心肌katp通道与缺血预处理

心肌 KATP 通道与缺血预处理 张琼、喻田 遵义医学院附属医院麻醉科 摘要：自缺血预处理（Ischemic preconditioning,IPC）现象发现以来，其膜受体和信号 传导通路的机制已基本阐明，但对最终参与细胞保护作用的下游靶作用点，仍然存在许多 疑问。ATP 敏感性钾通道在该保护作用中起了关键性的作用，其确切的作用机制还不太清 楚。现有的研究表明：参与心肌保护作用的 KATP 通道可能主要在线粒体内膜而不是心肌 细胞膜上。并且发现：线粒体功能的保护关系到整个心肌功能的恢复。所以该综述主要讨 论 KATP 通道在缺血预处理中，对心肌以及线粒体功能的保护作用。 关键词：心肌，KATP 通道，缺血预处理 Myocardial KATP Channels in Preconditioning Zhang qiong Abstract:Since the discovery of ischemic preconditioning,the surface receptors and signal transductions pathways underlying this phenomenon have been clarified,but many questions remain about the downstream targets that ultimately protectthe cell.ATP-sensitive potassium channels are thought to play a critical role in the protection,but their exactly mechanism of action has been unclear.Evidences now suggests that the location of the KATP channels relevant to cytoprotection of may be on the mitochondrial inner membrane instead of on the sarcolemma of the cardiac cell.It has also been observed that protection of mitochondrial function play a critical role in the whole reduction of myocardia. So this review discusses the protection of myocardio and mitochondrial functionrole mediated by KATP channels in ischemic preconditioning. Key word:myocardia, kATP channel, ischemic preconditioning 1.IPC 的研究现状 1.1 IPC 现象的发现 IPC 是一种适应性的生物学现象，即心脏组织（或各种其它组织） 经历一次或多次短暂的缺血再灌注后，能有效抵抗随后更长时间的缺血再灌注损伤。这种 适应性现象首次被 Murry 等描述 1，又被称为经典或早期 IPC。IPC 的心肌保护主要表现 为减少缺血心肌的梗死面积 2和再灌注性心率失常 3，并在各种动物中得到证实。早期 IPC 是一个短期保护，抗缺血作用持续 1-3 小时。1993 年 Kuzuya 在狗再体灌注模型中 发现心肌缺血再灌注 24 小时后，再次出现抗心肌梗死面积的保护作用，即延迟 IPC4， 延迟 IPC 一般在 IPC 后 12 到 24 小时出现，可持续 48 至 96 小时。又被称为第二窗保护 作用。以后发现许多物质或药物可模拟 IPC 的保护作用，并应用于各种动物模型中，以此 研究 IPC 的确切机制。 1.2 IPC 的机制研究 1.2.1 膜受体 IPC 的具体的分子机制还未完全阐明。但目前大量的研究认为：IPC 能 使缺血心肌产生内源性的物质如腺苷、 肾上腺素、阿片肽及缓激肽等。这些物质作用于 相应的膜受体如腺苷 A1 受体 5、 肾上腺素、 阿片肽以及缓激肽等受体，参与 IPC 的启动机制。Liu 等首先证实作为触发物质的内源性腺苷的释放，并与腺苷 A1 受体结合， 参与了兔心肌缺血预处理的保护作用 6。适当增加腺苷 A1 受体的表达（约为正常的 30 倍左右） ，可增加大鼠心脏对缺血再灌注损伤的抵抗力，减少心肌梗死面积和再灌注后心脏 收缩功能障碍 7。这些触发物质的释放依动物种族和发动 IP 的缺血程度和时间的不同而改 变 8。如 Schulz9等发现：缓激肽在较为弱的 IP 刺激时，是主要的触发介质，而腺苷多 在 IP 刺激较强时出现。 1.2.2 信号传导通路 在心肌预处理中，可能存在多个蛋白级联信号传导通路，包括酪 氨酸激酶、蛋白激酶 C、磷脂酰肌醇激酶 -3、p-38 丝裂素激活蛋白激酶（MAPK）和 JAK/STAT 等 10。并且首次在兔心的实验中发现腺苷、缓激肽和阿片肽受体的激活最终 都聚集于 Gi 蛋白和 PKC；蛋白激酶 C(PKC)的阻滞剂如多粘菌素 B 的应用废除了 IPC 的 心肌保护作用,而 PKC 的激动剂 PMA 或 OAG 均能模拟 IPC 的心肌保护作用 11。在实验 中还发现 IPC 通过增加 PKC- 的移位传递内源性保护信号的 12，但单独阻滞 PKC 不能 阻止预处理对猪心的保护作用 13，当联合阻滞 PKC 和酪氨酸激酶时，就能有效阻滞该保 护作用，表明在这样的内源性保护机制中存在一个复杂的蛋白激酶级联反应。并且发现不 是所有的 Gi 耦联受体通过同一个传导通路向下传递预处理的保护信号的。例如 5-HD 能 完全阻滞缓激肽和阿片肽对离体兔心的保护而不能阻止腺苷的这种保护作用 14。 1.2.3 终末效应器 相当多的实验都认为 KATP 通道在 IPC 中起着终末效应器的作用。 KATP 通道的直接激活能产生心肌保护作用，Bimakalin、Cromokalim 缺血前应用能限 制狗心脏的梗死面积 15，16 ，17 ，吡那地尔能增加兔心对缺血的抵抗，表明 KATP 通道的 开放可能扮演了急性 IPC 中信号传导通路的最后角色。然而，最新的研究也认为 KATP 通道的开放在延迟 IPC 中起着触发器和/或信号传导因子的双重作用。在兔离体心脏的实 验中发现：KATP 通道的开放通过氧自由基的产生以及随后激酶的激活而产生了心肌保护 作用 18，所以推测 KATP 通道可能是通过激活多个激酶途径中的一条并从而产生氧自由 基而发挥作用 18。 1.3 IPC 在临床的应用 在行冠状动脉旁路移植手术前，先予两次重复缺血两分钟，再灌注 三分钟预处理后，病人术后再灌注早期和 24 小时后，室颤发生率明显减少，证明早期和 延迟 IPC 在人类中依然存在保护作用 3，并在临床上已被逐渐得到应用。 2.KATP 通道的发现 1983 年，Noma 用膜片钳技术,首先在豚鼠的心肌细胞中发现了一 种对 ATP 敏感的钾通道（ KATP） 19,继这个里程碑的发现后，该通道还被观察到存在于 许多其它组织中，如脑、平滑肌、骨骼肌、肠、肾和胰腺等，它在细胞的新陈代谢和膜电 位活动之间起着耦合作用,所以功能上又被称为细胞内的 “新陈代谢传感器” ，又是肌肉收 缩和腺体分泌的重要调节器。在心肌组织中，KATP 通道被认为是心肌保护的调节中枢。 3.KATP通道的结构及特性 KATP通道的分布目前认为主要有两种:分布于细胞膜的胞膜 KATP通道（sarcKATP）和分布于线粒体膜的KATP通道（mitoKATP） 。分子细胞学研 究表明:sarcKATP 通道由中心的四个内向整流钾通道（Kir6.x ）和外围的四个硫脲类受体 (SUR)亚单位形成四聚体的复合体结构 20，21 。内向整流钾通道主要有两种：即 Kir6.1（相对分子量为49000D）,和Kir6.2，它们的主要结构有着高度的同源性(69% 的核 苷酸序列和72% 的氨基酸序列相同); SUR主要有三种，即SUR1、SUR2A和 SUR2B。Kir6.x形成孔道结构，而SUR调节KATP 通道对ATP 、腺苷、通道激动剂以及阻 滞剂的敏感性 22。钾通道的活性只受细胞内ATP浓度的调节 23,24，ATP 对其抑制的最大 半数受抑（IC50）约为10mol/L，KATP 通道开始被抑制，正常胞浆内的 ATP浓度却高 达毫摩尔级为5-10mmol/L,KATP 几乎完全被抑制,细胞内ATP 与细胞内相应结合位点结 合抑制KATP通道，细胞外 ATP不起作用。细胞内ATP浓度下降、酸中毒、乳酸、二磷酸 核苷（如ADP和GDP）均可使KATP通道开放，如心肌缺血时。部分被ATP 抑制的通道在 Mg2+存在时可被ADP激活。KATP通道的内源性调节（受G-蛋白的调控） 25 ：腺苷、 乙酰胆碱、肾上腺素、缓激肽、阿片等可通过G-蛋白相关机理而促使 KATP通道的开放。 KATP通道的外源性调节（药理调节）：钾通道开放剂能降低KATP通道对ATP敏感性， 在细胞内高浓度ATP的情况下，激活钾通道，促使钾通道开放。磺脲类药物能抑制KATP 通道，磺脲类药物如格列苯脲（Glibenclamide 、Gli ）等能高度选择性抑制各类细胞膜上 的KATP通道。钾通道开放剂可降低KATP 通道对ATP的敏感性，表现为ATP抑制K ATP 通道的Ki值发生位移，致使ATP 在较高浓度才有抑制作用，但不改变剂量效应曲线的斜 率。这种竞争性抑制提示ATP通道开放剂和细胞内ATP作用于同一位点。SarcKATP通 道虽广泛存在于各种组织中，但其分子结构表达具有组织特异性。如Kir6.2/SUR1形成胰 腺细胞的sarcKATP通道，Kir6.2/SUR2A是心肌的sarcKATP通道 22， Kir6.1/SUR2A和Kir6.2/SUR2B形成血管平滑肌的sarcKATP通道 26,27。 4.KATP 通道在心肌的分布 心肌细胞中也存在两种不同的 KATP 通道,即 sarcKATP 通 道与 mitoKATP 通道,sarcKATP 通道分子结构已被成功地克隆，据报道 SUR2A 和 Kir6.2mRNA 在 Cos1 细胞的重组 KATP 通道中的联合表达，具有与天然的心肌细胞 KATP 通道相同的特性 28，Kir6.x/SUR1 敲除鼠的实验中发现, 预处理的保护作用不需要 该种类型的 KATP 通道 29, 并且在鼠心脏中，Kir6.1 和 Kir6.2mRNA 都大量表达 30所 以，心肌 KATP 通道可能是由 Kir6.x 与 SUR2A 组成。 mitoKATP 通道在一些细胞和脂 双分子层的中虽具有特殊的药理学特性，但至今分子结构还不清楚， Liu 等通过转染 HEK293 细胞技术，并比较不同的 KATP 通道亚单位组成结构与天然的心肌 mitoKATP 通道的药理学特性，惊奇地发现：mitoKAtP 通道与 Kir6.1/SUR1 组成的 KATP 通道的 药理学特性非常类似 31，尽管这不足以证明 mitoKATP 通道的结构就是由 Kir6.1/SUR1 组成，且最近一些研究对该通道的存在提出了一些争议 32，33 ，但还是为我们进一步探索 mitoKATP 通道的具体分子结构提供了有用的线索。 5.SarcKATP 通道在 IPC 中的作用 继 Noma 发现心肌中存在 KATP 通道以来，Cole 等首次证实一种非选择性的 KATP 通道阻滞剂格列苯脲通过阻止 APD 的缩短，而废除了 再灌注期心室功能的恢复，KATP 通道开放剂吡那地尔通过缩短 APD 而加强了再灌注期 心室功能的恢复 34。此外，Tan 等证实 IPC 或 KATP 通道开放剂都能缩短 APD 的时程 35。Yao 和 Gross 发现 IPC 能导致狗心脏 APD 的缩短，并能被格列苯脲阻滞 36， KATP 通道开放剂 bimakalim 通过缩短 APD 而降低了 IPC 的阈值 15。Schulz 等也发现 IPC 使猪心 APD 缩短，并减少了猪心的梗死面积 37，最近，他又证实二氮嗪对 Kir6.2 敲 除鼠心的收缩功能的恢复没有保护作用，而对 WT 鼠心产生了保护作用，并伴有 APD 的 缩短 38，这种保护作用能被 HMR-1098(一种特有 sarcKATP 通道阻滞剂)而不能被 5- HD 阻断。以上这些实验都有力支持 sarcKATP 通道在鼠的 IPC 中起了极其重要的作用。 sarcKATP 通道的阻滞废除了 IPC 对兔离体心肌的保护 39，说明 sarcKATP 通道在多种 动物中同样有保护作用。但对此理论仍然存在一些争议。正如 Schulz 等提出：sarcKATP 通道的作用可能由于鼠科这样高心率动物的原因而被夸大 38。Rajashree 等也证实 IPC 对 Kir6.2 亚单位突变株的转基因鼠没有保护作用 40，但他使用的是心脏离体灌注模型， 并以缺血后心脏收缩功能的恢复而不是以梗死面积作为恒定指标。因为在离体心脏模型中， 心肌顿抑程度和梗死面积之间没有可靠的线性关系 41，所以有可能遗漏了 IPC 对这种转 基因鼠心肌梗死面积的保护。 SarcKATP 通道是通过什么信号传导通路又是如何保护心肌的还不清楚。Liu 42等在 离体兔心室肌模型中发现，腺苷和 PKC 的激活增加了 KATP 通道的电流，该作用能被非 选择性的腺苷受体拮抗剂 8-SPT 废除。短暂的缺血刺激可导致腺苷浓度增加，并激活腺 苷 A1 和 A2 受体 43，所以认为，腺苷增加并激活腺苷受体而触发了 sarcKATP 通道的 开放，或是腺苷受体激活和 PKC 磷酸化协同作用使 sarcKATP 通道开放。PKC 被认为是 IPC 中最主要的信号介质。最近 Light44等证实了 PKC 和 sarcKATP 通道在功能上的耦 合，PKC 激活或迁移可能是 sarcKATP 通道的上游事件。 SarcKATP 通道心肌保护可能存在另一个机制，即经特有的通道诱导的细胞内信号传 导机制。SarcKATP 通道被激活后产生细胞膜的超极化，继而激活了 mitoKATP 通道。 Waring45等发现鼠海马区细胞膜超极化后，可使磷脂酶 D 的活性增加；磷脂酶 D 与 IPC 有密切的关系 46；磷脂酶 D 产生甘油二脂使 PKC 激活或转位，从而又开放了 sarcKATP 或 mitoKATP 通道。 6.mitoKATP 通道在 IPC 中的作用 最初认为是 sarcKATP 通道的开放，导致 K+内 流入细胞，使 APD 缩短，钙内流减少，从而抑制细胞内钙超载，参与了 IPC 的心肌保护 机制。1994 年， Yao 和 Gross 首次提出 sarcKATP 通道的激活导致 APD 缩短不是 KATP 通道开放产生心肌保护的机制 15。Garlid 17在用 croakalim 和二氮嗪激活 KATP 通道一半的剂量就激活了 mitoKATP 通道，心肌 mitoKATP 通道对二氮嗪的敏感性是 sarcKATP 通道的 2000 倍左右 47， 直接提出了 mitoKATP 通道可能参与了 IPC 的保护机制。Sasaki 等用一种新药物 MCC- 134（能开放 sarcKATP 而阻滞 mitoKATP 通道）阻止了 IPC 对兔和鼠心肌的保护作用 48，所有这些都提示 mitoKATP 通道或线粒体上的作用位点在 IPC 和二氮嗪预处理中起 了主要作用。而 mitoKATP 通道阻滞剂能阻断这种保护作用 49，提示 mitoKATP 通道参 与了 IPC 的保护作用。最近，有实验发现 IP 使线粒体摄入 K+增加，直接证明了 IP 中确 实有 mitoKATP 通道的激活 23。在 IP 中，mitoKATP 通道或线粒体上的作用位点通过 何种机制参了心肌保护还不是非常清楚。有人认为可能是通过激酶激活途径和该通道的磷 酸化作用参与了 IP12，50 ,mitoKATP 通道的活性在 IP 中有规律性的变化，对该通道的氧 化可增加其活性 51，在 IP 期间，适量 ROS 的产生通过氧化作用而直接激活了 mitoKATP 通道 51，参与了 IPC 的保护作用。而 ROS 的产生也可能是 mitoKATP 通道 激活的下游事件 52，53 ，54 ，所以推测 mitoKATP 通道在 IPC 的心肌保护中起着启动物质 和终末效应器的双重任务。 mitoKATP 通道的激活本身就促进了对心肌缺血的保护，包括阻止过度的线粒体基质的 收缩 55，56 ，提高线粒体在再灌注期的氧化磷酸化效能 55，减少缺血期高能磷酸化合物的 丢失 57，阻止线粒体缺血期钙超载 57，58 。 7.sarcKATP 通道与 mitoKATP 通道的联系 在 IPC 中, 是 sarcKATP 通道还是 mitoKATP 通道起着更为重要的作用,一直存在争议 8。sarcKATP 和 mitoKATP 通道均 参与了 IPC 对狗心肌梗死面积的保护 59，阿片肽诱导的心肌所产生的延迟保护作用中, SarcKATP 通道可能起了触发器或终末效应器的作用，推测是阿片肽与线粒体相互作用， 调节 SarcKATP 通道对氧化还原和代谢的敏感性，从而启动了延迟保护的机制 60。 Bernado NL 发现：4 次反复的缺血 5 分钟再灌注 10 分钟，可明显减轻 24 小时后的兔缺 血再灌注心肌梗死面积，该保护作用均能被格列苯脲和 5-HD 所阻断，说明 sarcKATP 与 mitoKATP 通道均参与了 IPC 的延迟保护作用 61。所以推测 sarcKATP 与 mitoKATP 通道在心肌保护中起着一个互动的作用。 8.KATP 通道的线粒体保护机制 8.1 线粒体内钙超载 研究表明导致细胞不可逆损伤的根本原因是线粒体 Ca2+超载。 Miyamae 等观察大鼠离体心脏在缺血再灌注条件下线粒体与胞浆 Ca2+浓度的变化后指出： 心肌细胞的坏死或复苏与线粒体 Ca2+浓度密切相关，而与胞浆 Ca2+浓度无关 62。 Miyata 等对分离的单个心肌细胞在缺氧复氧条件下进行研究，也得出相同的结论。线粒体 高浓度的 Ca2+导致 MPT 发生，线粒体渗透性转换孔永久性开放，它允许分子量高达 5000D 的物质出入线粒体，使线粒体内容物丧失，膜电位永久消失，水分子大量进入线粒 体内，导致线粒体肿胀甚至崩解 63。一旦线粒体 Ca2+积聚超过其所能承受的限度，线粒 体渗透性转换（MPT）发生，细胞死亡已属必然，可见线粒体 Ca2+严重超载是细胞不可 逆损伤的根本原因 64。Murata 等试验表明缺血和钾通道开放剂预处理能抑制兔离体心肌 线粒体钙超载，并推测预处理心肌保护机理与限制再灌注钙超载有关 58。mitoKATP 通 道的开放通过调节线粒体内钙超载而发挥了有益的作用。当 mitoKATP 通道短暂开放时， 导致 K+净摄入增加从而耗散线粒体内膜电位，使电子传递解耦联，降低 Ca2+在线粒体 内的积聚，最终阻止线粒体内 Ca2+超载 65。 8.2 线粒体 ROS 的产生 氧自由基是缺血或缺氧线粒体损害的另一主要原因。线粒体含 有丰富的磷脂，尤其是心磷脂(cardiolipin,CL)，它作为线粒体内膜的主要成分，为细胞色 素氧化酶及其它某些线粒体蛋白发挥功能所必需。心磷脂具有高度不饱和性，对氧化应激 敏感性高，它的过氧化可能导致线粒体细胞色素 c 氧化酶、 F0F1-ATPase 的活性降低。 同时氧自由基可激活 PLA2，降解膜脂质，使线粒体结构受损。蛋白质氧化可由氧自由基 直接引起或脂质过氧化间接引发，线粒体呼吸复合体以及腺苷酸转运酶(adenine nucleotide translocase，ANT)等所含的某些重要琉基受到氧自由基的攻击形成二硫键， 使这些酶蛋白活力降低甚至丧失。大量试验证明心肌缺血后再灌注早期活性氧的爆发性产 生是造成再灌注损伤的主要原因 66-68。氧自由基不再被认为只是一种缺血再灌注心肌的 损害物质，其作为重要的细胞内第二信使，参与 IPC 的心肌保护作用越来越受到重视。生 理情况下,线粒体也在持续地产生小量的 ROS,缺血/缺氧后 ROS 的产生会增加 66，线粒体 呼吸链复合体 I 和 III 是 ROS 产生的主要位点，尤其是 III 位点，因为此位点产生的 ROS 远离抗氧化剂系统的清除 4。再灌注产生的大量的 ROS 会导致组织的损伤 69。但在 IP 中， 线粒体产生小剂量的短暂的 ROS 却能阻止随后更长时间缺血再灌注带来的 ROS 急剧增加 的后果 68。低浓度的氧自由基能够使兔离体心肌模拟出 IPC 的保护作用，使心肌梗死面 积减少，良好恢复缺血后左心室的功能 70。ROS 通过活性氧诱导的活性氧释放（RIRR ） 进一步放大对 PKC 为中心的信号系统的激活，保持 PKC 持续转位，激活最终的效应器线 粒体钾通道，可能存在 ROS 和 mitoKATP 通道之间正反馈机制。 8.3 线粒体电子传递链的阻滞 已有实验证实二氮嗪能有效地抑制线粒体中琥珀酸氧化酶 活性 71，Hanley 72等发现二氮嗪能剂量依赖性地抑制猪心线粒体中琥珀酸的氧化，但却 没有改变 NADH 的氧化还原反应，而吡那地尔阻滞了 NADH 链的氧化对琥珀酸链没有影 响。并且发现大鼠心脏缺血预处理期间，线粒体 NADH 链呼吸功能受阻，ROS 产生增多， 同时 mitoKATP 通道被激活 23，从而产生了心肌保护作用。 8.4 线粒体膜电位的变化 通常情况下，线粒体外基质中 K+浓度为 110mM,线粒体膜电 位约等于-180mv，理论上钾通道开放能导致线粒体 K+的内流和线粒体膜电位的去极化。 但 mitoKATP 通道的开放与线粒体膜电位去极化之间是否有关一直存在争议 73。在胰腺 细胞中，格列苯脲不能阻滞二氮嗪对线粒体内膜去极化作用，至少说明在这种类型的细 胞中，二氮嗪的膜去极化作用与 KATP 通道的开放无关 73；尼卡地尔对肝线粒体膜电位 没有影响，而一种新的 KATP 通道开放剂 RP-66471 却能使线粒体膜发生去极化。支持 KATP 通道开放能影响线粒体膜电位的实验认为：钾通道开放剂对线粒体膜电位的影响程 度取决于钾离子的电化学梯度；5-HD 本身对线粒体膜电位没有影响 ,却能够阻止钾通道开 放剂的线粒体膜电位的去极化作用 74。线粒体膜电位下降将耗散合成 AT