艾滋病检测技术新进展ppt课件

艾滋病检测技术新进展及其应用 1 内容提要 l1.HIV急性期感染或窗口期感染检测（ Ab/Ag 联合检测和集合 PCR） l2.婴幼儿早期诊断 （ nest RT-PCR） l3.快速检测策略及质控 2 1、 HIV-1持续流行： 全球 HIV流行和 AIDS仍继续增加，尤其是 MSM同性恋人群， 多达 50% HIV 传播发生在疾病急性和早期， （流行病学意义） 2、高病毒 RNA水平： 性传播感染仍具首位，生殖道 HIV RNA 水平相当于血液 中 HIV RNA水平。高病毒载量、独特的病毒特性以及缺乏中和 抗体，急性期感染者感染性极高。 VL10 M copies/mm3 3、极易垂直传播： 怀孕妇女感染 HIV非常常见，增加 HIV垂直传播的危险。 2011 年 4月全国报告的 HIV感染者（ 5560例）中，母婴传播占 1.3%； AIDS病人（ 2806例 ）中，母婴传播占 1.0%。 公共卫生意义： HIV-1 流行形势严峻为什么 HIV急性感染（ AHI）越来越受到重视？ 3 4、应尽早尽快进行诊断： HIV感染急性期，感染者无症状和流感样症状而经常漏检而误诊 ，感染者本人不知自己感染状态，极易在高危人群中传播 5、应尽早进行人群干预： 实时对感染者及其配偶、孕妇感染者及其婴儿进行干预，知晓感 染状态，减少危险性行为；了解和干预复杂的性传播网 6、应尽早进行病毒干预： 在 AHI时期进行可能的干预以限制 HIV复制和整合入病毒潜伏池、 （整合后不可治愈），早期抗病毒治疗的必要性 (转变观念 ) 7、指导疫苗研究： 基于急性期感染时期的传播性 /奠基者病毒的特性 8、建立人类自然模型： 研究 AHI个体，为详细了解人类 HIV传播事件提供最好的机会 公共卫生意义：早诊断、早干预、早治疗、降两率、指导疫苗研究为什么 HIV急性感染（ AHI）越来越受到重视？ 4 方法：前瞻性随访高危人群队列发现阳转感染者（ MSM,IDU, SW,单阳伴侣） 限制： 1）前瞻性随访 HIV阴性人群的巨额花费； 2）在阳转时刻或接近阳转时难以找到研究对象，难以采集到急性期血 清阴性病毒血症期峰值的样本； （美国国防部联手 NIH 已经启动疫苗免疫性队列研究 RV217， 每周二次检测 HIV RNA，试图发现 AHI；我国十一五重大专项也启动了急性期感染的研究） 前瞻性队列研究：高危人群 横断面研究：普通人群 血液中心通常使用集合（ 6-96份血浆） NAT筛查，阳性集合拆分并检测出个体 感染者，使用病毒特异性 “区别 ”NAT检测确认，阳性者纳入转诊和报告系统 美国北卡卫生部门制定和实施了全州所有公共 HIV检测点筛查 AHI规划，对所有 抗体阴性样本进行集合 NAT RNA检测。及时转诊、咨询、治疗和前瞻性研究 如何发现 HIV急性感染 AHI？ 5 RNA+ Ab- P24+ Ab - 血清阳转后的方法 RNA p24 Ab 血清阳转 抗体检测临界值 特异性抗体比例 时间 反应指标 感染 血清阳转前的方法 怎样检测 HIV-1早期感染 ? 6 l从感染 HIV到抗体呈阳性反应 l这段时间血浆中含有高浓度 HIV RNA l有很高的传染性 l现在普遍认为 2周 3个月 ,个别案例达 6个月 。 HIV血清阳转窗口期 7 HIV感染各种检测方法的窗口期 HIVAb检测（第三代试剂）：窗口期约 28天 HIVAb/Ag联合检测（第四代试剂）：窗口期 约 15天 核酸检测： 窗口期约 10天 8 病毒载量值范围为 3.846.84Log10Copies/mL； 28例窗口期病例， 病毒载量百万级有 10份 （ 35.71%） ； 十万级 9份 （ 32.14%） ；万级的样品 7份 （ 25%）； 万级 以下的样品 2份，占总样品数的 7.14%。 窗口期感染者的病毒学特征 9 W B条 带 W B不确定 R N A阳性 p24 26(65%) 7(26.9%) p24+gp160 9(22.5%) 3(33.3%) p24+p17 4(10%) 4(100%) p24+p55 1(2.5%) 1(100%) 合 计 40 15 40份 WB不确定样品 WB条带 10 HIV急性期感染或窗口期感染检测方法 l1.Ab/Ag联合检测 : ELISA l2.HIV RNA检测 : 集合 PCR 11 HIV Ab/Ag联合检测 l 检测早期 HIV感染的效果与单独 HIV-1抗原的试剂相当 l 与 RT-PCR方法相比，平均滞后时间是大约 3.23天 l 与第三代抗体试剂相比，窗口期缩短了 1.56 到 5.32天 l 检测献血员的特异性是 99.80% l 第四代试剂的敏感性和特异性均有所提高 12 HIV Ab/Ag联合检测试剂的原理 HIV Ag检测： HIV Ag 固相 血清 / 血浆 结合物 1 / 结合物 2 HIV 1 Ab : 抗 p24单抗 生物素标记的抗 HIV单抗 亲和素标记的过氧化物酶结合物 TMB / H2SO4 P HIV Ab检测 : IgG, IgA, IgM 固相 血清 / 血浆 稀释液 /结合物 2 HIV 1 Ag : gp 160 重组蛋白 gp 41 多肽 过氧化物酶结合物 功能性保守多肽 . 功能性保守多肽过氧化物酶结合物 HIV 2 Ag: gp36多肽 gp 36 多肽过氧化物酶结合物 TMB / H2SO4 P 13 HIV Ab/Ag特点 HIV-Ab与 HIV-Ag双检测系统 HIV-Ag和 HIV P24抗体共同包被 HRP标记 HIV-Ag和 HRP标记亲和素共同组成酶标试 剂 双抗原夹心法测 HIV-Ab 包被抗原 +HRP标记抗原 双抗体夹心 LAB法测 HIV-Ag 包被抗体生物素标记抗体 HRP标记亲和素 生物素 -亲和素反应系统应用 14 HIV-Ag/Ab试剂对试剂对 BBI panel检测结果检测结果 24种国外抗体试剂窗口期与万泰试剂一致，均 27天。 ABBOTT（ 2种）、万泰和伯乐抗原试剂窗口期均为 7天，灵敏度一 致。 15 集合 HIV RNA RT-PCR样本的路线 16 集合的拆分检测路线 17 一 级 pool 二 级 pool 单 份 样 品 WB检测结 果 地点 编 号 病 载 编 号 病 载 编 号 病 载 （ C/ml） ZC1-5 1.68E+3 ZC1 LOW LOW ZC2 LOW LOW ZC3 LOW LOW ZC4 4.43E+3 23036 1.80E+5 阴性 豫 -柘城 ZC5 LOW LOW ZC11-15 3.92E+2 ZC11 LOW LOW ZC12 LOW LOW ZC13 LOW LOW ZC14 1.37E+3 23135 1.05E+4 阴性 豫 -柘城 17234 6.34E+3 阴性 晋 -绛县 ZC15 LOW LOW TF1-5 1.36E+3 TF1 LOW LOW TF2 4.06E+3 17218 5.39E+3 阴性 晋 -绛县 TF3 LOW LOW TF4 LOW LOW TF5 LOW LOW TFD 7.26E+4 TFD1 3.32E+5 05019 3.21E+6 阴性 晋 -临 汾 TFD2 LOW LOW TFD3 LOW LOW TFD4 LOW LOW TFD5 LOW LOW Low：低于检测限 HIV窗口期感染样品各级 POOL检测结果 18 50份标本混合 阳性 每 10份标本再检测 阳性 每一份标本再检测 集合 HIV核酸检测用于血液筛查 集合 HIV RNA 检测方法用于在 HIV抗体阴性的 血清（血浆）样本中筛查处于急性感染期 HIV RNA阳性的样本。 19 注 * RT1和 RT2检测均为阴性的样品为按阴性咨询同时，为进一步排除假阴性的样品将保留血浆，集中进 行 ELISA复检， ELISA复检为阳性的样品进一步做 WB确认，同时进行随访。 咨询后，需要检测者采集抗凝血 先用 RT1再用 RT2进行检测 按阴性咨询 报告阴性 任何一种试剂检测为阳性两次检测均为阴性 集中进行 ELISA检测 * 集中进行 ELISA、 WB检测 求询者 HIV抗体阴性及 WB不确定样本 WB确认 HIV抗体阳性样品 做 Pooled HIV RNA RT-PCR检测 做 BED-CEIA检测 窗口期检测程序 20 应用集合 PCR技术发现窗口期感 染者 lMSM VCT IDU l 筛查 - 筛查 + l 集合 PCR WB l + l结合流行病史，判断窗口期感染 21 MSM人群早期感染建议检测流程 * 男男性行为人群 HIV-1早期感染检 测策略及新发感染率研究 22 婴幼儿 HIV感染的诊断 lHIV感染产妇生婴幼儿在出生后 18个月内可 应用 HIV核酸检测进行早期 HIV感染诊断。 l逆转录 PCR（ RT-PCR）方法，一般需扩增 HIV gag 和 pol 和 env 基因片段。 l如果儿童第一次采血时已满 12个月，则应首 先进行 HIV抗体检测。对于抗体阳性者进行 HIV核酸检测。如果已满 18个月，不做核酸 检测。 23 感染婴儿平 均 S/CO值随 月龄变化曲 线（ 24个感 染婴儿 (3个 死亡 )， 82个 样本） n: 样本数 婴幼儿感染诊断： 12月内核酸检测， 13-17月先抗体，阳性 者检测核酸， 18个月以上抗体检测 24 25 核酸检测 流程 26 27 快速检测，是艾滋病实验室多了一种检测 方法。 快速检测，是为了更多、更快的的发现感 染者。 快速检测，不是为了取代实验室，但不能 因为有了实验室而放弃使用快速检测。 快速检测 28 “五扩大七加强 ” l 扩大宣传教育覆盖面 l 扩大监测检测覆盖面 l 扩大预防母婴传播覆盖 面 l 扩大综合干预覆盖面 l 扩大抗病毒治疗覆盖面 l 加强血液管理 l 加强医疗保障 l 加强关怀救助 l 加强权益保护 l 加强组织领导 l 加强防治队伍建设 l 加强国际合作 国务院 国发 【 2010】 48号： 29 扩大监测检测覆盖面 要进一步加强监测检测网络建设，依 托现有医疗卫生资源，配备必要的设备 和人员，扩大检测服务范围，推广使用 快速简便的检测方法，提高检测可及性 。组织各级各类医疗卫生机构主动开展 艾滋病病毒检测咨询。 30 建立快速检测点，扩大检测覆盖率 我国地域辽阔，在一些有检测需求但 尚不具备条件建立实验室的医疗机构、农 村乡（镇）卫生院、社区卫生服务中心和 艾滋病自愿咨询检测点（ VCT）需要建立 快速检测点，以扩大检测覆盖面、发现更 多的艾滋病病毒感染者。 31 年 HIV 报 告即AIDS 新 发现合 计 晚 发现 % 2007 37419 10719 48138 22.3 2008 45572 10790 56362 19.1 2009 48193 13433 61626 21.8 2010 48249 16089 64338 25.0 疫情的新特征（病人发现晚）要求开展 快检以尽早尽快发现 32 增加检测可及性是中国控制艾滋 病的关键 1.知晓 HIV感染状况能够得到有效的阳性的 干预。 2.通过行为改变可以减少 2/3的 HIV经性传播 。 3.及时的抗病毒治疗可以减少病毒载量从而 减少二代传播 “ 治疗作为预防 ” 90%以上的效能。 4.如果有 60%的 HIV+知晓自己的感染状态并 获得相应服务 HIV 疫情达到控制。 5.为什么目前 HIV+发现率不高 6+快速检测阳性，一致性 100%，中 国艾滋病性病， 2008年第 3期） l该比较的局限性：两种快速试剂均为进口 试剂，没有对阴性样本进行对比。 l部分国产快速检测试剂质量需进一步提高 39 2008年至 2011年 4月 确 证实 验 室 快速 检 测 阳性 数 ELISA结 果 WB结 果 备 注 阳性数 阴性数 阳性数 阴性数 不确定 数 省 临检 中心 117 110 7 91 8 11 遵 义 市 CDC 170 168 2 152 4 12 小 计 287 278 9 243 12 23 阳性符 合性 快速与 ELISA 96.9% 快速与 WB:84.6% ELISA与 WB:87.4% 贵州： 快速检测试剂与 ELISA WB符合性 40 示范区 检测人数 快速阳性数 ELISA阳性数 确证阳性数 确证阴性数 确证不确定 南明区 55407 32 32 32 0 0 红花岗区 16994 8 8 7 0 1 铜仁市 21729 63 54 54 9 0 盘县 32573 10 10 9 0 1 织金县 24399 38 26 26 12 0 小计 151102 151 130 128 21 2 阳性符 合率 快速与ELISA:86% 快速与 WB 84.8% ELISA与 WB 98.5% 贵州：母婴阻断示范区项目快检结果分析 41 艾滋病病毒抗体快速检测技术手册 (2011年版） l 1、人员要求 l 2、检测点的设置 3、要求与管理 l 3、试剂选择 l 4、样本采集及注意事项 l 5、检测策略及流程 l 6、实验记录 l 7、结果报告与告知 l 8、检测质量控制 l 9、生物安全及个人防护。 42 人员要求 从事 HIV快速检测的人员需有相关的检验 或医学知识，经过县级以上相关专业技术 部门培训，取得合格证书。 未经正规培训或培训后考核未合格的人员 ,不得进行快速检测工作。 对从事快速检测的人员 ,应根据需要进行 再培训。 43 检测点的设置 l各省可根据艾滋病流行情况和防治工作整 体需求，统筹考虑检测点设置，有效开展 快速检测。 l根据当地艾滋病流行情况和实际需求，可 在有检测需求、但不具备建立实验室条件 的地方设置检测点。 l检测点可由当地艾滋病确证实验室或筛查 实验室负责培训、验收，卫生行政部门负 责审批，在当地卫生行政部门与省艾滋病 确证中心实验室备案。 44 检测点的要求 l快速检测所在房间温度可控，保证室内达 到试剂要求的温度，有检测台面，光线充 足，可以消毒。 l需配备快速检测所需物品，至少包括：普 通冰箱、消毒与污物处理设备、一次性消 耗品、安全防护用品和资料柜。 l严格按照快速试剂说明书要求检测，保存 原始记录及 l必须参加省（地市级）组织的快速检测能 力验证。 45 检测点的管理 l省艾滋病确证中心实验室负责本省 HIV快 速检测的实施及其质量保证。统筹考虑检 测点的发展与规划，组织本省快速检测能 力验证活动。 l各市级艾滋病确证实验室指导本地检测点 的建立与管理，进行人员培训、现场督导 和质量管理。 46 快速检测试剂（ RT） l是在 ELISA基础上发展起来的一种检测技 术，它用胶体金或硒标记抗原、抗体后以 层析方法进行检测。 l突出优点为快速、试剂便于保存、检测不 需要特殊设备并可以单份检测 ，比较适 用于基层医疗单位和标本初筛。 l挑战：进一步提高检测灵敏度和特异性， 实现检测多元化，进行定量和半定量检测 胶体金纸条将会更加广泛地应用于各个领 域。 47 艾滋病快速检测试验（ RT） l快速 HIV试剂的原理 * l颗粒凝集 （ Particle Agglutination, PA) l免疫渗漏 （ Immunoconcentration, Flow through, FT) l免疫层析 （ Immunochromatograpy, lateral flow, IF) 48 快速检测： 胶体金（或胶体硒） 原理和方法 l 原理 包括 HIV-和 HIV-2抗原直接包被于硝酸纤 维素膜上的检测线，将 HIV抗体包被于质控 线，通过利用胶体金 (或胶体硒）标记 HIV-1 和 HIV-2抗原 ,采用免疫层吸双抗原夹心法原 理来检测待测样品中可能存在的 HIV抗体。 l 操作方法 操作简单，只需在加样处加上样品。 49 艾滋病快速检测试剂构造 50 艾滋病快速检测： 胶体金（或胶 体硒） 结果判读 l 结果判读 反应区和质控区均出现红色条带为阳性。 质控区有条带，反应区无条带为阴性。 反应区和质控区均无条带则实验无效。 51 艾滋病快速检测的优点 1.操作更快 2.不需要成批实验 3.不需要使用特殊仪器 4.检测的当时就给出结果 5.只能采用经过 SFDA批准的快速 HIV 抗体检测，以确保质量 52 快速检测试剂使用要求 l必须使用经国家食品药品监督管理局注册 批准的快速试剂。 l试剂必须在有效期内使用。 l根据检测目的选择试剂。初筛选择敏感性 高的试剂，复检选择特异性高的试剂。 l推荐使用临床评估质量好并且近几年连续 考评结果稳定的试剂 53 快速检测试剂主要使用以下人群 lMSM 现场干预 lVCT（自愿咨询检测） lPMTCT（母婴阻断）和婚前检查 l扩大检测 (乡镇卫生院、社区医疗卫生 服务站） lPITC（ 医疗机构主动提供检测咨询 ） 54 快速检测策略和流程 l 当检测点上有两种快速检测试剂时：常规检测 l 当检测点上有两种快速检测试剂时：应急检测 l 当检测点上只有一种快速检测试剂时 55 末梢血样本采集方法和注意事项 56 静脉血样本采集和注意事项 57 1、常规检测 样品 初筛试验 快检试剂 1 阳性反应 阴性反应 复检试验 快检试剂 1+快检试剂 2 均阳性反应 一阴一阳 均阴性反应 送确证试验室 报告阴性 HIV抗体快速检测流程图 58 两种快检试剂 同时检测样品 均阳性反应 一阴一阳 均阴性反应 送确证试验室 报告阴性 HIV抗体快速检测流程图 按疑似阳性咨询告知 按阴性咨询并告知 2、应急检测 59 样品 初筛试验 快检试剂 阳性反应 阴性反应 复检试验 将样本转送筛查实验室 均阳性反应 一阴一阳 均阴性反应 送确证实验室 报告阴性 HIV抗体快速检测流程图 3、只有一种 快速试剂时 60 实验记录 l可有数码影像资料或文字记录 l文字记录：检测序列号，人群来源，受检 者姓名，年龄，性别，检测日期，检测试 剂盒的名称，批号，有效期及检测日期， 检测结果与检测人等。 l对快速检测呈阳性反应的就诊者，要收集 个人的真实信息，登记身份证号码和联系 方式（包括移动电话）。填写 快速检测 阳性反应样品送检单 61 快检质控 l1. 样品要求唯一编号，实验前仔细核对 ，检查。 l2. 检测人员每日检查室内的温湿度，实 验环境温湿度应在试剂盒操作说明书要求 的范围内，试剂和样品应按要求存放，并 做好记录。 l3. 检查是否有足够的试剂库存 ,明确试剂 在有效期内，禁止使用过期试剂。 l4. 每批实验如果应用不同批号的试剂， 应做好记录。 62 检测过程质控 l1. 记录样品编码、姓名、试剂名称及批号、操 作者姓名等。 l2. 核对样品标号，标记，防止错号。 l3. 收集并集中摆放全部待检样品，包括外部质 控品。 l4.需要在冰箱保存的试剂，从冷藏环境中取出 后放置室温，平衡后再使用。剩余的试剂条应 立即放入自封袋中密封，按照试剂厂家提供的 说明书开始操作。 l5. 建议每一次最多做 10个样品，确保试纸条的 编号与标本编号的准确对应，防止错号和交叉 污染。 l6. 结果判定时，质控带必须出现实验才能成立 。如未呈现质控条带，本次试验结果无效，样 品须重检。 l7. 每个检测日做一次外部质控品，更换检测人 员时 ;更换不同试剂批号时，更换不同的试剂包 装时 ;更换不同的试剂厂家时均应一次外部质控 品。 63 检测后质控 l 1.实验结果进行判读时，应保证判读地点光线充足 。对于难以判读的条带，最好有 2人判读。 l 2.复核样品编号并填写试验结果。 l 3.清洁并处理实验废弃物。 l 4.向实验室负责人报告检测结果。 l 5.检查试剂库存量，根据实际需要，提前向上级实 验室申请补充。 l 6.收到试剂时，试剂的外包装盒或内容物已损伤； 标签出现错误、缺失或字迹模糊 (特别是产品厂家 名称，批号和货号，失效期或 /和生产日期 )；缺失 目录或操作说明书；试剂盒内容物出现渗漏等。提 示存在质量隐患，应详细记录。 64 部分快速检测试剂检测结果比 较（相同的样本，同一人员按说明书进行检测） 65 快速检测试验评价 试剂稳定，可室温长期保存。试验时 不需任何设备，迅速、简便、特异性较好 ，敏感性约相当于中度敏感的 ELISA， 适 用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前 已有国内产品。一般可在 1030min内判读 结果。 66 快速试剂使用中存在的问题 l快速检测只是初筛检测，存在一定的假阳 性率和假阴性率； l技术上属于主观判读，不具备标准化条件 ； l快速检测的质量控制问题目前没有有效方 法； l存在较大的批间误差，加上不属于政策规 定项目，风险较大，基层医疗卫生单位不 愿意承担责任。 l担心敏感性不够高，不敢出阴性报告； 67 几种快速检测试剂质量事故 试剂厂家 1（ 2007年 12月 29日） 事件： X确证实验室报告厂家 1（胶体金法） 批号为 V200707033对 12份 HIV-1抗体阳性 的病人样品检测有 6份呈假阴性反应。 结果：通知辖区内的网络实验室暂停使用该 厂家的 HIV快速试剂，封存现有试剂，退 回厂家 。 68 几种快速检测试剂质量事故 试剂厂家 2（ 2008年 2月 1日） 事件： X人民医院检验科报告试剂厂家 2（胶体金 法）批号为 2007071801对 1份 HIV-1抗体阳性的 病人样品检测 1份呈假阴性反应。 结果：将该样品和试剂上送中心实验室复核，结 果为该样品对该批号试剂以及另一批号试剂呈 阳性反应。 原因：试剂检测带的显色太浅造成漏判和误判。 69 几种快速检测试剂质量事故 试剂厂家 3（ 2008年 2月 23日） 事件： X市 CDC报告试剂厂家 3 （胶体金法） 批号为 W0680401C对 5份 HIV抗体确证阳性 的病人样品检测 5份呈假阴性反应。 结果：将该批样品和试剂上送中心实验室复 核，结果为该样品对该批号试剂反应呈阳 性反应。 原因：试剂检测带的显色太浅造成漏判和误 判。 70 几种快速检测试剂质量事故 试剂厂家 4 （ 2009年 4月 10日） 事件： X确证实验室报告试剂厂家 4（金标法 ）批号为 W0690305C对 10份 HIV抗体阴性的 病人样品检测 5份呈假阳性反应。 结果：退货并更换新批号试剂。 71 快速检测注意事项 l 不提倡个人在家中检测。应由经培训的人员操作，注意 生物安全操作，避免职业暴露发生。 l 在质控窗口内出现质控带，如实验完成后未呈现红色质 控带，说明试剂盒内质控无效，该试验结果无效，样品 须重检。 l 出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输 包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在单包装内存在混杂 物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊 （特别是产品 名称或出产厂家名称，批号和货号，失效期或 /和生