常见罕见神经遗传病基因检测平台的构建与应用

常见罕见神经遗传病 基因检测平台的构建和应用 1 2、疾病基因诊断数据分析原则 1、基因检测技术平台构建及质控 3、神经遗传代谢疾病基因检测 4、遗传性疾病产前诊断及应用 神经遗传疾病基因诊断及分析神经遗传疾病基因诊断及分析 2 人类基因组计划 人类基因组计划 (human genome project, HGP)是由美 国科学家于 1985年率先提出，于 1990年正式启动的。目的是揭开 组成人体 4万个基因的 30亿个碱 基对的秘密。 人类基因组研究的 一个关键应用是通过位置克隆寻 找未知生物化学功能的疾病基因 。 基因组医学时代的到来 3 v 临床基因检测资质 ： 合格的 遗传诊 断 实验 室 ， 按照 ” 1988年 临 床 实验 室 改 进 法案 ” (简 称 CLIA88) ，凡医 疗单 位从事 临 床 检测 的 实验 室 (如生 化 诊 断、血液 诊 断、 传 染病 诊 断、免疫 诊 断、病理 诊 断、超声 诊 断、放 射 诊 断、介入 诊 断、 遗传诊 断等 )都要得到 CLIA颁发 的 资 格 证书 。并由 多个与医 疗卫 生事 业 相 关 的主管部 门 、 执 行机 构、 行 业协 会等共同 组 成 一个委 员 会 (简 称 JCAHO)， 每 隔 两 年， 对 所有 这 些具 临 床 检测资 格的 实 验 室 (如 遗传诊 断中的 染 色体 诊 断和 基因诊 断 )进 行 检查 、 评审 ，其 验 收 合格者， 继续颁发 CLIA资 格 证书 。少 数 非医 疗单 位的商 业 化 基因诊 断公 司，也可由行 业协 会 (如美国 病 理学院， 简 称 CAP，也是 JCAHO的成 员 )按 CLIA标 准代 为进 行 检查验 收。没有 CLIA资 格 证书 的 实验 室 虽 然仍能 开 展 研究性 质 的 基因诊 断，但不能 签发 供 临 床使用的 诊 断 报 告，也不能从医 保机 构 、 患者 或被 检测 者收取 诊 断 费 用 。 遗传病基因诊断 -美国 v CLIA资质实验室质控： 规 定的 质 量控制、 质 量改 进、质 量保 证 等全方位 要求来 设计、验证、 改 进适 合于 临 床使用的 基因诊 断方法。例如，美国 政府的食品与 药 物管理局 (FDA)己决定， 对 于按 CLIA标准 验 收合格的 基因 诊 断 实验 室 (CLIA实验 室 )所研究、 开发、验证 的 基因诊 断技 术 和方法， 不需要 FDA的 进 一步 审查 或批准。 v 技术平台的合理性： 技 术 方法 应该 尽可能 达 到 经济实 用、 简 便快速、高 通量自 动 化 ,以符合医学 诊 断的 规 范化。所以，通 过 CLIA实验 室的系 统验 证 ， 对 于促 进各类技术 在 临 床 基因诊 断中的广泛 应 用是首要任 务。 4 遗传病基因诊断 -美国 5 遗传病基因诊断 -欧洲 6 遗传病基因诊断 -欧洲 v 欧洲的 遗传诊 断 实验 室。以 国家标准化实验室为质量控制和资质发放单位 ， 标准 化实验室制备各类需要基因检测项目的标准品供需要提供基因检测实验室作为临 床基因检测资质的检验指标。 7 遗传病的基因诊断 -指南 EFNS（欧洲神经科学协会联盟） 针对神经遗传疾病分子诊断做出相应的指导 8 遗传病的基因诊断 -诊治标准 9 遗传病的基因诊断 -诊治标准 10 遗传病的基因诊断 -诊治标准 11 遗传病的基因诊断 -诊治标准 12 细胞遗传 检测平台 分子遗传 学平台 遗传信息 技术平台 DHPLC 表观遗传 检测平台 Q-PCR 染色体核型 FISH 测序 遗传病的基因诊断 -技术平台建立 13 遗传病临床基因检测的技术要求 通用性： 全基因检测技术平台， 分子遗传，细胞遗传，分子肿瘤，病原微生物 检测； 分子生物学检测分类： DNA； Oligo； RNA； siRNA 分析和纯化； 基因突变 检测；片段缺失；染色体多倍体和大 片段缺失检测；基因 甲基化 的检测；定量分析； 准确性： 方法准确性 96%(未知突变 )， 99%(已知突变 ) 质控性 : 对 PCR全过程的质量控制 ; 灵敏度： 极低含量基因突变检测能力（极低含量基因突变检测能力（ 1:2000 ） 高通量： 检测能力达 2000 PCR产物 /天 简便性： DNA样品处理简单（ PCR产物无需纯化，标记） 14 遗传病基因检测特色技术平台 DHPLC是根据在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差 异，发现 DNA突变。异源双链 DNA与同源双链 DNA的解链特性不同，在部分变性 条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源 双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。它是一种新型 基因突变筛查技术，既能够自动化、高通量进行，且除 PCR之外，勿需进行 PCR 引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。与传统的 SSCP 、 DGGE等方法相比， DHPLC有较多的优点。 主要应用：主要应用： 1）已知和未知遗传变异的筛查 ； 2）单基因遗传病的基因诊断； 3 ）多基因遗传病的研究； 4）癌症和肿瘤的筛查和诊断； 5）基因甲基化异常疾病 的诊断。 变性高效液相色谱 (DHPLC)技术 15 Heteroduplexes Direct Sequencing C/T C/T WAVE-HS DHPLC Analysis Wild-type Control 50% 20% 2% 0.5% 基因突变检测 : 高灵敏度定量 DNA突变检测 Detection of Mutation in APC MCR: Scanning for Minority Variants DHPLC技术与直接测序技术突变检测比较 16 线粒体脑肌病基因检测 MELAS patient (muscle) heteroduplex MELAS patient (blood) heteroduplex normal DNA MERRF 8344 Heteroplasmy? 17 质 量差的 OLIGO引物 (PAGE 纯 化 ) 质 量好的 OLIGO引物 (DHPLC 纯 化 ) PCR所需引物 QAQC DHPLC技术对 PCR引物 QAQC 18 Analysis of (NH2)- labeled, equal longth oligos with lnt difference 2002: (NH2)- ttttttttttggcctgatgaggagtactgg (30nt) 2002ag: (NH2)- ttttttttttggcctgatggggagtactgg (30nt) PCR引物 ,QRT-PCR探针 ,芯片探针 QAQC DHPLC技术 对各类 Oligo 探针的质量控制 19 DHPLC技术 PCR产物质量控制 BRCA1 PCR片段质控 BRCA2 PCR片段质控 20 UK National Genetics Reference Laboratory 21 遗传信息技术平台 遗传病实验数据和结果分析 22 遗传信息技术平台 国际著名的生物信息中心 NCBI National Center for Biotechnology Information (US) EMBL European Molecular Biology Laboratory EBI European Bioinformatics Institute (EU) SIB Swiss Institute of Bioinformatics (Switzerland, ExPASy) HGMP Human Genome Mapping Project Resource Centre(UK) CMBI Centre of Molecular and Biomolecule (The Netherlands) ANGIS National Genome Information Service (Australia) NIG National Institute of Genetics (Japan) BIC National Bioinformatics Centre (Singapore) 23 杜氏肌营养不良（ DMD） 数据库： http:/www.dmd.nl/nmdb/home.php?select_db=DMD 24 I型神经纤维瘤 （ NF1） 数据库： http:/medgen.ugent.be/LOVD2/home.php?select_db=NF1_germline 25 脊髓性肌萎缩症 SMA（ SMN1） 数据库： http:/www.dmd.nl/nmdb2/home.php?select_db=SMN1 26 异染性脑白质营养不良症 （ MLD） 数据库： http:/www.biochemgenetics.ca/asa/view.php 27 Emery-Dreifuss肌营养不良 数据库： http:/www.umd.be 28 脆性 X综合征 （ FMR1） 数据库： http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/MR/home.php?select_db=FMR1 29 家族性高钾型周期性麻痹 （ SCN4A） 数据库： http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=SCN4A 30 家族性 ALS（ SOD1） 数据库： http:/alsod.iop.kcl.ac.uk/Als/Overview/gene.aspx?gene_id=SOD1 31 常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病 (NOTCH3) 数据库： http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=NOTCH3 32 糖原累积症 -GDSII（ GAA） 数据库： http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=GAA 33 黏多糖贮积症 II型 （ IDS ） 数据库： http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/MR/home.php?select_db=IDS 34 马凡综合症 （ FBN1） 数据库： http:/www.umd.be/FBN1/ 35 先天性肌强直 （ CLCN1 ） 数据库： http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=CLCN1 36 先天性肾上腺皮质增生 （ CYP21A2） 数据库： http:/www.cypalleles.ki.se/ 37 遗传性痉挛性截瘫 （ HSP） 数据库： / http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/L1CAM/home.php?select_db=L1CAM .uk/Manchester/ 38 早期帕金森症 Parkin（ PARK2） 数据库 http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/TPI/home.php?select_db=PARK2 39 遗传咨询 遗传性痉挛截瘫 HSP 数据库中有临床意义的 DNA变异 40 遗传咨询 遗传性痉挛截瘫 HSP 41 遗传咨询 杜氏肌营养不良 DMD 数据库已有报导突变 42 数据库未报到新突变 遗传咨询 杜氏肌营养不良 DMD 43 遗传咨询 杜氏肌营养不良 DMD 数据库未报到新突变 44 遗传咨询 遗传性痉挛截瘫 HSP 数据库中没有临床意义的 DNA变异 45 遗传咨询 遗传性痉挛截瘫 HSP 46 基因检测知情同意书 47 遗传病的基因诊断 -应用 遗传病新概念 遗传病 -细胞内遗传物质改变所引起的 疾病称遗传病 . v 单基因神经系统遗传病检测应用 v 单基因神经系统遗传病产前诊断 48 遗传病的基因诊断 -应用 遗传性疾病分类 神经系统遗传病 血液系统遗传病 心脑血管系统遗传病 泌尿系统遗传病 内分泌系统遗传病 骨骼系统遗传病 生殖系统遗传病 眼部遗传性疾病 皮肤遗传性基因 耳鼻喉遗传性基因 出生缺陷 精神性遗传病 49 遗传病的基因诊断 -SMA v脊髓性肌 肉 萎 缩 症 (SMA)是 儿 童 发 生 率 第二高的 常 染色 体隐 性 遗传 疾病，其新生 儿 发 病率 大 约 是 1/6000-1/10000， 基因 携带 率 大 约 是 1-3 %。 v目前已知造成此症的原因主要是 与 位 于 第五 条 染 色 体 5q11.2-13.3区 域的基因有 关 。在 这个区 域中 ，包含了一 组 呈 镜 向 对称 重 复 的基因， 约 96.5% 的 SMA患 者 都可以 有 SMN1基因有大片段缺失 。 Obstet Gynecol Clin North Am. 2010 Mar;37(1):23-36 50 1 Copies of SMN1 on One Chromosome 5 with a Deletion (Carrier) SMN Gene:位於 第 5號染色體 (5q11.2-13.3) SMN1:具有具有 90 function, translation 出來的為穩定具完整功能的蛋白出來的為穩定具完整功能的蛋白 SMN2:具有具有 10 function, translation出來的為不穩定之蛋白出來的為不穩定之蛋白 1 Copy of SMN1 on Each Chromosome 5 (Not a Carrier) 1 Copies of SMN1 on One Chromosome 5 with a Conversion (Carrier) 51 脊髓性肌萎缩症 (SMA) 52 脊髓性肌萎缩症 (SMA) Type I Type II 产前诊断之重要 Type III 53 脊髓性肌萎缩症 (SMA) Exon7 SMN 1 / 2 gene Amplified PCR product no need of purification PCR DHPLC analysis 54 脊髓性肌萎缩症 (SMA)-SOP SMN1基因外显子 7和 8缺失筛查及 SMN2基因拷贝数 DHPLC检测 分析 标 准操作程序 55 脊髓性肌萎缩症 (SMA)-SOP SMN1基因外显子 7和 8缺失筛查及 SMN2基因拷贝数 DHPLC检测 分析 标 准操作程序 56 脊髓性肌萎缩症 (SMA)-DHPLC 正常 患者 携带者 57 脊髓性肌萎缩症 (SMA)-携带者筛查 58 406 4.45 % 8732 95.56 % Total 9138 19 4.68 % 387 95.32 % Total 406 4 21.05 % 15 78.95 % Total 19 59 脊髓性肌萎缩症 (SMA)-基因诊断 60 脊髓性肌萎缩症 (SMA)-基因诊断 61 Duchenne型肌营养不良症 (DMD) 遗传病的基因诊断 -DMD 杜氏肌营养不良 (DMD)属于 X 连锁隐性遗传病，是男性中常见的遗传性疾病。 发病率约为 1/3 500 活男婴，女性多为致病基因携带者，发病者罕见，且症状较轻。 D M D 发病年龄偏小，起病隐袭，病程长，在男患中症状较重，且病死率高，患者 常常以肌肉的进行性萎缩无力并伴有腓肠肌假性肥大为特征，多在 3,5岁发病，病程 进展快，大多在 20岁左右死于心肺衰竭。患儿由卧到站立有特殊的过程（ Gower征 ），走路为鸭型步态。 D M D 由抗肌萎缩蛋白（ Dys）基因突变所致，属于进 行性肌营养不良症常见 类型。已证实人类抗肌萎缩蛋白基因定位于 X 染色体短臂上 (Xp21.1 3)，基因全长 约 2 220kb，含 79 个外显子 ， cDNA 长 14kb，是目前已知的最大人类基因。 DMD 患者约 3 0 % 为自发性突变，其余的为 X染色体隐性遗传。在各种类型突变 中，单个或多个外显子缺失突变患者占 60% 65%；无意义或框移造成的点突变占 30%，重复占 5% 15%：故 DMD 突变类型主要为缺失，其特点是 Xp21 上外显子 缺失的不均一性。 62 DHPLC技术是通过离子对反向液相色谱分析来区分异源双链核酸分 子及同源双链核酸分子 DNA片段 ,筛查 DNA的变化 ,且不需要放射性同 位素及溴化乙啶凝胶 ,相对高效、经济、自动化程度高。 诊断 -变性高效液相色谱 (DHPLC) 诊断 直接测序 遗传病的基因诊断 -DMD 63 DMD/BMD DHPLC (WAVE) analysis (for most commonly deleted exons) Multi-exon deletion No deletion Single exon deletion GENETIC COUNSELING PCR of remaining exons in sequential panels for deletion analysis Confirm deletion (PCR/Southern) Exon deletion detected PCR sequencing No mutation Mutation present Sequencing analysis Possible duplication Mutation confirmed GENETIC COUNSELING No deletion Confirm with Multiplex Amplifiable Probe Hybridization if no mutation/deletion are found 64 遗传病的基因诊断 -DMD DMD基因检测 SOP文件 65 遗传病的基因诊断 -DMD（大片段缺失） DMD基因 exon51缺失 DMD基因 exon44缺失 66 遗传病的基因诊断 -DMD（携带者） DMD基因 exon89杂合 缺失 67 遗传病的基因诊断 -DMD（重复） 68 遗传病的基因诊断 -DMD（点突变 ） 69 遗传病的基因诊断 -DMD（点突变 ） 70 DMD外显子 54， c.7885delAG，移码突变 DMD基因 c.7885位点 未发现序列异常 c.7885delAG序列改变 父亲 母亲 儿子 遗传病的基因诊断 -DMD（点突变 ） 检测结果在 LOVD基因突变数据库进行检索分析， c.7885delAG在数据库 中未见报道。该突变为移码突变，编码氨基酸终止，可能与 Duchenne型肌营 养不良症发生密切相关。 71 腓骨肌萎缩症 1A型 (CMT),压力敏感性周围神经病 (HNPP) 【 病因及临床表现 】 腓骨肌萎缩症遗传方式主要为常染色体显性遗传 (AD)，也可见常染色体隐性遗传 (AR)及 X连锁显性或隐性遗传 (XD或 XR)。进行性腓骨肌萎缩症 1A型（ CMTIA）和遗 传性压力敏感性周围神经病（ HNPP）由剂量敏感的外周髓磷脂蛋白 22（ PMP22） 基因的拷贝数改变引起，是人类外周神经最常见的遗传疾病。 CMT可根据是否有伴 随神经传导阻滞（ CMT I）的雪旺氏细胞病变或有 “神经突触病变 ”的末梢病变 (CMT II)分为两种亚型（ type1或 type2）。 【 遗传特点及发病率 】 CMT1中最常见 CMT1A则是由 17号染色体 17p11.2p12 间 1.5Mb的复制引起，剂量 敏感型外周髓鞘蛋白 22基因（ PMP22）定位于该 DNA区域。在 17号染色体 17p11.2 p12上同一区域的相互缺失可引起遗传性压力敏感性周围神经病（ HNPP）。 CMT1A的病人有 3个 PMP22基因拷贝，而 HNPP则只有 1个拷贝。 70% 的常染色体 显性遗传的 CMT 1型患者及 90% 的散发病例是由位于 17p11.2 的周围髓鞘蛋白 22 基 因 (PMP22)发生片段大小为 1.5Mb的正向串联重复突变所致。其余患者的发病由基 因的点突变引起，具有高度遗传异质性，目前发现的致病基因包括 PMP22、 MPZ、 Cx32、 EGR 2、 LMNA等。腓骨肌萎缩症发病率为 1/2500。 72 腓骨肌萎缩症 1A型 (CMT),压力敏感性周围神经病 （ HNPP） CMT1A和 HNPP疾病的 PMP22基因检测 sop 73 腓骨肌萎缩症 1A型 (CMT),压力敏感性周围神经病 （ HNPP） 拷贝数在腓骨肌萎缩症 1A型疾病中呈增加 74 CMT1A基因定量检测阳性报告 拷贝数在腓骨肌萎缩症 1A 型疾病中呈增加 拷贝数在遗传性压迫易感性神经病 （ HNPP）中呈减少 腓骨肌萎缩症 1A型 (CMT),压力敏感性周围神经病 （ HNPP） 75 腓骨肌萎缩症 1A型 (CMT),压力敏感性周围神经病（ HNPP） 腓骨肌萎缩症 1A型 (CMT),压力敏感性周围神经病 （ HNPP） 76 遗传病的基因诊断 -Emery-Dreifuss肌营养不良症 Emery-Dreifuss肌营养不良症 (Emery-Dreifuss muscular dystrophy， EDMD)是一种以早期出现肘部屈肌、颈部伸肌和小腿腓肠肌挛缩，伴有不同程度的心 脏受累的疾病。 绝大多数 EDMD患者都为 x连锁隐性遗传，少数患者为常染色体显性遗传和隐 性遗传。 1 1 EMD基因：能够引起 XL-EDMD的 EMD基因定位于 Xq28区域，基因组跨度 2 100bp，含有 6个外显子，编码由 254个氨基酸组成 34kDa的富含丝氨酸的 emerin蛋 白。 EMD基因突变类型约有 100余种。约 95的突变为无义突变，少数为错义突变 和框架内缺失突变 。无义突变导致病变基因在翻译过程中提前终止，没有相应的蛋 白产物生成。少数患者基因突变导致异常蛋白表达，这些异常蛋白缺乏跨膜区域， 不能与核膜结合，导致蛋白离开原来位置，出现在核浆内或细胞浆中。部分患者由 于基因错义突变而导致蛋白数量下降，或产生的异常蛋白位于细胞核边缘，与核膜 的相互作用减弱，从而出现较轻的临床表现 1 2 LMNA基因：常染色体显性遗传的 EDMD的 LMNA基因定位于 lq21，约 24kb ，有 l2个外显子。已知 180多种 LMNA基因突变；约 80突变是错义突变，少数为无 义突变、框架缺失插入突变、结合点突变等。 77 遗传病的基因诊断 -Emery-Dreifuss肌营养不良症 Emery-Dreifuss肌营养不良症基因检测 SOP文件 78 遗传病的基因诊断 -Emery-Dreifuss肌营养不良症 弟弟 EMD 基因外显子 1 存在纯合缺失 姐姐 EMD 基因序列未发现异常 79 遗传病的基因诊断 -Emery-Dreifuss肌营养不良症 母亲 EMD基因发现外显子 1杂合缺失 父亲 EMD基因外显子 1未发现序列异常 80 肢带型肌营养不良症 ( LGMD2B) 肢带型肌营养不良症 ( lmi b-girdle muscular dys- trophy, LGMD)是一组遗传 模式和临床症状具有高度异质性的常染色体连锁遗传性肌营养不良 ,主要累及肢体近 端。其遗传模式分为显性与隐性遗传 , 但约有半数为散发病例。 Bushby和 Beckmann根据基因分析结果 ,将显性遗传者以 LGMD1表示 ,隐性遗传者以 LGMD2表 示。目前已发现的常染色体显性遗传 LGMD有 6种 : LGMD1A、 LGMD1B、 LG- MD1C、 LGMD1D、 LGMD1E、 LGMD1F。常染色体隐性遗传 LGMD有 10种 ,其中轻 型 6种 : LGMD2A、 LGMD2B、 LGMD2G、 LGMD2H、 LGMD2 I、 LGMD2J; 重型 4 种 : LGMD2C、 LGMD2D、 LGMD2E、 LGMD2F, 致病基因均与编码肌聚糖蛋白有关 。 LGMD1较罕见 ,病情通常较轻 ,占所有 LGMD不到 10%。较之 LGMD1, LGMD2更为 常见 ,发病率为 1： 15000,但地域差别也很大。 LGMD2B和 Miyoshi肌病 (MM )是由同一基因 (DYSF)突变引起两种临床症状 不同的常染色体隐性遗传病。 LGMD2B儿童期活动正常 , 20岁左右起病 ,以近端肌营 养不良为主 ,进展缓慢 ,肢体远端前部肌肉到疾病晚期也很少受累。 81 Dysferlin基因 DYSF位于 2p13，有 55个外显子， 可以出现错义、无义、缺失和插入等各种形式的突变 ，至今已发现 50多种突变与 dysferlinopathy有关 肢带型肌营养不良症 ( LGMD2B) 82 肢带型肌营养不良症 ( LGMD2B) 83 患者 A在 5号外显子和 11号外显子同时出现点突变 肢带型肌营养不良症 ( LGMD2B) 84 患者 A姐姐 患者 A妹妹 肢带型肌营养不良症 ( LGMD2B) 85 患者 A亲属 患者 A亲属 肢带型肌营养不良症 ( LGMD2B) 86 遗传病的基因诊断 -异染性脑白质营养不良 (MLD) 异染性脑白质营养不良 (metachromatic leukodystrophy， MLD)又称脑硫质沉 积病，是脑白质营养不良中最常见的一种类型，为常染色体隐性遗传病。酶的缺陷主 要是芳香硫酸酯酶 A缺乏， MLD有遗传异质性，致病基因主要为芳基硫酯酶 A基因 (ARSA基因 )，位于染色 体 22q13 3， ARSA基因有 8个外显子， 7个内含子，覆盖 3 2K8的 DNA区 域 _1，基因 5端非翻译区是一典型的管家基因，表达产物为含 507个氨基酸的多肽， 分子量为 53KD， N端的 18个氨基酸是一个典型的信号序列，使原 ASA不经过蛋白消 化的加工过程即为成熟的 ASA， 迄今为止分析发现有 40多种不同的基因突变，它们 对酶的活性的影响程度也不一样。 87 遗传病的基因诊断 -异染性脑白质营养不良 (MLD) MLD基因检测 SOP文件 88 遗传病的基因诊断 -异染性脑白质营养不良 (MLD) MLD基因外显子 3存在纯合缺失， c.622del.C，移码突变 89 遗传病的基因诊断 -异染性脑白质营养不良 (MLD) 父亲 MLD基因发现外显子 3杂合缺失突变 母亲 MLD基因发现外显子 3杂合缺失突变 90 遗传病的基因诊断 -亨廷顿病 HD 常染色体显性遗传 ,外显率为 100%，受累个体后代 50%发病，男女无显 著差异。 致病基因 (IT15)位于 4号染色体 4p16.3区域 D4S180 和 D4S182之间长 约 210Kb的片断（ Huntingtin，亨廷顿因子），在其开放阅读框架的 5 端有一个多态性的（ CAG，胞嘧啶 -腺嘌呤 -鸟嘌呤）三核苷酸重复 序列，正常值一般在 11-34之间，而在 HD患者则明显增加 (n40)。通 常 CAG重复扩增越多，发病越早。 亨廷顿病 (Huntington disease， HD)是一种以不自主运动 、精神异常和进行性痴呆为主要临床特点的显性遗传性神经 系统变性病。属于基因动态突变病或多谷酰胺重复病的范畴 。 91 遗传病的基因诊断 -亨廷顿病 HD 亨廷顿病 IT15基因突变分析标准操作程序 92 遗传病的基因诊断 -亨廷顿病 HD 93 遗传病的基因诊断 -TSC 结节性硬化症 Tuberous sclerosis complex(TSC)又称 Bourneville-Pringle病，是以颜面皮脂腺瘤、癫痫发作和智 能减退为主要临床特征的常染色体显性遗传疾病 ,儿童和成人 均可受累， LAM是其表现之一。所谓常染色体遗传，与性别无 关。所谓显性遗传，遗传缺陷下传给下一代也会出现 TSC。而 散发的 LAM不具有遗传性。 TSC的基因突变发生在 TSC1或 TSC2。 TSC1位于第 9号染 色体 (9q34)， TSC2位于第 16号染色体 (16p13)。 TSC1和 TSC2 编码的蛋白缺失可导致 mTOR的活化而导致细胞异常分化和增 生。散发的 LAM也存在 TSC1或 TSC2突变，但大部分为 TSC2 突变。雷帕霉素 (Rapamycin)是一种 mTOR抑制剂，是 TSC和 LAM很有潜力的治疗药物。 94 遗传病的基因诊断 -TSC 95 遗传病的基因诊断 -TSC 96 遗传病的基因诊断 -TSC 97 基因诊断 -遗传性痉挛截瘫 （ HSP ） 遗传类 型 基因型 相关基因 AD-HSP SPG4（ 40% ）（重排 10%- 25%） Spastin SPG3A（ 10% ） Atlastin SPG6 NIPA1 SPG31 REEP1 SPG10 KIF5A SPG13 HSPD1 SPG17 BSCL2 SPG42 SLC33A1 SPG12 RTN2/reticulon2 SPG8 KIAA0196/strumpellin AR-HSP SPG11（ 4l一 77 ） KIAA1840/spatacsin SPG15（ 15%） ZFYVE26spastizin SPG5 CYP7B1 SPG7 paraplegin SPG20 KIAA0610/spartin SPG21 ACP33/maspardin X连锁遗传 HSP SPG1 L1CAM SPG2 PLP1 SPG22 SLC16A2 98 遗传病的基因诊断 -HSP 遗传性痉挛性截瘫基因检测 sop文件 99 遗传病的基因诊断 -HSP（ SPG4点突变 ） 100 遗传病的基因诊断 -HSP（ SPG4大片段缺失 ） 101 遗传病的基因诊断 -糖原累积 v 又称酸性 -葡萄糖苷酶缺陷症，或称 Pompe病 v 呈常染色体隐性遗传 v 致病基因： 酸性 -葡萄糖苷酶基因 （ acid alpha- glucosidase, GAA） v致病 基因 ： GAA基因 v染色体 17q25.2-q25.3， v基因组长度约为 20kb，含 20个外显子， v编码酸性 -1， 4-葡萄糖苷酶 ，或称酸性麦芽 糖酶 （ acid alpha-glucosidase, GAA） v该酶的缺乏主要引起肌肉中糖原在溶酶体中沉积、溶酶体酶的 释放导致一系列的细胞结构破环，从而引起各种临床表现 102 遗传病的基因诊断 -糖原累积 103 遗传病的基因诊断 -糖原累积 104 遗传病的基因诊断 -糖原累积 105 癫痫基因 电压门控离子通道 神经递质受体基因 能量代谢基因 大脑皮层发育基因 大脑脂类代谢基因 106 癫痫基因 SCN1A基因 癫痫 是神 经 系 统 最常 见 疾病，表 现为发 作性神 经 功能障碍伴有 脑电图 异常。 我国 约 有 900万左右的 癫痫 患者，同 时 每年新增患者 约 40万。 50% 的 癫痫 与 遗传 相 关，目前已 经发现 多个 癫痫 致病基因，其 编码 蛋白多与跨膜 转 运离子通道有关，其 中最 为 常 见 的是 编码电压 依 赖 型 钠 通道（ Nav）的 SCN1A基因。 SCN1A基因突 变导 致的 癫痫综 合征 临 床表 现 多 样 化， 轻 者表 现为预 后良好的 热 性惊厥， 重者表 现为难 治性 癫痫 。 SCN1A基因突 变 相关的 遗传 性 癫痫 主要有 Dravet综 合征和全面性 癫痫 伴 热 性惊厥附加症（ GEFS+），其中 Dravet综 合征超 过 70% 的患者可 发现 SCN1A基因突 变 ，而 GEFS+仅 有 10% 左右 发现 SCN1A基因突 变 ，其他 癫痫综 合征中 SCN1A基因突 变 率 较 低。 通道 亚单位结构模式图 107 癫痫基因 SCN1A基因 Dravet综 合征又称 婴 儿 严 重肌 阵挛 性 癫痫 ，属于 难 治性 癫 痫 。 临 床上 2岁 以内 诊 断一般 较为 困 难 ，易于 导 致延 误 治 疗 或 错误 治 疗 。大 规 模 临 床研究 发现 ， 对 于可疑 Dravet综 合征患儿 进 行 SCN1A基因 检测 ，可帮助 进 行早期 诊 断，一方面可避免反 复 进 行其他医 疗检查 ，减 轻 患者 负 担；另一方面可帮助 选择 治 疗 Dravet综 合征更 为 有效的 药 物，减少或停止使用已 经证 明 治 疗 Dravet综 合征效果 较 差的 癫痫 治 疗药 物，从而 获 得更好的 临 床效果。除此以外， 进 行 SCN1A基因 检测 的家庭更 倾 向于 积 极接受不同的治 疗 方式，有利于控制病情。 SCN1A基因突 变类 型与 临 床表型存在关 联 。其他 癫痫综 合征 进 行 SCN1A基因突 变检测 可帮助明确 诊 断，判断病情 进 展与 预 后。 SCN1A基因突 变 患者更适合哪些抗 癫痫药 物治 疗 目前已有一些研究， 对 于 SCN1A基因突 变 阳性的 癫痫 患者可 选 择 更 为 合适的治 疗 措施， 实现 个体化 诊 治。 108 癫痫基因 SCN1A基因 109 单基因神经遗传病产前诊断 单基因遗传病产前诊断的指导原则： 1） 单基因遗传病： 指由单个基因异常导致且以孟 德尔方式遗传的疾病； 2） 对无法治疗单基因遗传病 ，进行产前诊断，是 避免致死、致残、致畸性疾病胎儿出生的重要 手段； 3）患者家族中的突变基因已被确认， 或突变基因 所在的染色体能用遗传标记所识别； 4）胎儿父母以及家庭中先证者的标本均可获得； 5）检测必须由经过考核合格的基因诊断室进行： 严格的产前诊断质量控制。 110 单基因遗传病产前诊断实践指南 111 单基因遗传病产前诊断流程 检测 先 证 者的致病基 因 孕 16-18周抽取羊水 （或绒毛、脐带血） 亲子鉴定确 认亲子关系 明确先证者中基因变异位点 与产前孕妇签定知情同意书（只检测确认的变异位点 ） 确认先证者家系成员中该变异位点 STR位点检测排除 羊水的母源污染 检测羊水该变异 位点 确认羊水中基因的变异类型 遗传咨询 阳性 阴性 (不 排除其他 变异类型 ) 遗传咨询 112 单基因神经遗传病产前诊断 -DMD SOP 113 单基因神经遗传病产前诊断 DMD SOP 114 欧洲 产 前 诊 断指南中明确建 议 ，至少要做 2个可 以排除母源 污 染的 STR位点，且要求 检测 灵敏度在 10%以下并需附上灵敏度 结 果 。 STR位点 检测 分析方 法很多，如 PCR-STR荧 光 检测 、探 针 法、 GeneScan 分析等，但是成本 较 高，且无灵敏度 标 准，无形中增 加了基因 检测 的成本且降低了 检测质 量。 应 用 DHPLC技 术 分析，以排除母源 细 胞 污 染 , 随机 扩 增 16个 STR位点 ， 单基因神经遗传病产前诊断 115 DHPLC检测 STR位点排除母源污染的灵敏度检测图 单基因神经遗传病产前诊断 116 产前诊断 -DMD 知情同意书 117 单基因神经遗传病产前诊断 -DMD 测 序 结 果： DMD外 显 子 13， c.1594CT， p.(Gln532*)， 为 CAATAA， 终 止突 变 DMD患者 检测结 果在 LOVD基因突 变 数据 库进 行 检 索分析， c.1594CT在数据 库 中有 报 道， 为终 止突 变 ，可能与 Duchenne型肌 营 养不良症 发 生密切相关 1。 参考文献： 1 Lo IF , Lai KK, Tong TM, et al. A different spectrum of DMD gene mutations in local Chinese patients with Duchenne/Becker muscular dystrophy. Chin Med J (Engl). 2006 Jul 5;119(13):1079-87. DMD患者母亲 送检标本发现 c.1594CT序列改变，为杂合突变，与 患者 检测结果一致。 118 单基因神经遗传病产前诊断 -DMD 119 DMD外显子 54， c.7885delAG，移码突变 DMD基因 c.7885位点 未发现序列异常 c.7885delAG序列改变 父亲 母亲 儿子 遗传病的基因诊断 -DMD(点突变 ) 检测结果在 LOVD基因突变数据库进行检索分析， c.7885delAG在数据库 中未见报道。该突变为移码突变，编码氨基酸终止，可能与 Duchenne型肌营 养不良症发生密切相关。 120 单基因神经遗传病产前诊断 -DMD 121 遗传病的产前基因诊断 -马凡 该病是由于原纤维蛋白基因（ FBN1）缺陷造成的，并已 将该缺陷基因定位于 15q21.1。原纤维蛋白是一种 350KD的糖蛋 白，它与 3种较小的蛋白质构成微原纤维结合性弹性硬蛋白，此 种硬蛋白广泛存在于多种器官中，如眼睫状小带、主动脉中层 、骨膜等。 马凡氏综合症又名蜘蛛指（趾）综合征，属于一种先天性 遗传性结缔组织疾病，为常染色体显性遗传，有家族史。病变 主要累及中胚叶的骨骼、心脏、肌肉、韧带和结缔组织。 122 遗传病的产前基因诊断 -马凡 FBN1基因突变分析标准操作程序 123 遗传病的产前基因诊断 -马凡 124 遗传病的产前基因诊断 -马凡 125 Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) 战胜遗传性疾病 ！ 126 战胜遗传性疾病 ！ 127 SOD1基因突 变检测 辅 助 诊 断家族性 ALS ANG基因突 变检测 辅 助 诊 断家族性 ALS TARDBP基因突 变检测 辅 助 诊 断家族性 ALS AR基因 突 变检测 辅 助 诊 断 X-连锁隐 性 遗传 性脊髓延髓肌萎 缩 （ Kennedy 病） SMA基因 检测 辅 助 诊 断脊髓性肌萎 缩 症（患者） CMTIA和 HNPP基因突 变检测 诊 断腓骨肌萎 缩 症和 遗传 性 压 力敏感性周 围 神 经 病 D4Z4序列重排 辅 助 诊 断面肩肱型肌 营 养不良症（ FSHD） MT-PK基因 CTG重复 检测 辅 助 诊 断 强 直性肌 营 养不良（ DM） PABPN1基因 检测 辅 助 诊 断眼咽型肌 营 养不良（ OPMD） DMD基因片段缺失 检测 辅 助 诊 断杜氏肌 营 养不良（ 79外 显 子） DMD基因点突 变检测 辅 助 诊 断杜氏肌 营 养不良（ 79外 显 子） EMD基因 检测 辅 助 诊 断 Emery-Dreifuss肌营养不良症 LMNA基因 辅 助 诊 断 Emery-Dreifuss肌营养不良症 LAMA2基因突 变检测 辅 助 诊 断先天性肌 营 养不良 1A型 DYSF基因突 变检测 辅 助 诊 断肢 带 型肌 营 养不良症 2B CLCN1基因突 变 辅 助 诊 断先天性肌 强 直 SCN4A基因突 变检测 辅 助 诊 断先天性副肌 强 直 CCDC78基因突 变检测 辅 助 诊 断先天性肌病 CACN1AS基因突 变检测 辅 助 诊 断低 钾 性周期性 瘫痪 1型 SCN4A基因突 变检测 辅 助 诊 断低 钾 性周期性 瘫痪 2型 SCN4A基因突 变检测 辅 助 诊 断家族性高 钾 型周期性麻痹 开展神经遗传性疾病基因检测目录 128 GCH-1基因突 变检测 辅 助 诊 断多巴反 应 性肌 张 力障碍（ DRD） TH基因突 变检测 辅 助 诊 断多巴反 应 性肌 张 力障碍（ DRD） Parkin基因突 变检测 辅 助 诊 断多巴反 应 性肌 张 力障碍（ DRD） SPR基因突 变检测 辅 助 诊 断多巴反 应 性肌 张 力障碍（ DRD） Parkin2基因突 变检测 辅 助 诊 断早 发 性（家族性）帕金森病 DJ-1基因突 变检测 辅 助 诊 断早 发 性帕金森病 PRRT2基因突 变检测 辅 助 诊 断家族性 发 作性运 动诱发 性运 动 障碍 MECP2基因突 变检测 辅 助 诊 断雷特 综 合征 ApoE基因型 检测 辅 助 诊 断阿 尔 茨海默病（ AD） HD CAG重复序列 检测 辅 助 诊 断亨廷 顿 舞蹈病 Atlastin基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG3A Paraplegin基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG7 Spastin基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG4 Spastin基因片段缺失 检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG4 KIAA1840基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG11 Maspar din基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG21 L1CAM基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG1 PLP基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG2 CYP7B1基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG5 NIPA1基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG6 Atlastin基因突 变检测 辅 助 诊 断 遗传 性 痉挛 性截 瘫 ( HSP) SPG3A 开展神经遗传性疾病基因检测目录 129 DRPLA基因 检测 辅 助 诊 断 遗传 性共 济 失 调 （ SCA） SCA基因 检测 辅 助 诊 断 遗传 性共 济 失 调 （ SCA）（ 单项 ） SCA基因 检测 （ 综 合） SCA1， 2， 3， 6， 7， 10， 12 ， 17， 31 辅 助 诊 断 遗传 性共 济 失 调 （ SCA） 结节 性硬化症 热 点 筛查 辅 助 诊 断 结节 性硬化症 TSC1和 TSC2五个外 显 子 TSC的基因突 变 （ TSC1和 TSC2） 辅 助 诊 断 结节 性硬化症 PANK2基因突 变检测 辅 助 诊 断 HallervordenSpatz 综 合征 糖原累 积 症（ GDSI） 热 点 辅 助