DNA甲基化与临床应用ppt课件

DNA甲基化与临床应用 目录 甲基化的作用2 临床相关应用4 引言及概念31 甲基化检测相关技术3 为什么 熊猫熊猫 是 黑白黑白 的？ 基因决定命运基因决定命运 同卵双生的孪生子具有完全相同的基 因组。但他们长大成人后在性格、健康方 面往往存在很大差异。 先从表观遗传学谈起 相同的基因型 不同的表型 ? 基因 环境 表型 表观遗传学 现代表观遗传学 概念： 基因的 DNA序列不发生改变的情况下，基因的表 达水平与功能发生改变，并产生 可遗传 的表型。 表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）： DNA甲基化 -表观遗传学的核心（最初始的调控方式 ） 组蛋白修饰 MicroRNA Genomic imprinting 不同层次表达调控 DNA甲基转移酶 ： DNMT 胞嘧啶： Cytosine 5-甲基胞嘧啶 ： 5-Methylctosine S-腺苷 -甲硫氨酸 ： SAM S-腺苷 - 高半胱氨酸 ： SAH DNA甲基化 是指在 DNA甲基化转移酶 的作用下，在基因 组 CpG二核苷酸的 胞嘧啶 5碳位以共价键结合一个 甲基 基 团。 DNA甲基化的概念 DNA甲基转移酶 (DNMT) 哺乳动物体内有三种 DNA甲基化转移酶： DNMT1 、 DNMT3A和 DNMT3B。 n DNMT1- 持续性 DNA甲基转移酶；与甲基化相关，缺 乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸 形。 n DNMT3A、 DNMT3B- 从头甲基转移酶；与去甲基化相 关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚 胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达。 通常 启动子 和 第一个外显子区 ， CpG序列密度非常高，超 过均值 5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区。 结构基因组中 70% 90% 的独立 CpG 都被甲基化 , 未甲 基化的 CpG 成簇地聚集形成 CpG 岛 约有 60以上基因的启动子含有 CpG岛。 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点。 CpG岛（ CpG island） 预测软件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/ 目录 甲基化的作用2 临床相关应用4 引言及概念31 甲基化检测相关技术3 DNA甲基化的生物学作用 u在发育和分化中调控基因的表达 转录抑制 特征性表型基因的表达（肤色、毛发） X染色体的失活（ X-inactivation ） 基因印记 碱基突变 肿瘤代谢 DNA甲基化作为一种可遗传的表观遗传 修饰，在体细胞增殖过程中通过依赖于 DNA复 制的 DNA甲基转移酶 Dnmt1稳定地传递给子细 胞。但在胚胎发育的不同时期，基因组范围内 的 DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最 剧烈的阶段为 配子形成期 与 早期胚胎发育 阶段 ，甲基化模式在配子形成时已经建立。 DNA甲基化与胚胎发育 DNA甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中的重编程 CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 基因表达的调控开关 转录抑制 影响基因表达 直接抑制基因表达或甲基化 的 CpG双核苷酸序列可被甲基结 合蛋白家族 识别，而后者可通过 吸引补充 组蛋白去乙酞化酶 和 组 蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰 蛋白质 来改变染色质的活性 ，以 间接方式影响基因表达。 IAP: intracisternal A particle 去甲基化：灰鼠基因（ agouti）仅微量表达 甲基化：基因超量表达 特征性表型基因的表达 X染色体的失活 X染色体的失活（ X-inactivation ）：生长发育过程中 ，雌性哺乳类动物细胞中的两条 X染色体其中一条失去 活性的现象。 研究发现失活的染色体上 DNA序列都呈高度甲基化， 导致绝大多数基因转录处于关闭状态。 避免因拥有两条 X染色体而产生双倍 基因产物，保持和雄性动物 X染色体 数量及功能上的一致性。 基因组印记？ 组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择 性，即只有一个亲本的等位基因表达，而 另一亲本的等位基因不表达或很少表达的 现象，相应的基因则称为印记基因。 父系不表达称父系印记 母系不表达称母系印记 基因印记 差异甲基化区域 差异甲基化区域 (differentially methylated region， DMR)，是指染色体上甲基化状态 具有亲本特异性的区域，即来源于不同亲 本的 DNA序列甲基化状态不同的区域 差异甲基化主要发生在基因的启动子区，少数 在外显子，现已发现的印记基因大多数具有 DMR 或受 DMR调控。 碱基 C T突变 碱基突 变 甲基化 突变 肿瘤细胞发生时常出现 DNA甲基化模式的 变化，主要包括甲基化转移酶表达水平的提 高、基因组整体甲基化水平的降低和 CpG岛局 部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组不 稳定，如染色质构象异常、转座子激活、原癌 基因激活表达以及抑癌基因被抑制表达等。 DNA甲基化与肿瘤 目录 甲基化的作用2 临床相关应用4 引言及概念31 甲基化检测相关技术3 A基因组甲基化水平 (Methylation Content)的分析 1. 高效液相色谱 2. 高效毛细管电泳法 B候选基因 (Candidate Gene)甲基化分析 1. 甲基化敏感性限制性内切酶 -PCR/Southern法 2. 重亚硫酸盐测序法 3. 甲基化特异性的 PCR 4. 甲基化荧光法 (MethyLight) 5. 焦磷酸测序 6. 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 甲基化检测相关技术 C. 基因组范围的 DNA甲基化模式与甲基化谱分析 1. 限制性标记基因组扫描 2. 甲基化间区位点扩增 3. 甲基化 CpG岛扩增 4. 差异甲基化杂交 5. 由连接子介导 PCR出的 HpaII小片断富集分析 6. 甲基化 DNA免疫沉淀法 高效液相色谱法 直接测序法 焦磷酸测序法 通过检测 CpG对应位点上 C/T渗入的比例对目标位点的甲基化 程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。 全基因组甲基化图谱 全基因组甲基化测序（ WGBS ） 芯片平台 Illumina 850K芯片可检测人全 基因组约 853,307个 CpG位点的甲基 化状态。 850K芯片不但保持了对 CpG岛，基因启动子区的全面覆盖 ，还特别加强了增强子区以及基因 编码区的探针覆盖。广泛应用于干 细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研 究，是目前最适合表观基因组全关 联分析研究的全基因组 DNA甲基化 芯片。 Illumina 850K芯片技术 流程 目录 甲基化的作用2 临床相关应用4 引言及概念31 甲基化检测相关技术3 正常生物 DNA甲基化 DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞 分化发育，基因组 DNA经历了去甲基化、区 域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性 的去甲基化的过程。最后，这种 DNA甲基化 模式就相对稳定下来。 肿瘤组织的 DNA甲基化 肿瘤中普遍存在 DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的 甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。 肿瘤细胞的特征： n 癌基因 低甲基化 被激活 n 抑癌基因 高甲基化 被沉默 应用前景 1-肿瘤的早期诊断 抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生 而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达 l优点： DNA甲基化检测具有早期、无创、快 捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本 ） l缺点：特异性不足 表观遗传学生物标记开发 2017年 3月，张鹍教授团队在 Nature Genetics（ NG）杂志发布了令人振奋的研究成 果，利用更灵敏的算法配合组织甲基化模式开 发的无创诊断技术，可以检测并定位肿瘤。通 过比较肿瘤和正常细胞的 DNA甲基化数据找到 肿瘤特异的甲基化 Marker。 燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统 (MERMAID)，运用多层级甲基化探针设计策略， 可实现在检测成本可控的情况下同时检测 超过 10万个 临床诊断相关的甲基化 CpG位点 ，并通过机器学习算 法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。 cfDNA无创甲基化检测系统 (MERMAID) 用于 肺部占位病变（含肺癌）的早筛可实现 99.6% 的敏感 性和 100% 的特异性，用于肺部结节良恶性判定可实 84.8% 的敏感性和 87.5% 的特异性。 cfDNA甲基化液体活检技术 应用前景 2-肿瘤复发的独立预测因子 口腔鳞状细胞癌时存在 RECK基因甲基化的患者 复发率明显增高 甲基化影响生存期 膀胱癌中 APC、 GSTP1和 TIG1基因发生异常甲基 化时，患者存活时间明显缩短 LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in oral squamous cell carcinomas J . Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058. ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cell - Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352. 应用前景 3-肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于 DNMT活性。正常甲基化 模式的建立需要 DNMT1和 DNMT3的共同作用， DNMT1是 DNMT3启动 CpG核苷酸从头甲基化的 保证，而 DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要 水平（去甲基化） 抑制 DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望 优点：新型抗肿瘤药物 缺点： n无基因特异性 ,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会 引起整体的低甲基化 ; n药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在 ; n大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用 是否会诱发第二肿瘤？ 应用前景 3-肿瘤的去甲基化治疗 M