布病实验室技术培训

布鲁氏菌病布鲁氏菌病 布鲁氏菌病（ Brucellosis）是由布鲁氏 菌属（ Brucella）的细菌侵入机体，引起 传染变态反应性的人畜共患传染病。 布鲁氏菌病简称布病。 布鲁氏菌简称为布氏菌。 布病 病原学 及实验 室检验 1 2 3 布氏菌的生物学特性 布氏菌的抗原及毒力 布病实验室检验 发现和分类位置31.1 抵抗力31.3 形态和培养特征1.2 布鲁氏菌菌的生物学 特性 1 1.1 布氏菌的发现 1887年英国军医 Bruce首先从死于 “ 马耳他热 ”的英国士兵的脾脏中分离出 羊种布氏菌。 1.1布鲁氏菌的分类学位置 微生物分类学家将布氏菌归为布鲁 氏菌属（ Brucella），下分 6个种 19个生 物型。 分类分类 羊种布氏菌（ Bvr.melitensis） 1， 2， 3型； 牛种布氏菌（ Br.abortus） 1， 2， 3， 4， 5 ， 6， 7， 9型； 猪种布氏菌（ Br.suis） 1， 2， 3， 4， 5型； 沙漠森林鼠种布氏菌（ Br.neotemae）； 绵羊附睾种布氏菌（ Br.ovis）； 犬种布氏菌（ Br.canis）。 陕西省布鲁氏菌病病原学调查分析陕西省布鲁氏菌病病原学调查分析 自 1952年起，在人畜间共分离出 3个种 233株布鲁氏菌，其中羊种菌 227株，占总 数的 97.4%。牛种 3株、犬种 3株。 1991年 以前流行优势种型为羊 1、 2型， 1996年后 则为羊 1、 3型 。 陕西省是以羊型菌为主、牛、犬种布鲁氏 菌病的混合疫区。流行优势种随时间推移 发生了变化。 1.2形态和培养特征形态和培养特征 布氏菌属的细菌是一组微小的球杆状的 革兰氏染色阴性菌。柯氏染色，布氏菌 染成红色，其他菌染成绿色或蓝色。 宽 0.3 0.6m，长 0.6 1.5m。无芽 孢、无鞭毛、无质粒、不形成荚膜。 一般说来，羊种菌最小，牛种菌次之， 猪种菌最大。 1.2培养特性培养特性 营养条件高，生长缓慢，生长所需温度为 20-40 ，最适温度为 37 .通常要经过 4-6 天，有的甚至要经过 20-30天（双相培养基 ）才能长出菌落。 1.3抵抗力抵抗力 对物理因子的抵抗力 对化学因子的抵抗力 不同环境中的抵抗能力 对抗生素的敏感性 不不 同同 温温 度度 对对 布布 鲁鲁 氏氏 菌菌 影响影响 对物理因子的抵抗力 布鲁氏菌对消毒剂的抵抗能力布鲁氏菌对消毒剂的抵抗能力 对化学因子的抵抗力 不同环境中的抵抗能力不同环境中的抵抗能力 现已证明，布鲁氏菌对四环素最 敏感，其次是链霉素，而对枯草杆 菌肽、多黏菌素 B、多黏菌素 M素等 有很强的抵抗力 。 对抗生素的敏感性对抗生素的敏感性 布氏菌的抗原、毒力 布氏菌的抗原、内毒素32.1 布氏菌的毒力2.2 2 布氏菌的抗原成分十分复杂，存在 A、 M、 G成分。 A对牛 种布氏菌有特异性， M对羊种布氏菌有特异性， G为两种 菌共有。还与多种细菌存在共同抗原，因而有血清交叉反 应。布氏菌不产生外毒素，只产生内毒素，有致热、致炎 作用，可导致休克。 布氏菌的抗原及内毒素32.1.1 从种上来说，羊种毒力最强，猪种和牛种 次之，犬种的毒力很弱，几乎不引起人致 病。 布氏菌的毒力32.1.2 由于菌种毒力等因素的不同，患病后的临 床表现也不完全一样。 羊 种布鲁氏菌的毒力最强 ,患者中毒症状严 重，多有典型的发烧、多汗、头痛、虚弱 、关节痛、肝脾及睾丸肿大等急性症状。 猪种、牛种次之。 犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。 布氏菌实验室检验 3 细菌学检验33.1 血清学检验3.2 诊断布病的金标准。 3.1.1实验室要求 布氏菌的分离培养要在生物安全二级以上实验 室中进行。 布氏菌是高致病性病原微生物，从危害程度来说 为第二类病原微生物。 细菌学检验33.1 3.1.2方法 采样（采血） 双相培养基 菌株鉴定 （菌落形态观察、涂片、染色、 镜检布氏菌诊断血清玻片凝集试验） 种型鉴定（ CO2需要与否、 H2S的产生的测 定、染料抑菌试验、单项因子血清凝集试 验、噬菌体裂解试验等等） 细菌学检验33.1 3.1.3 布氏菌培养特性 布氏菌是需氧或微需氧菌 生长缓慢，尤其初代分离 牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在 5-10% CO2环境中培养 新长出的菌落无色透明，光滑圆形，突起，均质 ，直径 1-2mm 液体培养均匀混浊，无菌膜 粗糙型菌落较大，生长快 布鲁氏菌培养材料布鲁氏菌培养材料 3.1.4 布氏菌培养检查材料 人或动物的全血、 动物流产胎儿（胎儿的肝脏、肺、胃内容物） 动物脏器、动物胎盘、关节液、阴道分泌物等 新鲜乳汁 布鲁氏菌的培养布鲁氏菌的培养 3.1.5 样品的采集 血培养：急性期、体温反应明显和血清滴度高的病人，血 培养阳性率高 血培养阳性率与病期、体温反应、临床表现以及血清滴度 等有关系 骨髓培养：慢性期病人骨髓培养的阳性率比血液高 从胸腔积液、脓肿和关节液、痰、乳、阴道分泌物 流产胎盘中分离到布氏菌 新鲜乳汁 布氏菌特异的油滴样菌落布氏菌特异的油滴样菌落 布氏琼脂布鲁氏菌菌落布氏琼脂布鲁氏菌菌落 血平皿血平皿 布氏菌菌落布氏菌菌落 布氏菌革兰染色 3.1.6布氏菌鉴定程序布氏菌鉴定程序 分离培养 纯分离传代 玻片凝集初步鉴定，阳性血清、因子血清凝集 H2S产生试验， CO2培养依赖试验 噬菌体裂解试验 染料抑菌试验 PCR检测 其他方法检测 生化测定 脂肪酸分析 PFGE等 布氏菌噬菌体布氏菌噬菌体 我国 1981年起从国外引进布氏菌分型噬菌 体，对鉴定布氏菌有良好使用价值，可以 将布氏菌鉴定到种 目前使用的噬菌体有 Tb Fi BK 2 Wb R R/O R/C 噬菌体对布氏菌的裂解噬菌体对布氏菌的裂解 羊种布氏菌噬菌体裂解羊种布氏菌噬菌体裂解 分离培养基分离培养基 商用培养基 布氏琼脂 布氏肉汤 制备培养基 肝浸液琼脂 血琼脂培养基 胰蛋白眎琼脂培养基 半固体培养基 选择性培养基添加剂（多种抗生素） 商品添加剂 多粘菌素 B 杆菌肽 放线菌酮 制霉菌素 注意： PH 7.2 ，琼脂适量，适当容器 布氏菌培养鉴定布氏菌培养鉴定 新方法的应用 细菌生化 鉴定系统 PCR鉴定 OMP31 AMOS-PCR 双向血培养瓶双向血培养瓶 血清学检验3.2 3.2.1 血清学诊断的意义 3.2.2 针对布病进行的检验 3.2.3 血清样本的采集和保存 3.2.1 血清学诊断的意义血清学诊断的意义 人的布病诊断方法：综合性诊断 （ 1）流行病学接触史：密切接触家畜、野生 动物（观赏动物）、畜产品、布氏菌培养物等 或生活在疫区内的居民 （ 2）临床症状和体征 （ 3）实验室检查：病原菌分离、试管凝集试 验、补体结合试验、抗人球蛋白试验 具备（ 1）、（ 2）和（ 3）项中的任何一 项检查阳性即可确定为布病病人 3.2.2 针对布病进行的检验针对布病进行的检验 实验室检查阳性判定标准 （ 1）病原菌分离：检出布鲁氏菌 （ 2）试管凝集试验： 1： 100（ +）及以上 （ 3）补体结合试验： 1： 10（ +）及以上 （ 4）抗人球蛋白试验： 1： 400（ +）及以上 （ 5）虎红、平板凝集试验：出现可见凝集 （ 6）皮内变态反应：皮试后 24、 48小时分别各观 察一次 ,皮肤红肿范围有一次在 2. 2.厘米及以 上（或 .平方厘米及以上） 虎红、平板凝集试验和皮内变态反应供 初筛试验用 对已确诊的慢性病人和接种过菌苗的人 ，应以临床症状为主要依据，血清学试 验效价高低，皮内变态反应强弱供参考 布氏菌的血清学诊断方法布氏菌的血清学诊断方法 试管凝集试验 (SAT) 虎红玻片凝集试验 (RBPT) 含巯基化物处理血清后的凝集试验（ 2ME 试验） 抗球蛋白试验 (Coombs试验 ) 补体结合试验 (CFT) 乳环凝集试验 (MRT) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 金标法 荧光偏振方法 （ FPA） 3.2.2.1、虎红玻片凝集实验、虎红玻片凝集实验 原理：利用酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的原理：利用酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的 IgM类抗体的类抗体的 凝集活性，主要检查血清中的凝集活性，主要检查血清中的 IgG类抗体。类抗体。 评价：简便快速、容易操作，适用于基层大面积检疫，容易出现假阳性，结评价：简便快速、容易操作，适用于基层大面积检疫，容易出现假阳性，结 果仅供参考，不能作为确诊依据。果仅供参考，不能作为确诊依据。 布病虎红玻片凝集试剂布病虎红玻片凝集试剂 试剂与器材试剂与器材 虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片、 微量移液器、枪头。 方法：在玻片上加 0.03ml被检血清，然后加入虎 红平板抗原 0.03ml，充分混匀， 5min之内观察结 果。 结果判定：出现可见的凝集反应就判为阳性；否 则就为阴性。 评价：简便快速、容易操作，漏检率极低，适用 于基层大面积检疫；容易出现假阳性，临床上需 要借助 SAT来确认。 注意事项注意事项 血清静止的温度和时间对实验结果有很大 的影响，在一定的时间和温度范围内，防 治时间越长，温度越高，假阳性率越低； 患者空腹血清出现假阳性少； 凡是试验中凝集颗粒不规则，大小不匀， 片状或絮状，凝集不清澈者，一般为假阳 性，否则凝集颗粒规则，大小均匀，凝集 清澈者，一般与 SAT结果相符，为阳性。 原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体 产生特异性抗体，这种抗体可与相应的布 氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作 用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也 就是用已知抗原查未知抗体。 3.2.2.2、 试管凝集试验试管凝集试验 3.2.2.2、 试管凝集试验试管凝集试验 试管凝集试验试管凝集试验 阴性阴性 布氏菌试管凝集布氏菌试管凝集 阳性阳性 布氏菌试管凝集抗原布氏菌试管凝集抗原 器材与试剂器材与试剂 实验凝集抗原、被检血清、生理盐水 移液器、吸管、凝集管、试管架、稀释抗原用的玻璃杯、 37度温箱。 方法：每份血清取 9支小试管，放于试管架上。 血清稀释 稀释抗原后；加入抗原 温育 18-22小时 室温放置 2小时后观察结果 比浊管配置 0.2ml血清血清 2.3ml盐水盐水 0.5ml抗原抗原 05ml弃去弃去 2.3 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml盐水盐水 1:1600 比浊管的制备 + + + + 生理盐水（ ml） 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 稀释抗原（ ml） 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 1.00 0.75 0.50 0.25 0.25 0.50 0.75 1.001.00 1.00 1.00 结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是 50%清亮度（ +）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判 定。 + 液体完全透明，菌体成伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈 100%凝集。 + 液体近于完全透明，菌体成伞状沉淀，呈 75%凝集。 + 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈 50%凝集。 + 液体不透明，管底有很不明显的伞状沉淀，呈 25%凝集。 液体不透明，无伞状沉淀。 效价以产生 50%凝集的血清最高稀释倍数为受检血清的效价。 血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才 可判定试验管，否则重做。 人的诊断标准： 1:100+为阳性， 1:50+为可疑。 试管凝集实验的评价试管凝集实验的评价 实验室诊断标准之一 滴度 1 100及以上或病程一年以上者滴度为 1 50及以上为阳性 特异好，实用性、敏感性强 主要检查血清中的 IgG和 IgM，适合于急性期病人 的诊断。 缺点：有前带现象，有时出现假阴性结果；长生 一定的交叉反应；出结果慢，需要两天 注意事项注意事项 受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放 血清处温度不能超过 10 ，采血后应于 3-4 日内进行检查，因放置时间过长可能会导 致血清效价降低。 每份血清和抗原要有对照。 个别血清会出现前带现象，建议多做几个 管，多采用几个稀释度。 3.2.2.3、抗人球蛋白实验（、抗人球蛋白实验（ Coombs） 原理：机体受布氏菌抗原刺激后可产生 “完全抗体 ”和 “不完 全抗体 ”。不完全抗体可与相应抗原结合，但不出现可见 反应。若将预测不完全抗体的人血清球蛋白作为抗原，注 射于另一种动物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗 IgG、 IgA 、 IgM）的抗体，再将此球蛋白抗体加入到抗原与不完全 抗体复合体中，即可出现可见反应。分为两个阶段 : 不完全抗体与相应抗原结合为不可见阶段 抗原抗体复合物有抗球蛋白抗体凝集而形成可见反应 评价：所查抗体主要是 IgG、 IgA；可以作为早期和追溯诊 断；适用于亚急性和慢性病人；操作复杂，耗时长，一般 不作为常规检查项目。 器材及试剂器材及试剂 试剂：试管凝集抗原、被检血清、抗被检对象的 血清球蛋白抗体、生理盐水 器材：普通离心机、温箱、 1ml及 10ml吸管。 方法：试管凝集试验阶段 抗球蛋白反应阶段 吸取上项试验的可疑 管和全部阴性管， 4000转 /分离心 15分钟，反复洗 涤 3次。向各管中加入生理盐水 0.5ml，混匀，再 向各管中加 0.5ml一定稀释度的抗球蛋白血清，将 反应管置 37 温箱中 20-22小时，取出室温放置 2 小时后判定结果。 判定标准同试管凝集试验 对照对照 被检血清对照（被检血清 +盐水） 试管凝集抗原对照（试管抗原 +盐水） 抗球蛋白血清加生理盐水对照 抗球蛋白血清加试管凝集抗原对照 抗球蛋白血清加被检血清对照 对照全部为阴性时，实验才有意义 我国试行的用于诊断人布病标准 1:400及以 上滴度。 注意事项注意事项 在进行 Coombs试验时，洗涤抗原很重要， 如不认真洗涤，在抗原表面上吸附血清中 的某些其他蛋白物质，会干扰下一步加入 抗球蛋白血清的反应，掩盖真正结果。 一般采用加入抗球蛋白血清 1:20-1:50之间 的稀释度。 评价评价 （ 1）布氏菌感染后，约在 15天出现不完全 抗体， 3个月左右达到高峰。可持续一年左 右。该实验可作为早期和追溯诊断。 （ 2）该试验特异性较强，尤其适用于诊断 亚急性和慢性病人，所查抗体主要为 IgG、 IgA类。 （ 3）一般不作为常规项目，在试管凝集试 验为可疑，患者又处于慢性期时，可考虑 抗球蛋白试验予以诊断。 3.2.2. 4、布氏菌补体结合试验、布氏菌补体结合试验 原理：绵羊红细胞和溶血原理：绵羊红细胞和溶血 素可以形成结合物，在补素可以形成结合物，在补 体的作用下，发生溶血。体的作用下，发生溶血。 在反应体系中，他们作为在反应体系中，他们作为 指示系统，与布氏菌的特指示系统，与布氏菌的特 异性抗原、抗体复合物竞异性抗原、抗体复合物竞 争结合补体。如果发生溶争结合补体。如果发生溶 血，说明血清中没有特异血，说明血清中没有特异 性抗体，判为阴性，即不性抗体，判为阴性，即不 是布病患者。是布病患者。 评价：主要检查评价：主要检查 IgG类抗体，特异性强，适用于各型各期病人的