 计 131篇 。 1.2 纳入与排除标准 纳 入 标 准 ： 文 章 所 述 内 容 与 软 骨 组 织 工 程 支 架 的 材 料 选 择 和 制 备 方 法 的 研 究 密 切 相 关 。同 一 领 域 选 择 近 期 发 表 或 在 权 威 杂 志 上 发 表 的 文 章 。 排 除 标 准 ： 重 复 性 研 究 。 1.3 数据提取 共 检 索 到 文 献 131篇 ，其 中 中 文 文 献 46 篇 ，英 文 文 献 85篇 ，排 除 与 研 究 目 的 相 关 性 差 及 内 容 陈 旧 、 重 复 的 文 献 67篇 ，纳 入 64篇 符 合 标 准 的 文 献 进 行 综 述 。 2 结果 Results 2.1 软骨组织工程支架的要求 理想的组织工程支架应 该具有以下10个特征： 良好的生物相容性。可降解 性。足够的孔隙结构。能够促进细胞的黏附与增值。 具备承载生长因子的能力。 支架的容积应能保持不 变。 支架能与周围组织融为一体。不易从缺损区脱 落。具有一定的弹性。具有关节软骨的分层结构 10。 组织工程支架材料作是组织器官工程化的最基本元素。 目前用于组织工程支架的材料主要有天然生物材料 11、 人工合成高分子材料和复合材料3大类 12。单纯应用天 然生物材料或人工合成高分子材料存在诸多问题。将两 种或两种以上具有互补特性的材料进行复合，并 选择合 适的制备工艺，可以设计构造出能 够满足软骨组织工程 所需的三维支架。 2.2 软骨组织工程支架制备方法 软骨组织工程支架作 为软骨细胞外基质的替代物，其外形和孔 结构对实现其 作用和功能具有非常重要的意义。制备工艺的不同对支 架的性能可产生明显影响。目前已研究出多种制 备软骨 组织工程支架的方法，在实际应 用中可以根据不同组织 和器官选择不同的制备工艺。 2.2.1 相分离 /冷冻干燥法 相分离法可分为溶致相分 离和热致相分离两种方法。因为许 多结晶性聚合物在室 温下找不到合适的溶剂，所以溶致相分离方法 应用不多。 目前应用较多的是将热致相分离法与冷冻干燥法结合 起来使用。其原理是将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低 温下冷冻，诱使混合物在冷冻过 程中发生相分离，最后 经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔泡沫支架。在此方法中 支架的内部结构及物理、化学特性由制 备过程中的各种 条件所决定 13。Fan等 14用此法制备的聚丙交酯-乙交 酯多孔支架孔隙大小较均一，孔隙 间微孔相通，平均孔 径为500 m，微孔直径为5 m，孔隙率 为89.6%。该法 由于在制备过程中避免了高温，且不涉及毒性大的有机 溶剂，因此有利于生物活性分子，如蛋白质生长因子或 分化因子的引入和控制释放。Fan等 14应用此法制备负 载转化生长因子3的聚丙交酯-乙交酯-明胶/硫酸软骨 素/透明质酸支架，种植兔骨髓间充质干细胞后， 细胞在 支架上生长并部分长入支架内；28 d后骨髓间充质干细 胞在支架上分化为软骨细胞，且能 够分泌软骨细胞外基 质。 邓天政等 15参考Fan 等 14的制备方法，制 备了明胶- 硫酸软骨素-透明质酸及明胶-陶瓷化骨软骨复合支架， 结果发现兔软骨细胞在复合支架上生长良好。但 该方法 的不足是其产生的微孔大小难以控制。 2.2.2 水凝胶技术 水凝胶是一种富含水分，并且富 有弹性的非黏着性亲水性聚合物，水凝胶支架可以很好 地运输营养物质及代谢废物 16。通过一定的化学交联或 物理交联，凡是亲水性或水溶性的高分子都可以形成水 凝胶。这些高分子按其来源可分 为天然和合成两大类： 倪硕，等 . 制备软骨组织工程支架的方法 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org448 www.CRTER.org 天然的亲水性高分子包括多糖类和多肽类；合成的亲水 高分子包括丙烯酸及其衍生物类。水凝胶技 术具有可塑 性强，易于制成可注射性支架等 优点 17，因此具有广阔 的应用前景。Hong等 18用交联的壳聚糖水凝胶复合物 与软骨细胞共培养，结果显示软 骨细胞在12 d后仍能维 持其细胞表型。最近，Yang 等 19将氧化的海藻酸盐作为 大分子交联剂制备胶原水凝胶支架， 结果显示乳兔关节 软骨细胞在交联的胶原水凝胶支架上生长良好，并保持 细胞表型。但该技术的不足是所制 备的支架强度不高， 并且常因吸水而变形，不能很好地促 进细胞增殖。 2.2.3 快速成型技 术 快速成型技术就是利用三维 CAD的数据，通过快速成型机将一层层的材料堆积成实 体原型。近几年人们将快速成型技 术应用于组织工程支 架制备，集合计算机获得更理想的支架 结构、孔隙率等 重要指标，取得了较好的效果。目前用于组织工程多孔 支架制备的快速成型法主要有熔融沉积成型、选择性激 光烧结及三维打印3种。 熔 融 沉 积 成 型 ： 此 法 通 常 使 用 热 塑 性 高 分 子 原 料 ，利 用 热 熔 喷 头 ，使 得 熔 融 状 态 的 材 料 按 计 算 机 控 制 的 路 径 挤 出 、沉 积 ，并 凝 固 成 型 ，经 过 逐 层 沉 积 、凝 固 ，最 后 除 去 支 撑 材 料 ，得 到 所 需 的 三 维 产 品 20。该 技 术 特 点 是 成 型 产 品 精 度 高 、表 面 质 量 好 、成 型 机 结 构 简 单 、无 环 境 污 染 等 。 熔 融 沉 积 成 型 技 术 所 使 用 的 原 料 通 常 为 聚 酰 胺 、聚 酯 、聚 碳 酸 酯 、聚 乙 烯 、聚 丙 烯 等 热 缩 性 高 分 子 。荷 兰 乌 特 勒 支 药 学 研 究 所 Seyednjad等 21-22使 用 苄 基 保 护 的 羟 甲 基 乙 交 酯 与 己 内 酯 共 聚 ，然 后 再 进 行 苄 基 脱 保 护 ，获 得 了 羟 甲 基 乙 交 酯 与 -CL 的 共 聚 物 ，并 通 过 纤 维 熔 体 沉 积 技 术 制 备 了 3D支 架 。制 备 过 程 中 对 材 料 的 特 殊 处 理 增 强 了 细 胞 对 材 料 的 黏 附 ，促 进 了 人 间 充 质 干 细 胞 的 存 活 和 增 殖 ，以 及 成 骨 分 化 。南 洋 理 工 大 学 的 Cao等 23利 用 此 方 法 制 备 了 聚 乙 酸 内 酯 骨 软 骨 复 合 支 架 ，并 将 成 骨 细 胞 与 软 骨 细 胞 种 植 于 同 一 支 架 的 两 部 分 。两 种 细 胞 在 支 架 中 分 泌 出 不 同 的 细 胞 外 基 质 ，在 成 骨 细 胞 种 植 区 出 现 了 较 高 的 骨 钙 ， 而 软 骨 细 胞 种 植 区 测 得 了 较 高 的 碱 性 磷 酸 酶 。该 结 果 表 明 ，通 过 此 法 制 备 的 聚 -己 内 酯 支 架 可 望 应 用 于 骨 软 骨 的 修 复 。但 是 熔 融 沉 积 成 型 法 的 不 足 是 操 作 温 度 较 高 ，无 法 应 用 于 天 然 生 物 材 料 的 制 备 。 选择性激光烧结 ：选择性激光烧结是采用激光束按 照计算机指定路径扫描，使工作台上的粉末原料熔融、 黏结固化。其方法是逐层扫描黏 结，最后 获得所需的三 维材料。 选择性激光烧结技术常用的原料包括塑料、陶 瓷、金属粉末等，其优点是加工速度快，且无需使用支 撑材料。美国密歇根大学的Das等使用聚- 己内酯为原 料，通过选择性激光烧结技术制 备了3D 可降解多孔支 架，获得的 3D支架材料能与 动 物骨组织良好地结合，且 具有良好的生物相容性 24。但此法的缺陷是成型产品表 面较粗糙，且制备过程中持续的高温可能造成高分子材 料的降解，以及生物活性分子的变形或细胞的凋亡，所 以该技术不能用于制备水凝胶支架 25。 三维打印技术 ：三 维 打 印 技 术 目 前 已 用 于 组 织 工 程 多 孔 支 架 的 制 备 26。其 基 本 制 造 过 程 是 按 照 “分 层 制 造 、 逐 层 叠 加 ”的 原 理 ，根 据 CT等 成 像 数 据 ，经 计 算 机 3D建 模 转 换 后 ，再 以 特 定 的 格 式 文 件 输 入 到 计 算 机 系 统 中 ，并 分 层 成 二 维 切 片 数 据 ，通 过 计 算 机 控 制 的 3D打 印 系 统 进 行 逐 层 打 印 ，叠 加 后 最 终 获 得 三 维 产 品 。Schek等 27用 该 方 法 制 造 聚 乳 酸 /羟 基 磷 灰 石 双 层 软 骨 与 骨 复 合 支 架 ，动 物 实 验 发 现 可 在 异 位 同 时 促 进 骨 和 软 骨 生 长 。 近年来通过直接携带细胞进行3D打印的细胞或组 织打印技术受到了广泛的关注。其 优势在于：直接通 过3D 打印技术控制 细胞在微观 尺度的排列分布， 对于 调节细胞行为、细胞间的相互作用、细胞与材料间的相 互作用，以及促进细胞最终形成功能 组织具有十分重要 的意义。相比于在已成型的支架中种植 细胞，直接携 带细胞打印可以获得更高的细胞密度。目前的 细胞和组 织打印技术主要是基于携带细胞的水凝胶3D沉积技术 28。美国斯克里普斯研究所的DLima等以天然牛股骨髁 制成体外软骨缺损模型，以PEGDMA/软骨细胞混合溶 液为生物墨水，在紫外光照下，在 软骨缺损部位进行原 位打印 29。通过该方法打印成型的聚乙二醇水凝胶支架 的物理性能及生物相容性良好，为将来开发能直接应用 于体内的原位生物打印技术进行组织缺损原位修复提 供了一个重要手段。 2.2.4 静电纺丝 法 静电纺丝法是聚合物溶液或熔体 在静电作用下进行喷射拉伸而获得纳米级纤维的纺丝 方法。该方法能使有机大分子简单 而可控地形成纳米纤 维，制备出较大的面积-体积比和高孔隙率的支架。Li等 30采用此法制成聚己内酯纳米 纤维支架，将骨髓干细胞 接种于支架表面，在不同培养环 境中分别诱导形成了脂 肪组织、软骨组织、骨组织，说明该技术制成的聚己内 酯支架可用于多种组织工程构建。 为了能使电纺的纤维 支架具有生物活性物质缓释功能，研究人 员开发出了同 轴共纺技术。Jiang等 31通过同轴共纺技术制备以聚乙 内酯为壳，牛血清蛋白为芯的纤维 ，结果表明牛血清蛋 白可以从壳-芯式结构中缓慢释放出来。但 该方法制作 支架耗时长，因此支架的大批量生 产较困难；并且对于 较大支架的制备仍有许多技术难题需要克服 32。 2.2.5 溶剂浇铸/粒子沥滤法 该法由Mikos 等 33-34作 为纤维连结法的改进而提出，目前已成功地用于 软骨细 胞的培养和软骨组织的生成。其原理是先将高分子材料 溶解或熔化成液态，然后在液体中加入不溶 (或不熔)的 所需粒径范围的致孔剂，将该液体混合物固化 (待溶剂 挥发或降温凝固)，最后用高分子材料不溶 (或不熔)而致 孔颗粒溶解的溶剂将致孔颗粒浸泡沥出，制成不含粒子 的多孔隙高分子支架。支架的孔形态、孔隙率、机械性 倪硕，等 . 制备软骨组织工程支架的方法 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 449 www.CRTER.org 能、生物活性和降解性能可由致孔剂的性质及其数量， 不同支架材料的性质及其比例控制。 Lee等 35采用该技 术制备了孔隙率为87%-90%，孔径大小在 115.5-220.9 m之间的聚乙二醇水凝胶支架，并在支架上种植软骨 细胞，结果发现软骨细胞在微孔内伸展生 长，并 产生大 量的细胞外基质和葡萄糖胺聚糖。能用 该法致孔的聚合 物有聚乳酸 36、聚乙醇酸及其共聚物等。 溶剂浇铸/粒子沥滤法的改进：虽然粒子致孔法具有 简单、适用性广，并且孔隙率和孔尺寸易独立调节等优 点，但该方法也存在诸多局限性 37，例如：支架的厚度 不足 38；支架内部 连通性的缺陷 39；支架内部致孔剂的 残留 40-41；支架制备过程中残留的有毒溶剂对组织生长 的影响 40, 42。为克服上述缺陷，研究者们对溶剂浇铸/粒 子沥滤法进行改进或者将溶剂浇铸/粒子沥滤法与其他 方法相结合来制备多孔支架。 为解决支架的厚度的问题，国内学者任杰等 43将通 过溶剂浇铸/粒子沥滤法所制得的聚乳酸-聚乙二醇薄层 支架，利用层叠方法以氯仿润湿支架的黏 结面后，将薄 层支架彼此黏合为三维多孔支架。此法 虽然比较简单， 并且有利于滤除支架中的致孔剂，但其制 备过程中无法 避免有毒溶剂的使用，且在粘接 过程中可能导致支架孔 结构破坏。 为克服支架孔-孔连通性不好的缺陷， Shokrolahi 等 40采用致孔剂 模板法，以通过处理的球形化氯化钠颗 粒为致孔剂，经处理得到孔隙率高、孔-孔连通性好的聚 乳酸/ 羟基磷灰石复合材料支架。尽管通过模板法制备 的多孔支架的孔-孔连通性好，但它 对致孔剂要求较高， 对支架的孔隙率的控制也较为困难，且同样无法避免有 毒有机溶剂的使用。 为解决传统无机盐致孔剂在支架上的残留及其毒 害性，采用冰粒子作为致孔剂引起了研究者 们的注 意 44。国内 东南大学的孙浩 45以冰粒子作为致孔剂，采 用粒子沥滤/冷冻干燥复合工艺制备了具有良好孔隙结 构、较大尺寸且无致孔剂残留的三 维块状聚( 乳酸-羟基 乙酸)共聚物多孔支架。采用冰粒子作 为致孔剂虽然可 有效避免致孔剂的残留，但在实际 操作中因能耗问题而 困扰着研究者，并且同样无法避免有机溶 剂的使用 46。 为有效避免有毒有机溶剂的使用， Hou等 46通过模 压/粒子沥滤法制备消旋聚乳酸支架，其具体过程是：将 所需的聚合物支架材料在低温下冷冻粉碎，然后将所需 粒径的颗粒与氯化钠颗粒混合后加入模具，在高温高 压 下模压成型。此改进方法解决了有毒有机溶 剂的残留及 支架厚度的问题。但由于此法在制 备过程中不可避免的 使用高温高压，从而影响了支架材料的性能，并且对于 设备及模具有一定要求。 采用溶剂浇铸/粒子沥滤和相分离等方法制备软骨 组织工程多孔支架，尽管支架孔隙率高达95%，孔径范 围在20 -500 m，但以上多数方法在制备过程中无法避 免有机溶剂的使用。如果有机溶 剂残留在支架中， 则可 能伤害移植细胞及邻近组织。而且，许多生物活性因子 (如生长因子) 在有机溶剂中会失去活性 47。为此，采用 超临界CO 2 作为致孔剂的气体发泡法来制备高度多孔 可生物降解支架引起了研究者们的关注。 2.2.6 气体发 泡法 气体发泡法主要有物理发泡法和 化学发泡法，其大致原理是利用不同 压力下气体在固体 中溶解度的不同，通过压力的改 变在聚合物中形成气腔， 并最终形成三维多孔支架。聚合物材料的性 质及制备过 程中的各种因素决定了支架的孔隙率和孔结构。物理 发 泡法可以避免有机溶剂的使用，但是 对于某些材料，如 结晶性聚合物，这种方法产生的泡沫 结构大多是闭孔结 构。例如，利用超临界二氧化碳发泡工艺形成的支架孔 径大小不一，孔隙率较小，且易形成闭合孔 49。对于无 定型聚合物材料，利用此法则比 较容易发泡。 Mooney 等 50采用该法将聚 (乳酸-羟基乙酸)共聚物固体室温暴 露于5.5 MPa高 压CO 2气体72 h达溶解饱和，然后将气 压降至大气压水平，随着聚合物中 CO2溶解度的迅速下 降而产生大量的CO 2气腔，最后形成孔径约 100 m，孔隙率达 93%多孔泡沫样结构。Singh 等 48采用超 临界CO 2作为致孔 剂，制备出了孔间相互连通，孔隙度 高达89%，孔径范围30-100 m的聚(乳酸-羟基乙酸)共 聚物支架。 为解决采用发泡法制备的支架中存在的闭孔问题， 常常将其与粒子沥滤法相结合使用 51，可以制备出性能 较好的支架。Yoon 等 52-53采用气体发泡/盐浸的方法制 备了高度多孔的PLGA生物支架 ,很好地解决了支架结 构的闭孔问题。Ju 等 54采用该方法制得孔隙率在87%- 93%，孔径大小在100 -300 mm之间的复合有氨基酸的 左旋聚乳酸支架，与未复合氨基酸的左旋聚乳酸支架相 比能更好地促进软骨细胞的黏附和增殖。 化学发泡法主要是将聚合物溶液和碳酸盐类化合 物混合后浇铸成型，待有机溶剂挥发 后再进行加热处理， 最后经冷冻干燥而制得支架 55。将可以产生气体的化合 物代替氯化钠作为致孔剂目前被广泛用来制备多孔支 架 56-57，它能同时起到发泡剂和致孔剂的作用，在实际 操作中既可单独使用，也可以和 氯化钠配合使用。 Lee 等 58利用制热碳酸 氢铵分解出 CO2和NH 3采用气体发泡 并结合其他方法曾经制备了左旋聚乳酸纳米-微米双重 孔结构的多孔支架。同理，也可以 单独使用碳酸氢铵作 为发泡剂及致孔剂制得所需的支架样品。Lin 等 56利用 不同比例的碳酸氢铵和氯化钠作致孔剂，通过此法制备 出所需支架。 以上研究表明，沥滤法和发泡法 结合使用保留了传 统沥滤法的优点，并且无机盐滤 除更快更彻底，同 时又 具有良好的孔-孔连通性。 倪硕，等 . 制备软骨组织工程支架的方法 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org450 www.CRTER.org 3 总结与展望 Conclusions and prospects 组织工程多孔支架的力学性能主要由支架的孔径、 孔隙率及连通孔径等结构参数决定，支架的 结构特征直 接影响着细胞的增殖及分化功能 59-60。选择合适的制备 方法，将有利于支架性能的发挥 。目前研究 发现，支架 中孔径的大小对组织的重建有着直接影响，孔径 为100- 250 m的孔有益于骨及软骨 组织的再生。由于通 过溶 液浇铸/粒子沥滤法、气体发泡法所制备的支架孔径大 小在这一范围内，因此比较适合用于骨、软骨组织工程 支架的构建。目前，研究人员通常将多种方法结合起来， 如气体发泡/盐浸 57、气体发泡/萃取法 61、热致相分离/ 溶剂萃取 62、冷冻固定/冷冻凝胶 63、注塑成型 /挤出发 泡等 64，以期能制 备出生物和力学性能方面更加仿生的 组织工程多孔支架。 作者贡献 ：第一作者和通讯作者构思并设计本综述，分 析并解析数据，所有作者共同起草，经通讯作者及第二作者 审校，第一作者对文章负责。 利益冲突 ：文章及内容不涉及相关利益冲突。 伦理要求 ：无涉及伦理冲突的内容。 学术术语 ：熔融沉积成型-使用热塑性高分子原料，利用 热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、 沉积，并凝固成型，经过逐层沉积、凝固，最后除去支撑材 料，得到所需的三维产品。 作者声明 ：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署 名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。 4 参考文献 References 1 Hunziker EB.Articularcartilagerepair:basicscienceand clinicalprogress. Areviewofthecurrentstatusandprospects. Osteoarthritis Cartilage.2002;10(6):432-463. 2 AlsbergE, AndersonKW, AlbeirutiA, et al. Engineering growing tissues. ProcNatlAcadSci USA. 2002; 99(19):12025- 12030. 3 Risbud MV, Sittinger M. 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