HIV检测技术ppt课件

艾滋病检测技术 1 检测的重要性 n 任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性， 都会对被检者甚至对家庭和社会都产生十 分重要的影响 n 艾滋病诊断的一项重要指标，也是控制 HIV 传播和控制艾滋病流行的重要手段 2 检测的目的 n 诊断 为确定个体 HIV感染状况，包括临床检测 和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进 行的体检等。 n 监测 为了解不同人群 HIV感染率及其变化趋势 ，检测的人群包括各类高危人群和一般人群 n 血液筛查 为防止输血传播 HIV而进行的检测， 包括献血员筛查和原料血浆筛查。 n 临床治疗和预后的判断 疗效观察和耐药性监测 3 HIV感染的实验室检测 n 常用 HIV病原学检测方法 : n 病毒分离 n 抗原检测 n 核酸检测（ HIV核酸定性检测 、 HIV- RNA定量测定） n 常用 HIV抗体检测方法（均未能检测 N型） n 筛查实验方法 ELISA， 胶体金（硒）， PA 法， 斑点 EIA ， 唾液、尿液检测卡 ， 化学发光免疫分析 确认实验方法 免疫印迹法，条带免疫法， 放免法 ,间接免疫荧光试验 n 其他 CD4+/CD8+ T cell 计数等 4 病毒感染后病毒 RNA和血清标记水平 10 20 30 40 50 60 70 80 900 病毒 RNA, 抗原或抗体水平 HIV-1 RNA Ab to HIV-1 p24 Ag 5 HIV 抗 体 检 测 方 法 酶联免疫吸附法 （ ELISA） 最早出现、发展最快、至今仍普遍使用 很高的灵敏度和特异性 适合对大量样品的检测 可以进行很方便的质控工作，因此是目前临床最常用的筛查 检测方法 6 酶联免疫吸附试验（ ELISA） 目前主要使用第三代抗 HIV抗体 1/2试剂（ 即双抗原夹心法） 第四代 ELISA试剂可同时检测 P24抗原和抗 HIV-1/2抗体。与第三代抗 HIV-1/2试剂相 比，检出时间提前了 49d。 7 HIV ELISA试剂的发展过程 8 第四代 ELISA试剂 n 优点：缩短了窗口期 n 缺点：同时把抗原和抗体包被在反应板上 ，存在互相干扰的可能，检测的敏感性和 特异性可能都会受到影响。第四代试剂检 测 p24抗原的敏感度 (20 100pg/m1)，单 独检测 p24抗原试剂的敏感度 (3.5 10pg/m1)。 9 HIV感染窗口期 1st-2nd 代3rd 代 = Detection limit 2%。另外，文献报道大约 4% 20%的 样品经过 HIV初筛复检阳性后， WB结果为 “不确定 ”。 n WB不确定结果的出现确实给临床诊断带来困难，需要更 多的时间和实验进一步确认，也会对受试者造成额外的心 理负担。从另一方面而言， WB不确定结果确是受试者真 实的血清学反应。 39 HIV抗体不确定 n 对于符合 HIV抗体不确定判断标准，报告 “HIV抗体不确定 （ ） ”，在备注中应注明 “3个月后复检 ”，同时进行以下处 理： n (1) 随访复检：每 3个月随访复检 1次，连续 2次，共 6个月 。如果检测时暴露时间已超过 3个月，则在 3个月后随访 1 次即可。将前后 2份样品同时检测，仍呈不确定或阴性则 报告 HIV抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合 HIV抗体阳性判定标准则报告 HIV-1或 HIV-2抗体阳性。 n (2) 必要时可做 HIV-1 P24抗原或 HIV核酸测定，但检测结 果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结 果。 40 HIV抗体不确定 n 当出现任何 HIV病毒特异条带，但不足以被 判断为阳性则判定为不确定结果。不仅初 筛阳性的标本可以出现不确定的结果，初 筛阴性的标本经 WB检测也有大约 15%出现 针对一个或几个抗原的不确定结果。 WB不 确定结果中 p24条带最常出现（ 60%91.6%）， gp120/gp160出现的频率 其次。 WB不确定结果出现原因比较复杂， 与检测对象、检测试剂和实验操作有关， 详见下表。 41 WB不确定出现的原因 n HIV及相关感染 ：早期血清学转换 、 AIDS晚期 、早产感染 、 HIV缺失株感染 、免疫静止型 AIDS 、 HIV-2感染 、散发 HIV/SIV(猴免疫缺陷病毒 ) 。 n 其它逆转录病毒感染 ：山羊关节炎 -脑炎病毒 n 其它临床状态 ：自身免疫疾病（系统性红斑狼疮 ，原发性干燥综合征）、麻风病、恶性肿瘤、高 胆红素、高核蛋白、高类风湿因子 n 无感染 ： HIV阳性母亲所生的正常婴儿、未筛查 血液制品的接受者、疫苗试验志愿者、保持 WB 结果不变的供者 42 WB不确定出现的原因 n 检测试剂 ：宿主细胞蛋白残留、判断准则 、试剂盒的条件优化 /稳定性 n 实验操作 ：交叉污染、试验程序、仪器设 备、样本处理及溶血 43 其它确认试验 线性免疫试验： 将 HIV的重组和合成多肽抗原包被在硝酸纤维 素膜条上，用于检测样本中的 HIV-1和（或 ） HIV-2抗体。该法可降低来自细胞培养的 杂质蛋白污染而引起非特异反应，在欧洲 应用广泛，大量研究报道称它的准确性与 免疫印迹法相当。 44 其它确认试验 n 放射免疫沉淀试验： n 用同位素标记的 HIV蛋白与待检血清反应，若血 清中含有 HIV抗体即可与 HIV蛋白抗原结合，再加 入葡萄球菌蛋白 A，经低速离心，然后将沉淀复 合物分离后电泳，放射自显影观察同位素标记蛋 白带即可判定。本法灵敏度和特异度均好，但因 试剂制备复杂，成本高，且同位素操作需要严格 防护而限制其应用。 45 其它确认试验 n 间接免疫荧光试验： n 将 HIV感染的细胞作为抗原固定在玻片上，再在 其上滴加待检血清，若含有 HIV 抗体，则与细胞 膜上的病毒抗原结合，清洗后加荧光标记的抗人 IgG，洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下 观察结果，胞浆内出现特异性荧光，而对照孔没 有特异性荧光，就可诊断为 HIV抗体阳性。此法 操作简便，敏感性及特异性均较 ELISA法高，但 存在对某些血清非特异性荧光难以去除，结果判 断需要荧光显微镜，需要受过良好训练的技术人 员，对结果的观察和解释易受主观因素的影响， 结果也不宜长期保存。 46 HIV抗原的检测 n 窗口期 ： HIV 感染人体后有一段窗口期，在这段 时期病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相 关抗原或分离病毒。 HIV-1感染机体后 , 感染者血 液中最早出现的是病毒 gag基因表达产物 p24抗原 , 然后才出现相应的特异性抗 HIV抗体 , 以后随抗 体滴度的升高 p24抗原含量呈逐渐下降的趋势以 至检测不出。在病情发展到 AIDS期，病毒大量复 制，机体免疫力下降，所产生的抗体不足以中和 病毒抗原时， p24抗原在血中又可检测出。 47 HIV抗原的检测 n 阳性母亲所生育婴儿检测： HIV阳性母亲所 生育的婴儿 30%可能已受到感染，但由于 婴儿体内母源性抗 HIV抗体可持续 18个月之 久，常规检测抗 HIV抗体须要在婴儿 18个月 以后才能确定婴儿体内的 HIV抗体是来自母 体，还是自身产生，而 HIV抗原的检测则可 弥补这一不足。 48 HIV抗原的检测 n HIV-1抗体不确定 n 第四代 HIV-1抗原 /抗体 ELISA试剂检测呈阳 性反应，但 HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊 断。 n 监测 病程 进 展和抗病毒治 疗 效果 n 针对 HIV抗体产生前的血液产品进行筛查 n 对 HIV病毒暴露但血清学阴性的个人进行早 期感染的检测 49 HIV抗原的检测 n 联免疫分析（ ELISA） n 放射免疫分析（ RIA） n 免疫荧光技术（ IFA） n 免疫吸附电镜法（ Immunosorbent Electron Microscopical method， ISEM） 50 ELISA检测 P24抗原技术 n 检测 HIV感染敏感的常规方法 n 双夹心抗体法（原理同双夹心抗原法） n 假阳性高需用中和试验加以鉴别 51 ELISA检测 P24抗原改进技术 n 超敏感酶免疫测定法 (Ultrasensitive enzyme immunoassay， UEI)又称双位点免疫复合物转移 酶免疫测定，基本技术路线是利用高亲和力抗体 浓缩富集血清中的 P24抗原，然后进检测。该法 可将下限延伸至 0.2pg ml n 线性免疫酶测定 (1ineal immunoenzymatic assy ， LIA)和 Cobas Core HIVCombi EIA是新近发展 起来的第四代 HIV检测技术。目前最敏感的抗原 试剂盒的检测阀值为 0.01pg ml。 52 HIV抗原检测局限性 p24蛋白只是个临时标志，急性感染期之 后就很快降低到无法检测的水平，只有在 病人的 AIDS阶段才重新出现 HIV-1 P24 抗原的阳性结果必须经过中和 试验确认，该结果仅作为 HIV 感染的辅助 诊断依据，不能据此确诊 HIV-1 P24 抗原检测阴性只表示在本试验 中无反应，不能排除 HIV感染 53 HIV核酸测定 HIV核酸定性检测： 是否存在病毒核酸 HIV核酸定量检测： 血液中病毒复制水平 54 HIV核酸定性检测 血浆、血清或全血中 HIV-1 RNA 10， 00029， 999c/ml为 12.7%;30， 00099， 990c/ml为 17.7%; 100， 000c/ml为 22.4%。在 CD4+ 细胞数相同的 情况下，年纪大的比年轻患者发展至 AIDS的危险更大（ AIDS 2004； 18： 51-58.）。 63 HIV核酸定量测定 常用的 HIV RNA定量测定方法 核酸序列扩增试验（ NASBA） 逆转录 PCR试验（ RT-PCR） 分支 DNA杂交试验（ bDNA） 荧光定量 PCR试验 64 核酸测定注意事项 n 标本类型 n 血浆和血清标本都可用来测定病毒载量，用三种 测定方法进行比较都发现血清和血浆测定的结果 有高度相关性。但是血清的检测结果大约是血浆 的 50%（ 30-80%），可能是因为血液凝固的过程 中 HIV颗粒被包裹在纤维蛋白网络中，导致血清 中病毒的浓度下降。因此，测定病毒载量应该首 选血浆标本，血浆也是临床使用的唯一标本。血 清标本对于研究也是可以接受的，重要的是每位 病人使用的标本类型应始终保持一致。 65 核酸测定注意事项 n 抗凝剂 n 抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适 合做 Amplicor HIV-1 Monitor试验，因为肝素是 PCR反应 的一个潜在的抑制剂。如果必须用 RT-PCR方法测量肝素 处理的血浆，可以向标本中加入肝素酶以分解肝素。另外 ，肝素处理的血浆中病毒颗粒降解的速率显著高于 EDTA 钠盐和枸橼酸钠处理的血浆，一般情况下不同抗凝剂处理 的血液 6小时之内 HIV RNA的降解速率分别是 1.8%/小时（ EDTA）、 3.3%/小时（枸橼酸钠）和 5.0%/小时（肝素） 。在血液处理方法相同的条件下，用 EDTA钠盐抗凝的血 浆结果显著优于枸橼酸钠和肝素，因此 EDTA钠盐是首选 的抗凝剂。 66 核酸测定注意事项 n 标本处理时间和温度 n HIV-1在体内进行快速转换，平均半衰期是大约 6个小时。 HIV-1在体 外未处理的全血中也快速降解，全血中 HIV RNA的降解速率在 6小时 之内平均是 9%（ 0.04log） ,最大的降解速率是在采血以后 6-8小时， 采血以后 30小时内可能减少 0.5log。因此为了减少病毒颗粒降解对检 测的影响，应该在采血以后 6小时之内分离血球和血浆，如果做不到 就应该使用血浆分离管，立即离心 4 存放，需要保存 30小时以上就 应该放在 -70 。 n 温度对 HIV RNA的影响不显著。 -70 室温反复冻融 3次， HIV RNA 变化的幅度小于 0.2log。 -70 保存 5个月， HIV RNA减少 0.3-0.5log， -70 保存 12个月， HIV RNA减少一般不超过 0.4log。血浆在室温或 4 保存 3天， HIV RNA减少不超过 0.5log。 67 CD4细胞检测 CD4+T淋巴细胞计数测定的主要意义 用于 HIV感染者的疾病分期： CD4+T淋巴细胞 0/mm3 艾滋病期 判断 HIV感染者的临床合并症 各种机会性感染与 CD4+T淋巴细胞的相关性。 帮助确定抗 HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗 的适应症 抗 HIV药物疗效的重要判断指标。（周后上升 ） 68 与艾滋病相关的免疫细胞检测 n 艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，主要表现为患者免疫 功能低下。对 HIV感染者与艾滋病患者进行免疫学功能检 测感染者免疫状况，有助于预测判断疾病进程、评价抗病 毒药物治疗效果和估测预后。与艾滋病相关的免疫细胞检 测指标主要 CD4+ T淋巴细胞数目、 CD8+ T淋巴细胞数目 以及 CD4+/CD8+的比例，更为精细的指标还包括 NK细胞 、 B淋巴细胞、 HIV特异性 T细胞等。其中最重要的指标为 CD4+ T淋巴细胞数目。 n AIDS是由 HIV引起的一组综合征， HIV主要侵犯人 CD4+ T 淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫 平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和 肿瘤。因而，对 HIV感染者和 AIDS病人定期进行 CD4+、 CD8+T淋巴细胞 检测具有十分重要的意义。 69 CD4+、 CD8+T淋巴细胞检测意义 n 了解机体的免疫状态以进行疾病分期，以 如美国 CDC就是以此为基础制订了 HIV感染 者 /AIDS病人的诊断和分类标准（见表 1） ，目前国内外仍被采纳应用。我国 国家 免费艾滋病抗病毒药物治疗手册 中将 CD4+T淋巴细胞 CD4350/ l作为开始抗病 毒治疗的标准。 70 CD4+、 CD8+T淋巴细胞检测意义 n 长期监测 CD4+ T淋巴细胞绝对数的变化， 有助于了解患者的病情发展，决定正确的 治疗方案，并观察对治疗的反应。如判断 HIV感染者的临床合并症（如当 CD4+ T淋 巴细胞细胞 200/l时，很容易发生卡氏肺 孢子虫肺炎）。 71 CD4+、 CD8+T淋巴细胞检测意义 n 帮助确定抗 HIV药物治疗及预防机会性感染 治疗的适应症，如当 CD4+ T淋巴细胞 200/l时，应给予抗卡氏肺孢子虫肺炎的预 防性治疗。 72 CD4+、 CD8+T淋巴细胞检测意义 n 是用来评价一些新的、针对 HIV的治疗方法 和治疗药物疗效的重要指标。（周后上 升） 73 CD4检测 注意事项 n 抗凝管 ： K3EDTA n 采血时间：某个相同的时段。如：每次采 样时间均在上午或均在下午。 n 温度： 18-25 保存和运输样品 n 运送时间：样品应在 48小时之内送达检测 实验室 74 HIV诊断试剂临床质量评估方案 75 评估目的 对国内市场销售的国产和进口的 HIV诊 断试剂的敏感性、特异性、批间差异和适 用性进行综合质量评估，及时发现和解决 试剂质量问题； 为中央和地方卫生行政部门提供有关 的决策依据，并作为艾滋病实验室选择试 剂的依据。 76 评估组织形式 国家级评估 国家艾滋病参比实验室（简称参比实验 室）负责组织全国的 HIV诊断试剂临床质量 评估，选择部分具备资质的艾滋病确认中 心实验室和确认实验室参与评估。每年至 少组织 1次。 77 评估组织形式 省级评估 省艾滋病确认中心实验室为各省 HIV诊 断试剂临床评估的主要职能单位。由省艾 滋病确认中心实验室组织评估本省使用的 HIV诊断试剂质量，选择省内艾滋病确认 实验室或具备资质的艾滋病筛查中心实验 室参与评估，每年至少组织 1次。 78 评估程序 样品的组成和采集 目前常用的是 200份 包括 已知样品和未知样品 各 100份。 79 评估程序 样品的组成和采集 已知样品 系经 WB确认的血清（浆）， 其中包括 HIV抗体阴