动物病原微生物实验室检验实习总结

山西农业大学 专 业 动物检疫 年 级 班 级 姓 名 学 号 指导教师 赵宇军 职 称 副教授 动物病原微生物实验室检验实习总结 教学实习总结 实习时间：2012 年 5 月 8 日至 8 月 13 日 实习地点：山西农业大学兽医微生物与免疫学实验室 指导老师：赵宇军 实习内容：时间过的很快 ，转眼间三年的大学生活就结束了，我们动物检疫专业的同学 从五月份开始了为期 3 个多月的教学实习，在众多辅导老师之中，我有幸跟随我校动物科 技学院预防系的赵宇军教授进行学习。实习地点为我校兽医微生物与免疫学实验室。实习 内容自行选择。在老师的带领下我进行了大肠杆菌的实验室检测和食物中金黄葡萄球菌的 检验。下面我们来回顾这次实验。 大肠杆菌的实验室检测 一、培养基配置 我们一般用 LB 液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在 LB 固体培养基上划线分离。 以下为本实验中培养基配置步骤： 1称量：准确称取各成分。蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0.25g，氯化钠 0.5g，加水 50ml。配 置 LB 固体培养基时还需加 1g 琼脂。 2溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到 50mL。配置 LB 固体培养基时还需加琼脂，整个过 程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3调 pH：用 1mol/L NaOH 溶液调节 pH 至偏碱性。 4灭菌：在两个 250ml 的三角瓶中分别装入 50ml LB 液体培养基和 50ml LB 固体培养基， 加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg 压力灭菌 15min。 5倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至 60左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过 程是： 将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞； 右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶 口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过 来放置。二、灭菌和消毒 1无菌技术：对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、 接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰 旁进行； 避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2消毒方法：日常生活经常用到的是煮沸消毒法；对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏消毒法；对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消 毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；实验操作者的双手使用酒精进行消毒。 3灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；培养基、无菌水等使用 高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌 法，所用器械是紫外灯。 三、细菌的分离 采用划线分离法，其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰 旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿 内，在平板培养基的一边，作第 1 次平行划线 35 条，转动培养皿约 70角，用烧过冷却 的接种针，通过第 1 次划线部分作第 2 次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行 划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种 针应与平板表面成 30角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划 线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。 四、菌落和菌种种类的辨认 细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的菌落 表面是干燥、有褶皱的；放线菌由于有纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表面是紧密的 绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状，由于菌丝和孢子有多种色素，所以在菌落培养基 底部和菌落表面都有不同的颜色，菌落不易用接种环挑动；酵母菌落类似于细菌菌落，表 面光滑而湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。 食品中金黄葡萄球菌的检测方法 金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中 毒的常见致病菌之一。本菌广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及其它环境中。在人类 和动物的皮肤及外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。据报导，在正常人群中的带菌率 可达 30%80%，其中皮肤带菌率为 822%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的带菌率在 4050% 以上，因此其可通过各种途径和方式，尤其是经工作人员的手和上呼吸道而污染食品。由 于致病金黄葡萄球菌能产生肠毒素，故一旦细菌污染食品，并在合适的温度环境下，细菌 可以大量繁殖并产生肠毒素，从而引起消费者食物中毒。 我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准 GB.4789-10-84 及检验检疫系统 行业标准 SN.0172-92 作为依据。整个检测过程获得最终结果须时 5 天左右，既费时又费力， 并造成货物积压，也影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高，造成较大的经济损 失。 多年来很多食品微生物实验室都在探索和寻找一些准确性高，并快速的检测方法，最近我 们分别从美国 3M 公司和法国生物梅里埃公司获得两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的 培养基，其名称为： Petrifilm RSA. Count Plate（由美国 3M 公司研制生产） ，是一种薄膜型快速检测金 黄色葡萄球菌的计数平板。 Baird-parker + RPF Agar.（由法国生物梅里埃公司研制生产的用 Baird-Parker 琼脂 加免血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板） 。 一、实验原理 Petrifilm. RSA. 测试薄膜是由二部分组成。第一部分是由黄金色葡萄球菌培养基片， 此培养基中含有经修正的 Barid-Parker，营养成分加上以冷水可溶解的胶质。第二部分是一 种耐热核酸酶（TNase）反应片，含有 DNA 及甲苯胺兰 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示 剂 (Tetraeolium)。此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。 耐热去氧核糖核酸（deoxyribonulcas Dnase）为产毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐热， 在 100加热 30min，不易丧失活性，在 130之下，其 D 值为 16.6min，此酶之分子量为 16800，等电点 PH 为 9.6,耐热去氧核糖酸与检测血浆凝固酶相似，是一种鉴定金黄色葡萄 球菌的方法，在 Petrifilm. RSA 检测片上，耐热 DNA 酶反应看起来，呈粉红色环带包围着 一个红色或兰色的菌落。 Petrifilm.RSA 检测片，必须与 Peyrifilm 耐热核酸酶反应片一起使用，单独使用将不会 显示菌落，因为具有辅助计数菌落的指示剂是在反应片上，而不是在 Petrifilm.RSA 检测片 上。 Baird-parker + RPF agar，这一培养基中含有丰富的营养成分，其中以氯化锂代替亚碲 酸钾，使菌落颜色呈黑色，RPF 补充有兔血浆和牛纤维蛋白原，以便检测凝固酶活力，胰 酶可以抑制全部或部分围绕凝固酶阳性菌落周围沉淀晕环纤维蛋白的溶解，因此凡存在血 浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，将在培养基中呈现有晕环的黑色菌落，即可确认，并作 计数。 二、实验步骤 材料和方法： 本次实验采用以下 3 种试剂： 1. 美国 3M 公司提供的 Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate. 2. 法国生物梅里埃公司提供的 Baird-Parker + RPF agar . 3. 实验室自配 Baird-Park 琼脂（英国 Oxoid）及新鲜兔血浆。 菌种来自美国菌种保存中心（America TyP Culture Collection） 。金黄色葡萄球菌共 10 株菌 株，其菌号分别为： ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704 ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 8095 ATCC 12598 非金黄色葡萄球菌菌种 5 株，其菌号分别为： ATCC 51813 （大肠杆菌） 、ATCC 624 （无乳链球菌） 、ATCC 51816 （阴沟肠杆菌） 、 ATCC 6051 （枯草杆菌） 、ATCC 49214 （肠炎沙门氏菌） 、自然食品检样，任意购自市场。 本次实验是以同一测试样品经均质并通过无菌生理盐水作 10 倍递增稀释后取 1 至 2 个稀 释度同时接种上述三种培养基作平行实验，在取得最终结果后相互进行比对。 上述三种培养基的接种方法是按生产商所提供的使用说明进行操作，另外 Baird-Parker Agar 培养基是按 SN0172-92 标准进行操作。 A、 本次实验共测试已知标准菌种共 15 株，其中葡萄球菌 10 株，其他菌种 5 株（包括大 肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门氏菌、枯草杆菌和无乳链球菌） 。 B、 测试自然食品检样共 101 只（其中包括肉 11 只、肉类 14 只、水产品 17 只、牛奶 25 只、蔬菜 22 只、豆制品 12 只） 。 三、实验结果： A、 被检菌种 10 株，金黄色葡萄球菌在三种培养基上都能检出生长情况良好，同一稀释 度的菌液，除个别菌株外在 3 种培养基计数检测结果基本都在一个数量级上，无显著差异。 而 5 株非金黄色葡萄球菌的菌株在三种培养基上全部不能生长。 B、 自然食品检样共接种 101 只，每一检样同一稀释浓度分别同时种三种培养基，最终共 检出金黄色葡萄球菌 45 只，占全部检样的 44.5，其中 Petrifilm RSA 检出阳性结果为 42 只，占全部阳性检样的 93.3，Baird-ParkerRPF Agar. 检出阳性结果 26 只，占全部阳 性检样的 57.7。Baird-Parker. Agar 检出阳性结果 32 只，占全部阳性检样的 71.1。 四、实验讨论 1. 用 15 株标准菌在 3 种培养基中的检测，10 株金黄色葡萄球菌以同一浓度接种，结果生 长良好，其最终计数基本一致，定位在同一数量级，5 株非金黄色葡萄球菌接种上述三种 培养基全部不长，说明上述三种培养基对金黄色葡萄球菌选择良好。 2. 以 101 只自然样品同一均质稀释液，同时接种三种培养基，从最终结果来看，对金黄色 葡萄球菌的阳性检出率为 44.5 3. 从检测程序来年，Petrifilm. RSA 及 Baird-ParkerRPF. Agar. 都在样品接种后 2830h 观察结果，并不必再做证实试验，而如以 Baird-Parker Agar 检测，须在接种后 48h 观察平 板，并挑取可疑菌落转种到营养肉汤中，在经 18-24h 后做血浆凝固酶或耐热 DNA 酶试验 进行证实，最终计数，前后约须 80h。 4. 从本次试验中观察，使用上述三种培养基对食品中金黄色葡萄球菌含量的直接计数检测， 其样品接种液的含量拟控制在 100 个/ml 以内，比较容易分清并计数，如菌量过浓，则将 会影响最后的读数，因此对新送的被检样品，如在不了解污染的情况下一般必须要做 2 个 以上的稀释度，同时分别接种，才能获得较为满意的结果。 而在 Baird-ParkerRPF Agar 及 Baird-Parker. Agar 接种时必须将 1ml 样液作三只平板涂布 （0.3、0.3、0.4ml）这样就会造成手续繁琐试剂消耗较大，但 Baird-Parker. RPF. 培养基也 可以 1ml 样液作倾注培养，并作计数。 5. 在整个测试过程中，我们发现，按使用说明对 Petrifilm. RSA. 及 Barid-ParkerRPF. Agar，操作规定在接种 24h 后观察结果，此时往往由于菌落长得经较小，特征瓜不明显， 但如果继续放置一夜以后金葡萄菌落特征明显，并可能会经第一天观察数量有所增加，这 样可以提高检测结果的可信度。 6. 由于对上述两种培养基的试用期间我们尚未获得供应商的报价，故无法测算每一样品的 测试成本价格。但可以予计上述两面种快速检测培养基的耗材费用要高于常规经典方法 （Baird-Parker Agar ）的费用。 7. 通过本次实验，我们感到使用美国 3M 公司生产的 Petrifilm. RSA Plate 培养基和法国生 物梅利埃公司生产的 Baird-Parker RPF. Agar 培养基检测中的金黄色葡萄球菌。可以比目 前常规检测方法时间可缩短一半。并可以明显节省大量人力。这完全符合实验室快速检测 的要求，尤其是对基层较简陋的实验室条件中，更显其使用方便的优越性。 实习总结：通过这次严谨而有序的实验实习，为我们先前在教学中学习到的知识