厄贝沙坦平衡透析法

厄贝沙坦平衡透析法 关键词 厄贝沙坦；血浆蛋白结合率；平衡透析法；hplc key words irbesartan; human plasma protein binding rate; equilibrium dialysis; hplc 厄贝沙坦是血管紧张素受体拮抗剂，能特异性地拮抗血管紧 张素受体，通过特异性地拮抗 ang与 at1受体的结合，抑制血 管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用，临床上主要用于高血压 的治疗，同时厄贝沙坦在欧盟获准用于一个新的适应证，即治疗 有高血压的 2型糖尿病患者的肾脏病，是欧盟批准用于预防糖尿 病早期及晚期肾脏疾病的第一个抗高血压药。 针对高血压患者血压有明显的昼夜节律改变，本课题组采用双 层凝胶骨架片技术制备得到厄贝沙坦缓释片，该缓释片能有效控 制厄贝沙坦在体内的释放过程，可以使药物在体内缓慢发挥持续、 稳定的降压作用，并能减少由血药浓度突然增高而引起的不良反 应的发生，实现夜间平稳降压。根据药品注册管理办法及 化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则要求，必须对 厄贝沙坦缓释片进行药代动力学研究，而“药物与血浆蛋白的结 合”是主要研究内容之一。国内外未见厄贝沙坦的血浆蛋白结合 率的相关研究报道，而药物的临床疗效和毒性反应与药物的蛋白 结合力和结合率密切相关。因此，笔者对厄贝沙坦的血浆蛋白结 合率进行研究1-5，为申报厄贝沙坦缓释片新药提供依据。 1 仪器与材料 1.1 仪器 sartorius ba110s电子天平（德国 sartorius公司） ；dionex ultimate 3000高效液相色谱仪（dionex 公司） ；thz-82 型恒温水 浴振荡器（江苏金坛市宏华仪器厂） ；xh-c 旋涡混合器（江苏省金 坛市医疗仪器厂） ；sb 4200dts 型双频超声波清洗器（宁波新芝生 物科技股份超声仪器有限公司） ；透析卡（0.53.0 ml，美国 pierce biotechnology公司） 。 1.2 材料 厄贝沙坦（深圳迈瑞尔化学技术有限公司，批号：m-1007l08） ； 厄贝沙坦对照品（深圳迈瑞尔化学技术有限公司，含量 99.75） ； 氯雷他定（深圳迈瑞尔化学技术有限公司，含量 99.83） 。乙腈 （色谱纯，依能色谱有限公司） ；其他试剂均为分析纯，购自广州 化学试剂厂。健康人空白血浆由广州市番禺区中心医院提供。 2 方法与结果 2.1 分析方法建立 2.1.1 色谱条件 色谱柱为 diamonsil c18（4.6 mm250 mm，5 m） ；流动相为 乙腈-0.02 mol/l 磷酸二氢钾水溶液（磷酸调 ph至 2.6） （4555） ；流速为 1 ml/min；检测波长为 245 nm；柱温为 35； 进样量为 20 l。在上述色谱条件下，理论板数按厄贝沙坦峰计 不低于 3 000。 2.1.2 溶液配制 2.1.2.1 空白透析液 精密称取磷酸氢二钾 14.110 g，磷酸二 氢钾 2.592 g，氯化钠 1.991 g，置于 1 000 ml量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，制成 ph=7.4的缓冲液，即得。 2.1.2.2 厄贝沙坦储备液 称取 105干燥至恒重的厄贝沙坦适 量，精密称定，加空白透析液制成每 1 ml含厄贝沙坦 100 g/ml 的储备液，置 4冰箱中冷藏备用。 2.1.2.3 供标准曲线用厄贝沙坦标准溶液 精密称取 105干燥 至恒重的厄贝沙坦对照品 3.12 mg，置 100 ml容量瓶中，加甲醇 溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为 31.20 g/ml 的对照品储 备溶液。精密吸取上述对照品储备溶液 0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ml 分别置于 50 ml容量瓶中， 加甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45 m 滤膜滤过，即得。制得浓 度为 0.31、0.62、1.25、2.50、6.24、12.48、31.20 g/ml 的 对照品溶液。 2.1.2.4 供透析用厄贝沙坦溶液 吸取上述厄贝沙坦储备液适 量，加空白透析液制成浓度分别为 0.2、2.0、20.0 g/ml 的厄 贝沙坦溶液，置 4冰箱中冷藏备用。 2.1.2.5 内标溶液 称取氯雷他定适量，精密称定，加甲醇制 成每 1 ml含氯雷他定 10 g/ml 的对照品溶液，置 4冰箱中冷 藏备用。 2.1.3 透析液样品处理 精密吸取透析内液或透析外液 100 l，加内标溶液 10 l， 涡旋混合 2 min，加入乙腈 100 l，涡旋混合 2 min，离心（16 000 r/min）10 min，取上清液，置 50水浴，氮气吹干，残渣加 流动相 100 l，涡旋混合 6 min，离心（16 000 r/min）10 min，取上清液，即得。 2.1.4 透析液分析方法验证 2.1.4.1 专属性 在上述色谱条件下，厄贝沙坦和内标的保留 时间分别为 6.03、10.12 min，血浆中其他成分对测定无干扰。 2.1.4.2 标准曲线和线性范围 精密吸取空白血浆或空白透析 液 200 l，加供分析方法验证用厄贝沙坦标准溶 100 l，制成 厄贝沙坦浓度分别为 0.10、0.21、0.42、0.83、2.08、4.16、10.40 g/ml 的标准样 品溶液，按“透析液样品处理”项处理，注入色谱仪，测定峰面 积。以厄贝沙坦与内标的面积比为纵坐标（y） ，厄贝沙坦浓度为 横坐标（c） ，线性回归。透析内液的线性方程为：y=0.924 5c+0.025 6（r=0.999 0）线性范围为 0.1010.40 g/ml，定量 下限为 0.10 g/ml；透析外液的线性方程为：y=0.844 9c+0.058 4（r=0.999 6）线性范围为 0.1010.40 g/ml，定量下限为 0.10 g/ml。 2.1.4.3 精密度 精密吸取空白血浆或空白透析液 200 l，加 厄贝沙坦储备液，制成低、中、高三个浓度的溶液（浓度分别为 0.2、2.0、20.0 g/ml） ，按“透析液样品处理”项处理，注入 色谱仪，测定峰面积。在同一天内连续进样 5次及连续 3 d测定， 分计算日内精密度与日间精密度。结果显示，血浆样品高、中、 低三个浓度的平均回收率分别为（99.18.2）%、 （95.77.7）% 、 （102.49.8）%，日内精密度分别为 5.27%、6.32%、6.88%，日 间精密度分别为 6.46%、6.73%、7.11%；透析外液样品高、中、低 三个浓度的平均回收率分别为（99.73.2）%、 （98.54.3）% 、 （99.64.1）%，日内精密度分别为 3.22%、3.36%、3.07%，日 间精密度分别为 3.86%、4.13%、4.40%。 2.1.4.4 提取回收率 取“精密度”项低、中、高三个浓度的 标准血浆样品溶液（浓度分别为 0.2、2.0、20.0 g/ml） ，每个 浓度 5份，按“透析液样品处理”项处理，依法测定峰面积（a1） 。 另取以甲醇稀释的相应浓度对照品溶液，测定峰面积（a2） 。按下 式计算提取回收率（f）：f=（a1/a2）100%。结果显示，高中 低 3种浓度的提取回收率分别是（80.97.4）%、 （83.26.7）% 、 （78.46.6）%。 2.1.4.5 反复冻融稳定性 将“标准曲线和线性范围”项的标 准血浆样品作为质控样品，进行冰冻融溶实验。样品置-20冰箱 中反复 3次冻融（分别于第 1、3、7 天融溶） ，室温融溶后，依法 测定样品浓度，每个浓度重复 5份。结果显示，测定值与理论值 的相对误差 rsd90%） 。提示，在临床联合用药中，应注意该药与其 他高蛋白结合率的药物的使用，有可能会导致一些不良反应。 参考文献 1 鹿秀梅,江坤,于霄,等.川丁特罗与人血浆蛋白结合率的测 定j.中国新药与临床杂志,2010,29(7):524-528. 2 李秋红,崔明宇,隋晓璠,等.丁香苦苷血浆蛋白结合率的测 定j.哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2008,24(2):148-150. 3 姚志红,曹秀珍,邵萌,等.超滤法测定甲基原薯蓣皂苷的血 浆蛋白结合率j.中国中药杂志,2008,33(11):1291-1294. 4 丁一冰,樊夏雷,沈建平,等.cap-hplc 测定