家畜传染病学教学实习

实习一 猪瘟的诊断 目的 了解和掌握猪瘟的现场诊断和实验室诊断方法 内容及方法 猪瘟的诊断程序 一 猪瘟病例的人工感染 （一） 种毒：为购自中国兽药监察所的猪瘟中国石门系强毒，采集高热期抗凝血保存， 或采集病死猪的脾脏、淋巴结研磨处理，按稀释 1：10 倍稀释，加双抗处理后使用。 人工感染或自然病例 观察症状 剖检 兔体交互免疫试验 扁桃体、淋巴结、脾 采集病料 脾脏 观察病理变化 荧光抗体诊断 冰冻切片 冷丙酮固定 4C10min 猪瘟荧光抗体染色 37C 作用 30min PH 8.0PBS 液涮洗 5min 0.1伊文斯兰复染 3s5s PH8.0 PBS 液涮洗 2min 碳酸盐缓冲液封裱 荧光显微镜下观察 判定结果 称重、匀浆 制备 1：10 的组织悬液 加双抗 4下作用 6h 肌肉注射实验家兔 3 只，5mL/只 对照组家兔 3 只，注射生理盐水 5mL/只 观察测温 7 天 耳静脉注射 100 倍稀释的猪瘟兔化弱毒 1mL/只 测温 4 天，每天 4 次 绘制两组兔的体温曲线 判定结果 2 （二） 感染用猪：应选用断奶后未经猪瘟疫苗免疫的猪。 （三） 感染方法：用血毒或脾、淋毒，肌肉注射、滴鼻、口服，每头共计 4mL。 （四） 感染时间：最好于试验前 67 天（1 周）进行。一般 23 天潜伏期，7 天后就可 死亡。 二 观察临床症状，剖检观察病理变化，采集病料 （一）临床症状 最急性型：突然发病，症状急剧，主要表现高温稽留，皮肤和黏膜有紫绀和出血，与一般 败血症无异，一至数天死亡。 急性型： 1突然发病，食欲显著减少或完全停食，喂食时，不表现饥饿感，徐徐走近食槽，缓慢嚼 食，但食数口后，即退出卧下，有的病猪连续多天完全停食，有时呕吐。 2精神高度沉郁，伏卧嗜眠，肌肉震颤，常挤卧于一隅或钻入草堆，呈怕冷状，触动时或 发低沉的叫鸣而不动，或徐徐站起，走几步后，又卧地，或表现敏感，发出尖锐的叫声， 站立或行走时，背腰弓起，四肢软弱无力，发抖，行动缓慢，摇摆不稳。 3体温升高至 41以上，高的可达 42以上，稽留不退，死前降至常温以下，在体温升 高时，白细胞减少，约 13000 以下，甚至仅有 3000，一般以发病后 47 天最低，血小板 也减少。 4两眼无神，开张不全，常有多量粘液浓性分泌物，清晨可见两眼粘封，不能开张，结 膜潮红发炎，后期结膜苍白，常有出血斑点，口腔黏膜苍白或发绀，唇内面、齿龈、口角、 会厌、喉头和阴道等处的黏膜可能有出血斑点。 5皮肤通常充血，末期多呈现贫血状态，有些部位如鼻端、嘴唇、耳、下颌、四肢、外阴 等处，可能出现紫绀区或出血变化，公猪包皮内积有尿液，挤压时流出浑浊发臭的尿液。 6初便秘后腹泻，初期粪便干结，呈小球状，后期腹泻状粪便，病程长的便秘和腹泻交替 出现。 7病程为 13 周，后期常并发细菌感染，以肺炎和坏死性肠炎最为多见。 8有的病猪主要表现神经症状，嗜眠、磨牙、全身痉挛、体躯强直、不易起立、运动障碍。 亚急性型：似急性型，但较缓和，有时好转，病程约 34 周。 慢性型：消瘦，贫血，衰弱，伏卧，时有轻热，食欲不振。便秘和腹泻交替，有的皮肤有 紫斑或坏死痂，病程在一月以上。 （二）病理变化 急性型： 1淋巴结的变化比较特殊，以腹腔淋巴结最为明显，表现肿大充血，呈暗红色，切面多汁， 呈弥漫性出血，边缘部分尤为显著，杂有贫血变化，因而呈大理石状。 3 2肾色较淡，出血斑点分布在皮质，髓质少见，肾盂和肾乳头也常见到。 3脾不肿大，边缘呈出血性梗死，有突起小块，色紫黑。有时为边缘性出血带。 4胆囊黏膜可能有出血斑点或坏死。 5肺充血出血、支气管肺炎。 6、扁桃体常有炎症，初期轻，后期发展成为两侧性坏死性炎症。 7、喉头和膀胱黏膜也常见出血点。 慢性型：主要为坏死性肠炎，一般见于回肠末端，盲肠和结肠的黏膜上，炎症从淋巴滤泡 开始，向外发展，因而形成同心轮层状的钮扣状溃疡，突出于黏膜面，色褐或黑，中央低 陷，有的有剥脱现象。 （三）病料采集：脾、淋巴结、扁桃体、肝、肾。 三、病料研磨与处理 脾 称重 剪碎 研磨 稀释（W/V）1：10 反复冻融 3 次 双抗处理 （1000u/mL）4作用 6h 以上 离心取上清液-20保存。 四、病料冰冻切片 1连接好半导体致冷器和切片机后，检查水管是否接好，先开冷却水，再开致冷器，预热 minmin。 将致冷键置于刀台共冷上，调节电流到 1520m处，刀台即开始逐渐冷却。 调节切片厚度至um um。 待台上结霜后将修好的组织块贴于台上，待组织块冻实后，转动手动摇把，先修正组 织块，再切片，迅速将切下的组织薄片贴于玻璃片上。 自然干燥或风干后，用冷丙酮固定，min。 6取出晾干或风干，贴标签，用纸包好，外用厚而不漏水的塑料袋密封，置保存。 五病料上清液接种家兔（兔体交互免疫试验） 注意：测温要认真，仔细。 六猪瘟荧光抗体染色、观察 1在固定好的冰冻切片上滴加数滴猪瘟荧光抗体，置 37水浴箱中作用 30min。 2用 pH7.2 的 PBS 漂洗 3 次 ,每次 5 min10min 。 健康家兔 12 只 一组 6 只 二组 6 只 观察测温 3 天，2-3 次/天 体温应正常 测温 57 天 8h 一次，3 次/日 试验组 3 只 对照组 3 只 一组 试验组 3 只 对照组 3 只 二组 接种生理盐水 5mL/只 接种病料上清液肌注 5mL/ 只 4 3干后滴加甘油缓冲液，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。 4如细胞胞浆内有弥漫性，絮状或点状的亮黄绿色荧光，为猪瘟；如仅见暗绿或灰蓝色， 则不是猪瘟。 5试验设已知含猪瘟病毒材料压印片和不含猪瘟病毒材料压印片，作为阳性和阴性对照。 6标本染色和漂洗后，浸泡于 5%吐温 80PBS（pH7.2，0.01mol）中h 以上，可 除去非特异染色，晾干后用 0.1伊文思蓝复染 1530min，检查判定同上。 七、猪瘟兔化弱毒接种试验家兔 （一）猪瘟兔化弱毒 1猪瘟兔化弱毒疫苗：生药厂生产，在有效期范围内 2家兔猪瘟兔化弱毒脾脏：采自具有定型热或轻型热反应的家兔，称重 研磨 反复 冻融 3 次 离心取上清液 双抗处理 备用。 （二）接种方法 试验组与对照组家兔耳静脉注射 1mL/只，注意缓慢注射。 （三）接种后的管理与观察 1观察注射后家兔的反应。 2测温：每 6h 测温一次，4 次/日，连续测温 3 天，当出现典型的定型热或轻型热反应后， 于体温下降至常温前扑杀，采毒。 八、猪瘟兔体交互免疫试验的结果判定 （一）几个概念 1常温：家兔接种前数次体温的平均值。 2潜伏期：由接种时算起，到体温上升超过常温的间隔时间。 3稽留期：从体温超过常温 0.5以上算起，到体温下降或接近常温时的间隔时期。 （二）体温反应的类型 热型 潜伏期 温差 温次 稽留期 定型热 24h48h 1 3 次 18h36h 轻型热 24h72h 0.5 2 次 12h36h 可疑热反应 24 或72，体温曲线起伏不定12h 或36h 无热反应 体温正常 （三）判定标准 1试验成立的条件：当对照组家兔注射猪瘟兔化弱毒后发生定型热或轻型热反应，则说明 试验成立，即所注射的就是猪瘟兔化弱毒。 2. 根据试验组家兔发生的热反应，进行判定。 接种病料后 接种兔化毒后 结果 +（猪瘟） + （病料内有兔化弱毒） + （非猪瘟，不含猪瘟病毒） + + （非猪瘟，含非猪瘟病毒的致热物质） 5 实习二 鸡新城疫的诊断 目的 1 掌握鸡新城疫的临诊诊断要点。 2 系统地了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。 内容与方法 实验鸡选择病毒增殖 鸡新城疫的诊断程序 人工感染鸡 临床症状观察 剖检、病理变化观察 员 病料采集 肝、脾、法氏囊、盲扁、 肾 脾、脑、肝 称重、匀浆、制成 1：5 悬液冰冻切片 冷丙酮固定 410min 加双抗 4处理 6h 新城疫荧光抗体染色 接种 911 日龄鸡胚尿囊腔 37作用 30min 3738孵育 72h 收集鸡胚尿囊液 做血凝试验检测尿囊液的血凝性 PBS 液涮洗 5min 0.1%伊文思兰复染 5s PBS 洗 2min 碳酸盐缓冲甘油封裱 荧光显微镜观察 判定结果 4保存 做血凝抑制试验 6 一、新城疫病例的人工感染 1 试验鸡的选择：最好是 SPF 鸡，如无条件用 SPF 鸡时，一定要选 ND 非免疫鸡。 2 NDV 强毒的准备：用 NDV F48E9 株经鸡胚尿囊腔增殖，最好通过易感鸡复壮，达到毒 力强，毒量足。 3 感染：肌肉注射，点眼，滴鼻，1mL/羽。 二、临床症状与病理变化观察及病料采集 1主要临床症状： 体温升高，达 4344，食欲减退或废绝，有渴感。 1 精神萎顿，垂头缩颈或翅膀下垂，眼半开或全闭，状似昏睡，鸡冠及肉髯发紫。 2 呼吸困难，伸头，张口呼吸，有“咯咯”的喘鸣音。 3 口角流出多量粘液，常混有饲料颗粒，为排出此粘液病鸡常作摇头或吞咽动作。 4 嗉囊胀软，充满液体，倒提时有大量酸臭的液体从口角流出。 5 排稀薄的粪便，呈黄绿色或黄白色，有时带血，后期排出蛋清样物。 6 有的有神经症状。 7 2病理变化 嗉囊内充满酸臭的稀薄液体和气体。 1 腺胃粘膜水肿，其乳头和乳头间有鲜明的出血点，或有溃疡和坏死。 2 肌胃角质层下常见有出血点。 3 肠粘膜有大小不等的出血点，尤其是十二指肠和直肠，也有纤维素性坏死性病变。 4 盲扁常见肿大，出血和坏死。 5 气管出血，肺瘀血或水肿。 6 心冠脂肪有细小如针尖大的出血点。 7 肝、脾、肾无特殊病变。 8 脑膜充血或出血。 9 3.病料采集： 病毒分离材料：肝、脾、肾、脑等，低温冻结保存。 荧光抗体检验材料：肝、脾、肾、法氏囊，盲扁，4冷藏保存，不能冻结。 三、病料的研磨与处理：脾、脑 称重 研磨 1：5 稀释 反复冻融 3 次以上 离心取上清液 双抗处理 4作用 6h 以上 20冻存 四、病料的冰冻切片 1连接好半导体致冷器和切片机后，检查水管是否接好，先开冷却水，再开致冷器，预热 minmin。 将致冷键置于刀台共冷上，调节电流到 1520m处，刀台即开始逐渐冷却。 调节切片厚度至um um。 7 待台上结霜后将修好的组织块贴于台上，待组织块冻实后，转动手动摇把，先修正组 织块，再切片，迅速将切下的组织薄片贴于玻璃片上。 自然干燥或风干后，用冷丙酮固定，min。 6取出晾干或风干，贴标签，用纸包好，外用厚而不漏水的塑料袋密封，置保存。 五、鸡胚接种 病毒分离除用鸡胚外，还可用实验动物 （一） 目的：进行病毒的分离与培养 组织培养，细胞培养 （二） 实验条件的准备： 1鸡胚： 选卵：受精的鸡蛋，最好是白壳蛋，SPF 蛋最佳，必须新鲜。保存在 1 520不能超过 10 天，超过一个月孵化率接近于 0。 孵育：37.538.5的温箱或孵化箱内，相对湿度 5040，另外必须保证空气流 2 通。 检卵：孵化后 45 天检卵，记录受精率，检出未受精卵，以后应每天观察一次，观察发 3 病情况。未受精卵只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹，活胚具有清晰的血管和鸡 胚暗影，较大的鸡胚还可见胚动。死胚血管昏暗模糊，没有胚动。 画气室和胚位置 4 2. 分离材料的准备：取出经处理过的病料冷冻液，常温解冻后，恢复至室温。 3其它器械：5 #、6 #、7 #针头，1mL 或 2mL 注射器、镊子、石蜡等 （三） 操作程序 1消毒：先用碘酒棉在气室部位涂擦，然后再用酒精棉脱碘。 2打孔：在气室顶端稍偏向于胚侧，用 7#针头打一小孔。 3接种：用 1mL 注射器吸取病料液，接种鸡胚尿囊腔，0.2mL胚。 4封孔：石蜡熔化后涂在打孔部位。 （四） 接种后的管理 1 接种后放孵化箱继续孵育。 2 24h 后照蛋，检出死胚弃去。 3 24h 后，每隔 6h 照蛋一次，检出死胚置 4条件下冷藏。 4 注意补充温箱内的水份。 六、鸡胚剖检与“病毒”收获 （一）器械准备 剪刀，镊子，盐水滴头，橡皮乳头每人 2 套青霉素瓶每人 4 个，瓶塞每人 4 个瓶签每 人 4 张或用医用胶布代替。 （二）收毒程序 8 1将死亡鸡胚由 4冰箱取出，于电风扇下吹 15min 使之与室温平衡。 2鸡胚直立于蛋架上，气室朝上，用碘酒棉擦试消毒，然后用酒精棉脱色（碘） 。 3用无菌镊子打开气室，去掉蛋壳，使整个气室充分暴露。 4用无菌镊轻轻夹起壳膜，并将壳膜撕掉。 5镊住绒毛尿囊膜夹起，用剪刀剪一大口，暴露尿囊腔。 6用镊子插入尿囊腔，压住鸡胚，然后用一盐水滴头或吸管插入镊子口中间，轻轻吸取尿 囊液，放入灭菌青霉素瓶中，加盖。每胚收集两瓶，量多者用于保存，量少者用于检测。 7贴上标签，写上姓名，毒种及毒名（病料来源） ，鸡胚死亡时间（接毒后的时间） ，测毒 价（血凝价） 8置低温下保存。 9观察鸡胚病变。 （三）注意事项： 1严格的无菌操作，如果属于具有高度感染力及可感染人的病毒，更应采取严密的保护措 施，以免扩散病毒或发生实验室感染事故。 2打开气室后，注意不要使卵壳碎屑落入胚内。 3吸收尿囊液时要小心，不要碰破卵黄囊。 4如发现污染或胚内混浊，则不要收集，应弃去。 5标签一定要写清楚。 七、血凝与血凝抑制试验的准备 （一） 条件准备 1抗凝剂：3.8的柠檬酸钠。 注射器与针头：煮沸消毒时，注意离子浓度与 p的平衡。 洗涤液： 生理盐水； p7.2，0.01的 PBS 液 （二）采血：选取健康鸡只，翅静脉或心脏采集抗凝血。只鸡血混合，保存，最 好选用非免疫鸡。 （三）红细胞的离心洗涤 1500r/min 离心 10min，洗涤 34 次，留红细胞泥加洗涤液为血量的 35 倍。 (四) 1%红细胞的配制 吸取红细胞泥，加入 PBS 或生理盐水配成 1%浓度，最好于 4静置过夜，次日摇匀， 这样的红细胞的凝集图像更清晰。 八、新城疫切片荧光抗体染色，观察 1在固定好的冰冻切片上滴加数滴鸡新城疫荧光抗体，置 37水浴箱中作用 30min。 2用 pH7.2 的 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min10min 。 3干后滴加甘油缓冲液，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。 9 4如细胞胞浆内有弥漫性，絮状或点状的亮黄绿色荧光，为鸡新城疫；如仅见暗绿或灰蓝 色，则不是鸡新城疫。 5试验设已知含鸡新城疫病毒材料压印片和不含鸡新城疫病毒材料压印片，作为阳性和阴 性的对照。 6标本染色和漂洗后，浸泡于 5%吐温 80PBS（pH7.2，0.01mol）中h 以上，可 除去非特异染色，晾干后用 0.1伊文思蓝复染 1530min，检查判定同上。 九、新城疫病毒的鉴定 （一） 血凝试验 、条件 （1） 96 孔 V 型聚乙烯塑料血凝反应板 （2） 加样器 （3） 稀释液：生理盐水； 0.01 p7.2 PBS 液 （4） 鸡红细胞悬液 2操作 于 V 型血凝板的每孔中滴加 PBS（pH7.2）0.05mL，共滴 4 排；吸 1：5 稀释抗原滴加 于第一列孔，每孔 0.05mL，然后由左至右顺序倍比稀释至第 11 列孔，再从第 11 列孔各吸 0.05mL 弃之，最后一列不加抗原作为对照；于每孔中加入 1%红细胞悬液 0.05mL，置微型 混合器上振荡 1min，或以手持血凝板圆圈混匀；置室温下（ 1820）3040min ，根据血 凝图像判定结果。 3判定： 以使红细胞发生 100凝集的尿囊液的最大稀释度为其血凝价，当血凝价（）大 于或等于 23 时，判为具有血凝性。 （二） 血凝抑制试验 1条件准备 （1）96 孔型反应板，加样器，稀释液 （2）抗 NDV 标准阳性血清 （3）被检抗原及其单位抗原 （4）己知 NDV 标准抗原 （5）抗 NDV 阴性血清 （6）鸡红细胞悬液 2操作 试验在 96 孔 V 型血凝板上进行。先取 PBS（pH7.2）0.05mL 加入第 1 孔，再取 4 个 HA 单位的抗原加入 312 孔，每孔 0,05mL，再取 8 个 HA 单位的抗原 0.05mL 加入第 2 孔。用稀释器吸被检血清 0.05mL 放入第 1 孔（血清对照）下，挤压混匀后吸 0.05mL 放入 10 第 2 孔。依次倍比稀释至第 12 孔，吸 0.05 弃去；置室温（1820）下作用 20 分钟。用 稀释器滴加 0.05mL 红细胞悬液于各孔中，振荡混合后在室温下静置 3040min，判定结果。 每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照。 微量法 HI 试验操作术式如表 1。 表 1 微量法 HI 试验操作术式 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 孔 号 滴度 （lg 2） 材 料 对照 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.5%鸡红血细胞悬液 （ mL） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 作用时间及温度 1820 静置 3040min 判定举例 + + # # # 4 结果判定 以 100抑制红细胞凝集的血清最大稀释度作为血清的效价，当其大于或等于 24 时， 即可判定该被检抗原（病毒）为 ND 抗原（病毒） 。 PBS（mL） 8HA 单位抗原 （mL ） 4HA 单位抗原 （mL ） 被检血清（mL） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 11 实习三 禽霍乱的诊断 目的 掌握巴氏杆菌病的临诊诊断要点和微生物学诊断步骤和方法 诊断程序 人工感染或自然病例 观察临诊症状 剖检病鸡，观察病理变化 采集病料（胸水、腹水、心包液、心血、肝、脾、淋巴结） 病料涂片或抹片，革兰氏染色镜检（看是否有两极着色的小杆菌） 病料接种血平板，37培养 24h 后 挑纯培养 生化鉴定 动物试验 （取菌液皮下或腹腔注射小白鼠，0.2ml/只。小白鼠多在 18h24h 左右死亡， 采取其心血或其它脏器涂片，美兰染色镜检，可以看到两极着色的小杆菌。 ） 总结分析，得出结论 内容及方法 糖发酵试验： 葡萄糖、蔗糖、果糖 、甘露醇、鼠李糖、 乳糖、棉子糖、麦芽糖 M R 试验： 阴性 V P 试验： 阴性 吲哚试验： 阳性 麦康凯平板上生 长情况:不生长 观察菌落形态（淡灰色、圆 形、边缘整齐较平坦闪光的露 珠样小菌落，不溶血。 ） 涂片，进行革兰氏染色镜检 （G -，球杆状或双球状的小杆菌， 两极着色现象少见） 12 一、人工复制病例 1菌种：C 48-1 菌株，在血平板上传代 皮下注射小白鼠（使毒力增强） 小白 鼠 死后，从其体内分离到细菌。 2感染动物：健康大公鸡 3感染方式：2ml/只肌注，或 1m1/只肌注/1m1/只静注。 二、禽霍乱临诊症状观察 潜伏期：自然感染为 29 天；人工感染为 24h48h。 由于疾病的流行时期，家禽的抵抗力和病菌的致病力强弱不同，所表现的症状亦有差 异，一般分为最急性、急性和慢性。 1最急性：多见于流行初期，多发于产蛋率高的鸡。常无前驱症状而死亡，有时病鸡 不安，精神沉郁，倒地挣扎，拍翅抽搐，数分钟到几小时死亡。 2急性：最常见。常见的症状有： 体温升高 43-44，全身症状明显。腹泻，排黄 色稀粪。呼吸困难，口鼻分泌物增加。产蛋鸡停止产蛋。 ）病程短的约为半天，长的 13 天，病死率高。 3慢性：多由急性不死转化而来，多见于流行后期。以慢性肺炎，慢性呼吸道炎和慢 性胃肠炎症状较为多见。有些病鸡一侧或两侧的肉髯显著肿大 出现干酪样坏死 干 结、坏死脱落。有的病鸡关节肿大、疼痛，脚趾麻痹、跛行。 三、剖检病鸡、观察病变 剖检病变可能有：病鸡的腹膜、皮下组织及腹部脂肪有小点出血。心包增厚，心包内 积有多量透明淡黄色液体，有的含有纤维素状液体，心外膜、心冠脂肪出血尤为明显。肝 的病变有特征性：肝稍肿、质变脆呈棕色或棕黄色，肝表面散有许多灰白色，针尖大的坏 死点。肌胃出血显著，尤以十二指肠卡他性和出血性肠炎为明显，肠内容物内含有血液。 脾一般不见明显变化，或稍肿大，质软。肺有充血和出血点。 四、细菌分离培养 1. 采集病料 尽可能采取新鲜病料：渗出液（胸水、腹水、心包液） 、心血、肝、脾、 淋巴结。 2. 涂片镜检 取采集的病料制成涂片，用碱性美兰染色或瑞特氏染色，如发现两极着色的小杆状菌 时，即可作出初步诊断。 3. 分离培养 用血平板进行划线分离， 37培养 24h 后观察菌落形态，可见到淡灰色、圆形、边 缘整齐较平坦闪光的露珠样小菌落，不溶血。 取这些菌落制成涂片，进行革兰氏染色检查，可见到 G-，球杆状或双球状的小杆菌， 13 两极着色现象少见。 取血平板上的典型菌落接种于血斜面进行纯培养，37培养 24h。 4生化鉴定 取血斜面上的菌苔涂片，革兰氏染色镜检，检查纯度，如果细菌大小形态一致，而 且与前述典型菌落涂片染色结果一致，则可接种生化培养基和鉴别培养基。37培养 24h48h 后观察结果。 A糖培养基：葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖、麦芽糖、等， 每人 1 管。 B葡萄糖蛋白胨水，每人 2 管 C蛋白胨水，每人 1 管 D麦