开题报告 贾旺旺

毕 业 设 计 开 题 报 告 题 目 气相色谱法分析西洋参人参皂苷含量方法研究 学生姓名 贾旺旺 学号 0812024003 所 在 院 (系 ) 生 物 科 学 与 工 程 学 院 专业班级 生物工程 08 级 1 班 指导教师 曹小勇 秦公伟 2012 年 3 月 10 日 题 目 气相色谱法分析西洋参人参皂苷含量方法研究 一、选题的目的及研究意义 西洋参（学名：Panax quinquefolius L） ，别名花旗参、洋参、美国人参等。五加科，人参 属，多年生草本，全株无毛，是一种珍贵的保健药品，服用方法有煮、炖、蒸食，也可切片 含化或研成细粉冲服，具有滋补、强心、造血、镇静、降血脂、抗癌和抗衰老等多种医疗作 用。 西洋参适生于海拔 1000 米左右的山地阔叶林地带、气候温和、雨量充沛的环境。喜荫湿， 忌强光和高温，生长期最适温度 1824，空气相对湿度 80%左右，对土壤要求较严，适生 于土质疏松、土层较厚、肥沃、富含腐殖质的森林沙质土壤上，PH5.56.5，忌连续种植。 人参皂苷（ginsenoside，GS) 是西洋参的主要有效成分，现已明确结果的 GS 单体约 40 余 种，在人参中的含量为 4%左右。人参皂苷在西洋参不同部位的含量不同：侧根总皂苷 （60.5% ） 、 花蕾总皂苷（ 15%） 、叶总皂苷（7.6-12.6%） 、须根总皂苷（8.5-11.5%） 、参皮 总皂苷（8.0-8.8% ） 人参主根总皂苷（2-7%） 、幼根总皂苷（3%） 、种子总皂苷（0.7%） 。 人参皂苷都具有相似的基本结构，都含有由 30 个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。 他们依糖苷基架构的不同而被分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。达玛烷类型包括两类：人 参二醇型 - A 型，苷原为 20（S ） - 原人参二醇，包含了最多的人参皂苷，如人参皂苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rc 、Rd 、 Rg3、Rh2 及糖苷基 PD。人参三醇型 - B 型，苷原为 20（S ） - 原人参三醇，包含了人参皂苷 Re、Rg1、Rg2 、Rh1 及糖苷基 PT。齐墩果烷型：齐墩果酸型 - C 型，苷原为齐墩果酸。总皂苷不溶血，A 型抗溶血而 B 型、C 型溶血。 气 相 色 谱 系 统 由 盛 在 管 柱 内 的 吸 附 剂 或 惰 性 固 体 上 涂 着 液 体 的 固 定 相 和 通 过 管 柱 的 气 体 的 流 动 相 组 成 。 将 欲 分 离 、 分 析 的 样 品 从 管 柱 一 端 加 入 后 ， 由 于 各 组 分 在 固 定 相 和 流 动 相 之 间 的 分 配 系 数 有 差 别 ， 当 组 分 在 两 相 中 反 复 多 次 进 行 分 配 并 随 移 动 相 向 前 移 动 时 ， 沿 管 柱 运 动 的 速 度 就 不 同 ， 以 各 组 分 从 柱 末 端 流 出 的 浓 度 对 进 样 后 的 时 间 作 图 ， 得 到 的 图 称 为 色 谱 图 ， 根 据 色 谱 图 积 分 可 计 算 出 上 样 品 各 组 分 的 浓 度 。 对于液相色谱法检测西洋参中齐墩果酸（OA）的色谱条件与检测结果，国内外文献报道 有差异。传统液相色谱法测定人参皂苷时，对单个皂苷单体进行理化性质检测，但是由于人 参皂苷在肠胃中迅速转化为各种代谢产物，因此从生物活性角度来说，检测单体皂苷对于实 际药理学、药代动力学研究价值有限，而在气相色谱法中，各种人参皂苷经过裂解后形成不 同的苷元，通过检测各种苷元的理化性质进而测定其中的人参皂苷种类。同时气相色谱分析 法具有，分离效率高，分析速度快，样品用量少和检测灵敏度高，应用范围广等优点，因此 建立皂苷气相色谱法检测方法具有必要性及实用性，同时此技术可应用于西洋参优质品种选 育工作。 二、综述与本课题相关领域的研究现状、发展趋势、研究方法及应用领域等 1. 研究现状 1952 年 James 和 Martin 提 出 气 相 色 谱 法 ， 同 时 也 发 明 了 第 一 个 气 相 色 谱 检 测 器 ， 并 得 到 积 分 色 谱 图 。 近 年 来 ， 气 相 色 谱 法 已 经 广 泛 应 用 于 石 油 化 工 、 医 药 卫 生 、 环 境 监 测 、 生 物 化 学 等 领 域 分 析 研 究 中 。 西 洋 参 作 为 一 种 珍 贵 的 保 健 药 品 ， 在 我 国 引 种 成 功 至 今 已 有 20 余 年 。 同 时 ， 对 西 洋 参 的 品 质 研 究 ， 特 别 是 对 其 有 效 化 学 成 分 和 药 理 作 用 、 药 效 学 研 究 正 逐 步 深 入 并 不 断 取 得 成 果 。 2. 发展趋势 今 后 气 相 色 谱 法 还 将 有 很 大 的 发 展 ， 耐 高 温 的 极 性 高 效 开 管 柱 和 选 择 性 好 、 灵 敏 度 高 的 检 测 器 的 研 制 ， 色 谱 定 性 和 定 量 分 析 规 律 的 研 究 ， 微 处 理 机 进 一 步 的 应 用 ， 生 物 学 、 医 学 、 环 境 保 护 等 方 面 新 的 分 析 方 法 都 是 很 活 跃 的 研 究 课 题 。 智 能 气 相 色 谱 法 的 研 究 也 是 今 后 发 展 的 方 向 。 3. 已有的人参皂苷检测方法 高效液相色谱分析法（High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass 1. Spectrometry） （以七叶神安片人参皂苷Rb3 的测定为例） 方法原理: 本品加乙醇超声处理，放冷，补重，摇匀，滤过，续滤液进入高效液相色谱仪进行 色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长203nm 处检测人参皂苷Rb 3的吸收值，计算出其含量。 试剂：乙醇、乙腈、0.2%磷酸溶液 仪器设备: 高效液相色谱仪、色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按人参皂 苷 Rb3峰计算应不低于 6000）、紫外吸收检测器 色谱条件： 流动相：乙腈为流动相 A，0.2%磷酸溶液为流动相 B 检测波长：203nm 柱温：室温 操作步骤: 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸 收检测器于波长 203nm 处测定人参皂苷 Rb3（C 53H90O22）的峰面积，计算出其含量。 参考文献: 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005 版，一部， p303。 反相高效液相色谱法（以 Rg1 为例）2. 方法：用复合柱吸附层析法除去注射剂中干扰物质。采用 LUNA C18 色谱柱，乙腈- 水-0.1%磷 酸溶液（204040）为流动相，流速 1.2 mLmin-1， 203 nm 为检测波长，柱温 35 ，对 人参及其注射剂进行含量测定。 结果：人参皂苷 Rg1 的峰面积与其浓度线性关系良好（ r=0.999 2） ；样品平均回收率为 98.8%；精密度 RSD 为 0.65%（n=5） 。 气象色谱-质谱。用到两种系统：（1）气相色谱- 质谱联用 Delsi DI 200 气相色谱仪结3. 合包含了 P2A 系统的 Nermag R10-10H 质谱仪和 DB - 5 柱（13.3 米0.18 毫米编号，薄膜厚 度 0.4 微米） 。最初的温度是 200 ，保持 1 分钟，而后以 20/ 分钟速度增加至 300，保 持 15 分钟；质量范围：100-870 （上限可达 2000） 。 （2）惠普气相色谱- 质谱联用 5995c 配备 ahp-7673a 自动进样器和一个 12 米0.2 毫米编号 HP- 1 石英毛细管柱（硅，超性能） 。最初的 温度是 200，保持 1 分钟，而后 15/分钟到 280，保持 2 分钟，最后 300（升温速度 20/分钟） ，保持 10 分钟。离子源 300：数据系统：惠普，59872 气质，RTE-A 版 F。 气相色谱。定量工作由配有火焰离子化检测器和 DB - 5 柱（15 米0.32 毫米编号，薄4. 膜厚度 0.25 微米）的 5890a 惠普气相色谱仪完成。最初在 200保持 1 分钟，然后每分钟升 高 20直到 300，后保持 8 分钟。柱（氦）流速为 2 毫升/ 分钟，进样器的温度是 275， 检测器温度为 290。分流比为 1 : 15，峰面积的测量由惠普 3396a 积分器完成。用于识别目 的，惠普 5890 系列二与组合了 7673a 自动进样器的气相色谱和惠普 3365 系列二 chem-station 一起使用， （柱 DB - 5，13.3 米内径 0.18 毫米，膜厚 0.4 微米） ，其中温度设置如上述。 对于液相色谱法检测西洋参中齐墩果酸（OA）的色谱条件与检测结果，国内外文献报道 有差异。传统液相色谱法测定人参皂苷时，对单个皂苷单体进行理化性质检测，但是由于人 参皂苷在肠胃中迅速转化为各种代谢产物，因此从生物活性角度来说，检测单体皂苷对于实 际药理学、药代动力学研究价值有限，而在气相色谱法中，各种人参皂苷经过裂解后形成不 同的苷元，通过检测各种苷元的理化性质进而测定其中的人参皂苷种类。因此气相色谱法检 测技术具有一定独到优势，建立皂苷气相色谱法检测方法具有必要性及实用性，同时此技术 可应用于西洋参优质品种选育工作。 三、对本课题将要解决的主要问题及解决问题的思路与方法、拟采用的研究方法（技术路线） 或设计（实验）方案进行说明 1.要解决的主要问题： 通过气相色谱检测西洋参中达玛烷型和齐墩果烷型人参皂苷，建立一种新的人参皂苷色谱 检测方法。 2.解决问题的思路与方法： 人参皂苷样品经预处理后，选择合适内标、固定相、流动相及色谱柱，选择合适检测器， 进行检测，通过观察检测结果，寻找新的人参皂苷色谱分析方法。 3.拟采用的研究方法： 实验材料的预处理 熟悉仪器操作 建立标准曲线，样品测定 检测方法考察、优化 检测方法优化 四、检索与本课题有关参考文献资料的简要说明 输入检索词西洋参，并以西洋参细胞培养、愈伤组织和胚状体诱导等为关键词，在万方 数据库和中国知网检索到大量文献，根据课题内容最终确定将以下文献作为主要参考资料： 1WANG Jun - mo (王筠默) . Recent advances on the pharmacological activities of Panax quinquefolius L. (西洋参 药理作用研究的最新进展) . Pharm acol Clin Chin M aterMed ( 中药药理与临床) , 2001, 17(4) : 6 2 Wagner H, Farnsworth NR. Economic andMedicinal Plant Research. Vol 5. New York: Academic Press, 1991. 253 3SU J ian (苏建) , L I Hai - zhou (李海舟) , KONG Ling - yi (孔令义) , et al. HPLC analysis of saponins American Ginseng p roduced in different areas(不同产地西洋参皂甙成分的HPLC 分析) . N at Prod Res Dev (天然产物 研究与开发) , 2004, 16 (6) : 561 4 Wang BX, Cui JC, Liu AJ (1980) Acta Pharmacol Sin 17:6668 5 Xue XM (1986) Chin Tradit Pat Med 11:2021 6 International Federation of Horseracing Authorities (2008) Article 6Prohibited Substances. In: International agreement on breeding, racing and wagering 7Sticher O (1998) Chemtech 28:2632 8 Shibata S, Tanaka O, Shoji J, Saito H (1985) In: Wagner H, Hikino H, Farnsworth NR (eds) Academic Press, London, pp 217284 9 Tanaka O, Kasai R (1984) In: Herz W, Grisebach H, Kiriby GW, Tamm C (eds) Progress in chemistry of natural products. Springer-Verlag, New York, pp 176 10Chen SE, Sawchuk RJ, Staba EJ (1980) Eur J Drug Metab Pharmacokinet 5:161168 11 Morinaga O, Tanaka H, Shoyama Y (2000) Production of monoclonal antibody against a major purgative component, sennoside A, its characterization and ELISA. Analyst 125:11091113 12Tanaka H, Fukuda N, Shoyama Y (1999) Formation of monoclonal antibody against a major ginseng component, ginsenoside Rb1 and its characterization. Cytotechnology 29:115120 13 Fukuda N, Tanaka H, Shoyama Y (2000) Formation of monoclonal antibody against a major ginseng component, ginsenoside Rg1 and its characterization. Cytotechnology 34:197204 14 Morinaga O, Tanaka H, Shoyama Y (2006) Detection and quantification of ginsenoside Re in ginseng samples by ch