COS7细胞冻存和复苏传代培养ppt课件

COS7细胞冻存和复苏传代培养细胞冻存和复苏传代培养 1 研究目的研究目的 l 建立 CoS-7细胞培养的方法 l 观察 COS 7细胞培养的特点 l 了解 COS 7细胞的用途 2 建立建立 CoS-7细胞培养的方法细胞培养的方法 主要阐述 CoS-7细胞培养的体系 3 观察观察 COS 7细胞培养的特点细胞培养的特点 是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过 程中形态的变化，分裂生长的形式等 4 了解了解 COS 7细胞的用途细胞的用途 COS-7细胞的来源、特性及生命医学用途 ： 5 小结小结 6 COS7细胞细胞 (猴细胞的一种细胞系猴细胞的一种细胞系 )为重组病毒为重组病毒 的宿主细胞，是表达的宿主细胞，是表达 SV40大大 T抗原的非洲绿抗原的非洲绿 猴肾细胞株，能支持部分突变型猴肾细胞株，能支持部分突变型 SV40和含和含 SV40 ori的质粒载体的复制的质粒载体的复制 ,可高水平表达可高水平表达 外源基因，常作为瞬时表达宿主。故本实验外源基因，常作为瞬时表达宿主。故本实验 建立建立 COS7细胞的冻存和复苏传代方法。细胞的冻存和复苏传代方法。 7 l （一）实验材料 l 1 细胞株 cos7细胞株 l 2 试剂 l RPMI-1640培养基 小牛血清（ NBS） N- (2-羟乙基 )-哌嗪 -Ng-2（丙磺顺酸）（ Hepes， Sigma公司产品）胰蛋白酶 碳酸 氢钠以及链霉素和青霉素 l 3 实验准备 8 1 培养液的配置培养液的配置 1 (1) RPMI-1640液：液： 1640粉粉 2袋袋 Hepes 2.14g碳酸氢钠碳酸氢钠 4.0g加水至加水至 2000ml调至调至 PH=7.15，过滤。，过滤。 1 (2) 1640完全培养液：完全培养液： 10小牛血清小牛血清 双抗（含链霉素、青霉素）的双抗（含链霉素、青霉素）的 1640培养液培养液 ， 4 保存。保存。 1 (3) 10%DMSO冻存液的配置：冻存液的配置： 1份份 DMSO3 份小牛血清份小牛血清 6份完全培养基份完全培养基 1 (4) 胰蛋白酶胰蛋白酶 1.25gEDTA（乙二胺四乙（乙二胺四乙 酸二钠）酸二钠） 0.10g于烧杯中先用少许于烧杯中先用少许 PBS调成调成 糊状，再补充糊状，再补充 PBS至至 500ml，搅拌混匀，搅拌混匀 4小时小时 后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。 9 2 Cos7细胞冻存方法细胞冻存方法 2 （ 1） 取对数生长期的细胞，收集细胞前换液取对数生长期的细胞，收集细胞前换液 一次。一次。 2 （ 2） Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成 细胞悬液，细胞悬液， 1200转转 /分离心分离心 1分钟，去上清。弹指分钟，去上清。弹指 法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴 加入与细胞悬液等量的加入与细胞悬液等量的 DMSO冻存液。冻存液。 2 （ 3） 分装：细胞悬液分装在分装：细胞悬液分装在 2 ml 冷冻管中，冷冻管中， 密封后标记细胞名称和冷冻日期。密封后标记细胞名称和冷冻日期。 2 （ 4） 梯度降温冻存：冷冻管置梯度降温冻存：冷冻管置 -20 、停留、停留 1 2小时，再降至小时，再降至 70 过夜，投入液氮。过夜，投入液氮。 10 3 Cos7细胞复苏细胞复苏 3 （ 1） 将加有小牛血清双抗的将加有小牛血清双抗的 1640完全培完全培 养液从冰箱取出，升至室温。养液从冰箱取出，升至室温。 3 （ 2） 从液氮中取出冻存管，迅速投入从液氮中取出冻存管，迅速投入 3738 水浴中，摇晃使其在水浴中，摇晃使其在 1分钟左右融化。分钟左右融化。 3 （ 3） 转至转至 EP管，加管，加 1640完全培养液至完全培养液至 1.5 ml左右，吹打，左右，吹打， 1200转转 /min，离心，离心 3分钟。分钟。 3 （ 4） 去上清，再加去上清，再加 1640完全培养液至完全培养液至 1.5 ml左右漂洗，离心左右漂洗，离心 3分钟。去上清，加新鲜培分钟。去上清，加新鲜培 养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液 至总体积约至总体积约 4ml.，置温箱培养。，置温箱培养。 11 4 Cos7细胞传代细胞传代 4 （ 1） 弃掉培养瓶内原来的培养液，加入弃掉培养瓶内原来的培养液，加入 5 7滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶 底，吸出胰蛋白酶。底，吸出胰蛋白酶。 4 （ 2） 再加入再加入 8 10滴滴 0.25%胰蛋白酶，将培胰蛋白酶，将培 养瓶置养瓶置 37 、 5 CO2孵箱孵箱 2 3min，观察细胞胞，观察细胞胞 体回缩变圆体回缩变圆 ,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。细胞接近脱离瓶壁时终止消化。 4 （ 3） 小心吸出并弃去胰酶，加入小心吸出并弃去胰酶，加入 1 2ml1640完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细 胞悬液，胞悬液， 14 传代。各瓶加入培养液传代。各瓶加入培养液 2ml，放入，放入 37 、 5 CO2培养箱继续培养。培养箱继续培养。 12 二二 结果结果 l 1 复苏细胞：第 1d,镜下观察复苏细 胞悬浮于培养液中 ,折光性强 ,胞体呈圆 形。第 2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分 贴壁。第 3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖 速度较快，折光性好。 5d后可按比例传 代。 13 l 2 传代细胞：第 1d,镜下观察传代细胞悬 浮于培养液中 ,折光性强 ,胞体呈圆形。 第 2d,中 ,传代细胞镜下观察细胞已贴壁 , 折光性好 ,少数细胞出现伪足。第 3d,传 代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸 出伪足 ,细胞轮廓清楚 ,折光性强 ,细胞数 量明显增多。 14 l 3 传代细胞传至第 6 8代仍保持增殖 状态，细胞生长速度未见减慢 ,能长满瓶 底。 15 三三 讨论讨论 l 1 养细胞维持传代以供实验用常遇到某 些困难。首先，细胞株在传代中其性质 发生变化。其次，在传代中有微生物污 染的危险。解决这些困难的办法就是将 细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时 间几乎是无限的（因为在 -130 以下， 所有的生化反应已停止，而液氮的温度 在 -150 -160 之间） 16 l 2 培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培 养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度 过大，导致营养不良而引起细胞衰老 停止生长 甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须 进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离 稀 释 接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代 的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环 境，以利于细胞的生存和增殖，通常原代细胞 按 1： 2分种传代，细胞株按 1： 4分种传代 17 l 3 实验需严格遵守无菌操作规则，以减 少操作引起的污染。一切操作，都要在 火焰周围进行，瓶口、吸管等要经过火 焰消毒。但用于吸取细胞培养液、小牛 血清、酶液的吸管使用后不能在火焰上 消毒，因为残留在吸管中的培养液烧焦 炭化，再使用时会把有害炭化物带入培 养液中毒害细胞。 18 l 4 实验完毕，关闭超净台鼓风机和电源 ，未使用器材放入饭盒内，用过的玻璃 器材投入清水中浸泡，用酒精棉球擦拭 工作台面。可减少培养液被微生物污染 。 19 l 5 细胞冻存复苏的基本原则是慢冻速融 ,可最大限度 的保存细胞活力。细胞直接冻存时 ,细胞内外的水分 会很快形成冰晶 ,引起一系列不良反应。因而在冻存 时尽可能地减少细胞内水分及冰晶形成 ,是保护细胞 减少损伤的关键。目前多采用甘油和二甲基亚砜（ DMSO）作保护剂 ,它们对细胞无明显毒性 ,分子量小 , 溶解度大 ,易穿透细胞 ,可以使冰点下降。通过缓慢冷 冻 ,使细胞内水分尽可能多的渗出细胞外 ,减少细胞内 冰晶形成。而复苏细胞时 ,采用快速融化 ,可保证细胞 外结晶在很短时间内融化 ,避免缓慢融化使水分渗入 细胞内形成细胞内再结晶。在本实验中 ,我们用二甲 基亚砜作保护剂 ,经过两个低温梯度、过夜后移入液 氮 ;融化复苏时在 37 、 2分钟内完成 ,对细胞未造成 明显损伤 ,复苏后细胞存活率可达 90%,细胞形态、生 长速率与未冻存细胞相比 ,未见明显差异 20 l 6 cos7细胞生长分为 3期：延缓期、增殖期和 停滞期 .首次传代一般在 Cos7细胞增殖早期 ,此 时细胞刚刚度过延缓期 ,脆弱易损 ,首次传代对 于 Cos7细胞是否能长期存活尤为重要 .而在 Cos7细胞增殖后期 ,细胞贴壁紧密 ,消化时间不 足 ,细胞不易从瓶壁脱落 ,不仅传代细胞数量少 ,影响实验的准确性 ,而且由于局部代谢物的积 累 ,细胞即进入停滞期 ,若消化时间过长 ,待细 胞完全从瓶壁脱落 ,则细胞膜已受损 ,死细胞增 多 .胰蛋白酶是常用的消化液 ,可使细胞脱离附 着物表面和相互离散成单个细胞 ,但胰蛋白酶 对细胞也有损伤可影响细胞活性 5.本文建议 采用 0.25%胰蛋白酶在 37, 消化 2min的参数。 这是因为在 37 下胰蛋白酶活性最大 ,所需消 化时间最短 ,可避免胰蛋白酶长时间作用于细 胞造成细胞的损失。 21 l 7 本室探讨了 37 、 CO2条件为培养 Cos7细胞的适宜环境。因为刚复苏细胞 增殖缓慢 ,自身调节 pH的能力差的缘故， 显示复苏细胞要在 37 、 5 CO2条件下 培养才能顺利传代并保持较好的生长状 态 22 l 参考文献 l 1 Gluzman Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell,1981,23:175 182. l 2 Sambrook J, Fristch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed.Cold Spring Harbo