基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究

基于细胞穿透肽技术对 p38 丝裂原活化蛋白激酶蛋 白功能的研究 作者：杨丽萍；刘志锋；黎永明；李志杰；姜勇 (南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组 学重点实验室，广东 广州 510515) 摘要：目的 构建基于 TAT 技术的 p38 MAPK 蛋白转运系统并对导入细胞 的融合蛋白的功能进行鉴定。方法 采用亚克隆方法构建重组质粒 pHis- TAT-p38 和 pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体，并诱导原核表达纯化融合蛋 白；将这两种蛋白加入培养的 ECV304 细胞，在高渗刺激下，通过检测 p38 底物 ATF2 的磷酸化水平，以观察由 TAT 转导进入细胞 His-TAT-p38 及其无活性突变体对内源性 p38 活性的影响。结果 酶切和测序结果表明， 载体构建正确；SDS-PaGE 凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋 白；Western blot 表明，融合蛋白 His-TAT-p38 及其突变体能够以一种 时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞；导入 His-TAT-p38 蛋白后，结 果发现导入的野生型 p38 可增强内源性 p38 的功能，而无活性突变体则竞 争性抑制了内源性 p38 MAPK 蛋白的功能，从而阻止或抑制其对内源性底 物 ATF2 的磷酸化，使得信号不能传递下去，进而抑制 p38 MAPK 通路的活 动。结论 成功建立了基于 TAT 的蛋白转运系统，并证实 TAT 能够以浓度 和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞；进入细胞的 His-TAT-p38 和 His-TAT-p38 无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性，在高渗刺激 作用下前者可以增加 p38 磷酸化水平，而后者则显著抑制 p38 信号通路的 活性。 关键词：I 型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白；p38 丝裂原活化蛋白激酶； 蛋白转导 中图分类号：Q291 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2006)05- 0553-05 Cell-penetrating peptide-based functional study of p38 MAPK YANG Li-ping； LIU Zhi-feng； LI Yong-ming； LI Zhi-jie； JIANG Yong DePartment of Pathophysiology and Guangdong Provincial Key Laboratory of Functional Proteomics, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China Abstract: Objective To construct a p38 MAPK protein delivery system based on TAT protein and study its functions in eukaryotic cells. Methods Recombinant vectors pHis-TAT-p38 and pHis-TAT-p38(AF) were constructed, and two recombinant proteins, His-TAT-p38 and His-TAT-p38(AF), were expressed and purified in E.coli. The two fusion proteins were then incubated with ECV304 cells, respectively. The phosphorylation of ATF2 was detected to assay the effect of His-TAT-p38 on endogeneious p38 activity after the cells were stimulated by sorbitol. Results The results of restriction enzyme digestion and DNA sequencing showed that the two recombinant vectors were correctly constructed. The recombinant proteins of His-TAT-p38 and His-TAT-p38(AF) were isolated and purified by SDS-PaGE, and Western blotting suggested that His-TAT-p38 and its mutant with dual phosphorylation sites could enter the cells efficiently in a time- and concentration-dependent manner. His-TAT-p38 was found caPable of increasing the activity of endogenous p38 in ECV304 cells, but His-TAT-p38(AF) inhibited the phosphorylation of ATF2 so as to block the transduction of p38 signal Pathway when the cells were stimulated with sorbitol. Conclusion p38 MAPK protein delivery system based on TAT protein has been constructed successfully. It is confirmed that TAT can transfer the proteins into the cells in a time- and dose-depended manner. TAT-p38 and its dominant negative form possess high biological activity after transduction into ECV304 cells by TAT protein delivery system, and the former can increase the activity of endogenous ATF2, but the latter inhibits the transduction of endogeneious p38 signal Pathway in ECV304 cells with high osmotic stress. Key words：human immunodeficiency virus type-1； p38 mitogen- activated protein kinase； protein transduction 收稿日期：2005-10-31 基金项目：广东省科技计划项目( A1090202)；广州市科技计划项目 (2001-z-035-01-1)；广东省自然科学基金重点项目(13058) Supported by Sci-Tech Research Development Program of Guangdong Province(A1090202), Natural Science Foundation of Guangdong Province(13058), and Science and Technology Development Program of Guangzhou MuniciPality(2001-Z-035-01-1) 作者简介：杨丽萍(1972-)，女，硕士研究生，从事炎症的信号转导通路 的研究 通讯作者：姜勇，教授，电话 E- mail： 应激激活的丝/苏氨酸蛋白激酶 p38 属于丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)超家族。各种细胞外刺激， 包括紫外线、放射、热休克、高渗压、致炎细胞因子和某些病原体，能触 发应激调节的蛋白激酶级联，最终通过磷酸化激酶活化环(Loop 12)上的 TGY 基团而激活 p38 MAPK。p38 在凋亡、细胞因子产生、转录调节和细胞 骨架重构中起重要作用，还与败血症、缺血性心脏病、关节炎、人免疫缺 陷病毒感染及阿尔茨海默氏病有密切联系1，2。人类免疫缺陷病毒 (HIV)1 型的反式激活因子(TAT)，是一种正调控蛋白质，可以极大的提高 HIV 基因组的转录和复制水平，还能够调节细胞基因及细胞的行为3。 近年来，TAT 融合蛋白转导技术系统是研究蛋白质功能的的一种重要的技 术手段，利用该方法来提高目的蛋白穿透生物膜的方法简单可行，不影响 生物大分子的活性，可高效地介导目的蛋白穿透生物膜进入细胞。本研究 应用 TAT 蛋白技术，建立了一个高效转导 p38 MAPK 及其活性突变体地高 效工作系统，并探讨使用外源性 TAT 蛋白调节 p38 通路活动的可行性。 1 材料 1.1 主要仪器及试剂 ABI310 型 DNA 测序仪(美国 PE 公司)、微量 DNA/RNA 定量仪(瑞典 Pharamacia 公司)、低温离心机(美国 Beckman 公司)。DNA 纯化回收试剂 盒(Vitagene 公司)、凝胶回收试剂盒(Vitagene 公司)、LB 培养基(Gibco)、 异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG，华运公司进口分装)、Ni 2 -NTA 亲和树脂 (Qiagen 公司)、羧苄青霉素(Novagen)、1 kb DNA 标准物(NEB 公司)、限 制性核酸内切酶和 T4连接酶(ToYoBo 公司)、胎牛血清(Hyclone 公司)、 DMEM(Gibco BRL 公司)。兔源抗 p38 抗体、兔源抗 ATF2 抗体、抗磷酸化 ATF2 抗体和兔源抗 actin 抗体购自 Cell Signaling 公司；HRP 标记的抗 兔 IgG 购自 Santa Cruz 公司；其它试剂均为国产分析纯或试剂盒附带。 1.2 质粒、菌种和细胞 表达载体 pET-14b-His-TAT 由本室郭爱华博士构建4，野生型及双 磷酸化位点突变的 flag 标记的质粒 pcDNA3-Flag-p38、pcDNA 3-Flag-p38 以及 pET14b-His-p38 原核表达质粒由本室构建，DH5 和 BL21(DE3)大肠杆 菌和 ECV304 细胞由本实验室保存。 2 方法 2.1 pET14b-His-TAT-p38 和 pET14b-His-TAT-p38(AF)重组质粒的构 建 用 Nde和 BamH限制性核酸内切酶消化 pcDNA3-Flag-p38、pcDNA 3- Flag-p38 (AF)质粒 6 h，琼脂糖凝胶电泳将目的片段 p38 和 p38 (AF)切 胶回收，用上述同样的内切酶消化 pET14b-His-TAT 载体使之线性化，二 者通过 T4 连接酶 16 条件下连接 16 h。连接产物 10 l 转化感受态菌 DH5，铺琼脂糖 LB 平板，37 孵箱倒置培养 1216 h。待平板长出菌 落后，挑取单菌落于 5 ml LB 培养基中(加相应抗生素)，置 37 摇床培 养 12 h，小量制备质粒，利用酶切和测序鉴定重组质粒。 2.2 His-TAT-p38 和 His-TAT-p38 (AF)融合蛋白的原核表达与纯化 将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)，挑取转化后单菌落 置于 2 ml 的 LB/Amp+ 培养液中，室温振摇培养至 D600值约为 0.6 时加入 终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导，继续振摇 3 h。诱导结束后取诱导前和 诱导后菌液 0.5 ml 经 10% SDS-PaGE 鉴定融合蛋白表达的情况。对有融合 蛋白表达的菌落进行大量(500 ml)扩增诱导，用 Ni2离子亲和树脂层析 纯化得到蛋白，最后用 10% SDS-PaGE 电泳鉴定蛋白的纯度。His-p38 蛋 白和 His-TAT-EGFP 蛋白的表达与纯化方法同上。用 CB-Protein AssayTM 试剂盒测定蛋白含量。 2.3 TAT 介导的融合蛋白跨膜转导进入真核细胞效率的检测 将纯化得到的蛋白放入预先配好的 1PBS 透析液中，4 透析过夜， 透析完毕后蛋白经过滤器过滤除菌备用。将 ECV304 细胞传代至 6 孔板内， 然后将过滤后的融合蛋白分别按照以下方法加入细胞。浓度依赖性实验： 将 His-TAT-p38 蛋白分别按 15 g/ml， 30 g/ml，45 g/ml 的浓度 加入细胞孵育 2 h。时间依赖性实验：将 His-TAT-p38 蛋白以每孔终浓度 为 1000 nmol/L 加入 6 孔板内与细胞分别孵育 180 min， 120 min， 60 min，30 min。TAT 介导的融合蛋白进入细胞实验：以每孔终浓度为 500 nmol/L 分别将 His-p38，His-TAT-p38，His-TAT-p38(AF)突变体蛋白加入 细胞孵育 2 h。孵育结束后，彻底吸去原培养基，用冰预冷 PBS 将 6 孔板 内细胞小心冲洗 3 遍。加入 100 l/孔冰预冷的 Triton/甘氨酰甘氨酸裂 解缓冲液，冰上裂解细胞 30 min。用细胞刮小心刮下裂解细胞，用移液 器将细胞裂解物迅速移入冰预冷的 1.5 ml 微量离心管中。12000 r/min、4 离心 10 min 后，取上清分别以兔源抗 p38 抗体(11000 稀 释)和兔源抗 actin 抗体(11000 稀释)为一抗，HRP 标记的抗兔 IgG(11000 稀释)为二抗行 Western blot 检测。 2.4 His-TAT-p38 及其突变体对 p38 活性的影响 将 ECV304 细胞传代至 6 孔板内，待细胞进入对数生长期后，实验分 四组：对照组不加任何蛋白；第二组加入 His-TAT-p38(AF)突变体蛋白； 第三组加入 His-TAT-EGFP 蛋白；第四组加入 His-TAT-p38 蛋白，每组又 分为刺激组和无刺激组。按照分组分别加入终浓度为 750 nmol/L 的融合 蛋白与细胞孵育 12 h，孵育结束后撤掉原培养基，用无血清培养基培养 稀释 Sorbitol 至终浓度 0.4 mol/L，分别加入各组中刺激 0.5 h，裂解细 胞取上清分别以兔源抗 ATF2 抗体、抗磷酸化 ATF2 抗体(均为 11 000 稀 释)为一抗，HRP 标记的抗兔 IgG(11 000 稀释)为二抗行 Western blotingt 检测。 3 结果 3.1 pET14b-His-TAT-p38 和 pET14b-His-TAT-p38(AF)重组质粒的构 建 将重组质粒用 Nde和 BamH双酶切后进行 1%琼脂糖电泳，可以看 到两条带，大小分别约为 4 740 bp 与 1 080 bp，与预期大小一致。测序 证实构建正确(图 1)。 图 1 重组质粒 pET14b-His-TAT-p38 和 pET14b-His-TAT-p38 (AF)酶切鉴定图 Fig.1 Identification of pET14b-His-TAT-p38 and pET14b- His-TAT-p38 (AF) vectors M: 1 kb DNA marker; Lane 1: pET14b-His-TAT-p38 digested with Ndeand BamH; Lane 2: pET14b-His-TAT-p38(AF) digest with Ndeand BamH 3.2 融合蛋白的原核表达与纯化 pET-His-p38、pET-His-TAT-p38 和 pET-His-TAT-p38 (AF)质粒转化 大肠杆菌 BL21(DE3)，挑取单个菌落培养经 IPTG 诱导后，经 Ni2+-NTA 磁 珠亲和层析纯化，10%SDS-PaGE 凝胶电泳可见在 41 kD 左右见到一特异性 蛋白条带。His-p38 蛋白约 40 kD(图 2)。 图 2 His-TAT-p38、His-TAT-p38 (AF)蛋白以及 His-p38 蛋白 表达纯化 Fig.2 Expression and purification of His-TAT-p38, His-TAT-p38(AF) and His-p38 M: protein marker; Lane 1: First elution of His-TAT-p38; Lane 2: Second elution of His-TAT-p38; Lane 3: First elute of His-TAT-p38(AF); Lane 4: Second elution of His-TAT- p38(AF); Lane 5: First elution of His-p38; Lane 6: Second elution of His-p38 3.3 His-TAT-p38、His-TAT-p38(AF)蛋白转导进入细胞的检测 首先将 ECV304 细胞传代至 6 孔板内，待细胞进入对数生长期后，将 过滤好的 His-TAT-p38 蛋白，His-TAT-p38(AF)蛋白和 His-p38 蛋白分别 加入培养的细胞孵育 2 h，用兔源抗 p38 抗体(11 000 稀释)和兔源抗 actin 抗体(11000 稀释)为一抗行 Western blot 检测，结果见图 3。对 检测得到的蛋白条带进行灰度扫描并根据净灰度值比值计算得到两种蛋白 的导入效率分别为 65%和 69%，这一结果证实了 TAT 介导的融合蛋白 p38 及其突变体能够高效地进入 ECV304 细胞。 按照一定的浓度梯度将 His-TAT-p38 蛋白加入细胞培养上清，37 孵育 2 h，同样用兔源抗 p38 抗体(11 000 稀释)和兔源抗 actin 抗体 (11 000 稀释)为一抗行 Western blot 检测，结果见图 4；然后，按照 一定的时间间隔将 His-TAT-p38 蛋白加入 6 孔板内与细胞孵育，同样用抗 p38 抗体为一抗行 Western blot 检测，结果见图 5；融合蛋白 His-TAT- p38(AF)的结果同此一致，由此可见，融合蛋白 His-TAT-p38 及其突变体 能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞。 图 3 TAT 介导的 p38 及其 AF 突变体蛋白进入真核细胞 Fig.3 TAT-mediated entry of p38 and its mutant fusion protein into the cells A: Western blotting detection of p38 and its mutant entering ECV304 cells mediated by TAT. Lane 1: His-TAT-p38 protein; Lane 2: Cell lysate with His-TAT-p38 protein; Lane 3: His-TAT-p38(AF) protein; Lane 4: Cell lysate with His- TAT-p38(AF) protein; Lane 5: His-p38 protein; Lane 6: Cell lysate with His-p38 protein. B: Bar chart of quantification of TAT-mediated protein entering the cells. The results are representative of 3 independent experiments. Internalization rate represents the percentage ratio of the optical density of the internalized protein to that of total input protein. 图 4 TAT 介导的 p38 蛋白以浓度依赖性方式进入细胞 Fig.4 Concentration-dependent entry of His-TAT-p38 into ECV304 cells A: Western blotting of His-TAT-p38 protein entering ECV304 cells; B: Bar chart of quantification of His-TAT-p38 fusion protein entering ECV304 cells 图 5 TAT 介导的 p38 蛋白以时间依赖性方式进入细胞 Fig.5 Time-dependent entry of His-TAT-p38 into ECV304 cells A: Western blotting assay of His-TAT-p38 protein entering ECV304 cells; B: Bar chart of quantification of His-TAT-p38 fusion protein entering ECV304 cells 3.4 TAT 介导 p38 及其突变体进入细胞对 p38 活性的影响 首先将 ECV304 细胞传代至 6 孔板内，待细胞进入对数生长期后根据 实验分组将过滤好的可溶性蛋白 His-TAT-p38 和 His-TAT-p38(AF)突变体 以及 TAT-EGFP 按照每孔终浓度为 750 nmol/L 加入各孔，孵育 12 h 后， 撤掉原培养基，加入无血清培养基，按照 0.4 mol/L 终浓度加入 Sorbitol 刺激 0.5 h 后，裂解细胞离心取上清行 Western blot，检测 p38 底物 ATF2 磷酸化水平，观察加入的外源性 His-TAT-p38(AF)蛋白对 p38 MAPK 通路功能的影响。结果可见，导入 His-TAT-p38 蛋白后，未加 刺激的 ECV304 细胞的 p38 MAPK 活性有所增加，给予刺激后，其活性显著 增高，而导入 His-TAT-p38(AF)突变体蛋白后，在给予刺激的情况下， p38 MAPK 活性被显著抑制(图 6)。 图 6 His-TAT-p38 及其无活性突变体对高渗刺激诱导的 ATF2 磷酸化的影响 Fig.6 Effect of His-TAT-p38 and its dominant negative form on the phosphorylation of ATF2 induced by sorbitol in ECV304 cells 4 讨论 完整的 TAT 蛋白由 86 个氨基酸组成，Schwarze 和 Watson 等确定 TAT 蛋白内介导蛋白传递的核心序列由 11 个氨基酸组成，其序列为 YGRKKRRQRRR5，6。虽然 TAT 介导的蛋白转导在 1998 年首先被报道， 但其转导机制并不清楚，在活细胞上应用可转导的 TAT-Cre 重组报告基因 检测后，人们发现 TAT 融合蛋白中一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷 的多肽片段与跨膜转导有关，因而被称为蛋白转导结构域(PTD)，目前对 PTD 进入细胞的机制尚不完全清楚，有人认为它可与细胞表面离子作用后， 由液态脂质依赖的胞饮作用(一种特殊形式的内吞作用)进入细胞。 将这 一核心序列与多肽、蛋白质及 DNA 共价连接后，它们将不依赖于受体和转 运物质进入几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率很 高而且对细胞没有损伤。 p38 MAPK 信号通路参与了细胞的生长发育及细胞间功能同步等多种 生理过程，并与炎症、应激反应的调控密切相关，被认为是细胞信息传递 的交汇点和共同通路78910。在这条通路中，当各种信号由细胞 外跨膜转导进入细胞后，激活胞内的蛋白激酶级联，导致 p38 磷酸化激活， 活化的 p38 转位入核，进一步磷酸化核内的转录因子，从而调节相关基因 的表达，进而影响细胞的许多生理过程。p38 通路对多种细胞生理病理过 程都是非常重要的，其磷酸化就像是一个阀门，当它开启的时候，细胞内 可发生正常或异常的生理反应。适度的 p38 磷酸化参与多种细胞的生理状 态下的功能活动调节，而 p38 的异常磷酸化可以引发多种疾病，我们利用 TAT 介导的蛋白转导技术将 p38 及其突变体导入真核细胞，对于研究 p38 通路的功能有着重要的意义。 为了研究 TAT 能否有效地携带 p38 及其突变体进入 ECV304 细胞，我 们将蛋白 His-TAT-p38 及其突变体，以及 His-p38 分别加入已经铺好的 6 孔板内与细胞孵育，结果显示目标蛋白 His-TAT-p38 及其突变体能够被高 效地转导进入细胞，而 His-p38 蛋白则几乎不能进入细胞，同时我们对检 测得到的蛋白条带进行灰度扫描，并根据净灰度值比值计算得到两种蛋白 的导入效率分别为 65%和 69%，这一结果证实了 TAT 介导的融合蛋白 p38 及其突变体能够高效地进入 ECV304 细胞。进一步的实验结果证实，加入 的 His-TAT-p38 蛋白随着浓度从 15 g/ml 增加到 45 g/ml，进入 ECV304 细胞的蛋白量也随着增加；同样，随着时间的延长，进入细胞的 蛋白量也相应增加，而加入蛋白 120 min 后，进入细胞的蛋白量不再显著 增加，说明此时进入细胞的蛋白量已经达到饱和。这些结果证实了 TAT 介 导的 p38 蛋白以时间依赖性和浓度依赖性方式进入 ECV304 细胞。我们利 用 p38 无活性突变体不能被外来刺激激活而磷酸化的原理，通过 TAT 蛋白 转导系统将 p38 及其无活性突变体导入细胞，观察其对细胞内源性 ATF2 磷酸化水平的影响，结果发现导入的野生型 p38 可增强内源性 p38 的功能， 而无活性突变体则竞争性抑制了内源性 p38 MAPK 蛋白的功能，从而阻止 或抑制其对内源性底物 ATF2 的磷酸化，使得信号不能传递下去，进而抑 制 p38 MAPK 通路的活动，这一结果对于探索新的控制炎症的途径有着非 常重要的理论与实践意义。至此我们的 p38 MAPK 蛋白转运系统构建成功， 为我们进一步研究建立了一个很好的技术平台，并为以后的基础研究和临 床研究提供了思路和理论基础。 参考文献： 1Jiang Y, Li Z, Schwarz EM, et al. Structrue-fuction studies of p38 mitogen-activated protein kinaseJ. J Biol Chem, 1997, 272(17):11096-102. 2Han J, Lee JD, Jiang Y, et al. Characterization of the structure and function of a novel MAP kinase kinase(MKK6) J. J Biol Chem, 1996, 271(6): 2886-91. 3Ensoli B, Barillari G