基因药物和基因治疗及健康出生

基因药物、基因治疗 及健康出生 1 一、基因药物前景诱人 化学药物：化学方法合成的药物 生化药物：从生物有机体中提取的药物 基因药物：通过基因工程生产的药物 1.基因药物是 21世界生物技术的龙头产业 生物技术药物占整个医药行业的销售份额： 1995年，不足 4%； 2000年， 9%； 2003年， 10%以上 生物技术药物的销售额： 1992年，不足 50亿； 2000年， 300亿， 2003年， 600亿 美国处于领先地位： 2000年， 116种上市； 2001年，又批准 27种，临床试验的 369种， 公司数量和销售额占全世界 67%， 2000年， 200亿， 中国， 2000年， 21种，临床实验 30多种， 30亿 RMB 2 2.基因制药程序 外源基因制备（人工合成，反转录， PCR扩增） 基因体外重组（限制性核酸内切酶，连接酶） 受体细胞表达（细菌，植物，动物） 3 基因工程过程示意图 从细胞中分从细胞中分 离出离出 DNA 限制酶截取限制酶截取 DNA片断片断 分离大肠杆分离大肠杆 菌中的质粒菌中的质粒 DNA 重组重组 用重组质粒用重组质粒 转化大肠杆菌转化大肠杆菌 培养大肠杆菌培养大肠杆菌 克隆大量基因克隆大量基因 4 5 l 人工基因合成法 1. 逆转录法：以信使 RNA 为模板，在逆转录酶的 作用下将脱氧核苷酸合 成合成 DNA(基因 )。 2. 直接合成法：根据蛋白 质的氨基酸顺序推算出 信使 RNA核苷酸顺序， 再据此推算出基因 DNA 的脱氧核苷酸顺序。用 游离脱氧核苷酸直接合 成相应的基因。 DNA合成仪 PCR扩增仪 6 7 3.利用微生物或真核细胞生产基因药物 8 胰岛素是胰岛素是 治疗糖尿病（治疗糖尿病（ 1970S， 0.85%， 1996， 3.2%， 目前，目前， 2亿，亿， 2025， 3亿，中国第三位，亿，中国第三位， 4000万，每年增万，每年增 120 万，每天万，每天 3000.） 的的 特效药特效药 。一般临床上使用的胰岛素主要。一般临床上使用的胰岛素主要 从从 猪、牛等家畜的胰腺猪、牛等家畜的胰腺 中提取，每中提取，每 100kg胰腺只能提取胰腺只能提取 4-5g 胰岛素。用该方法生产的胰岛素胰岛素。用该方法生产的胰岛素 产量低产量低 ， 价格昂贵价格昂贵 ， 远不远不 能满足社会需要能满足社会需要 。 1979年，科学家将动物体内的年，科学家将动物体内的 胰岛素基胰岛素基 因与大肠杆菌因与大肠杆菌 DNA分子重组分子重组 ，并在大肠杆菌内实现了表达。，并在大肠杆菌内实现了表达。 1982年，美国一家基因公司用基因工年，美国一家基因公司用基因工 程方法生产的胰岛素投入市场，售价程方法生产的胰岛素投入市场，售价 降低了降低了 30%-50%。 基因工程药品基因工程药品 胰岛素胰岛素 9 干扰素是干扰素是 病毒侵入细胞后产生病毒侵入细胞后产生 的一种的一种 糖蛋白糖蛋白 。干扰素。干扰素 几乎能几乎能 抵抗所有抵抗所有 病毒引起的病毒引起的 感染感染 ，是一种，是一种 抗病毒抗病毒 的的 特效药特效药 。此外干扰素对。此外干扰素对 治疗治疗 某些某些 癌症癌症 和和 白血病白血病 也有一定疗效。也有一定疗效。 传统的干扰素生产方法是从人血液中的传统的干扰素生产方法是从人血液中的 白细胞内提取白细胞内提取 ，每，每 300L血液只能提取出血液只能提取出 1mg干扰素。干扰素。 1980-1982年，科学年，科学 家用基因工程方法在家用基因工程方法在 大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰 素素 ，是传统的生产量的，是传统的生产量的 12万倍。万倍。 1987年上述干扰素大量投年上述干扰素大量投 放市场。放市场。 基因工程药品基因工程药品 干扰素干扰素 干扰素生产车间干扰素生产车间 干扰素分子结构干扰素分子结构 10 治疗侏儒症治疗侏儒症 的的 唯一方法唯一方法 ，是向人体注射生长激素。而，是向人体注射生长激素。而 生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖 尸体，从大脑的底部尸体，从大脑的底部 摘取垂体摘取垂体 ，并从中提取生长激素。，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的现可利用基因工程方法，将人的 生长激素基因导入大生长激素基因导入大 肠杆菌肠杆菌 中，使其生产生长激素。人们从中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培大肠杆菌培 养液中提取的生长激素，相当于养液中提取的生长激素，相当于 6万具尸体的全部产量。万具尸体的全部产量。 基因工程药品基因工程药品 生长激素生长激素 11 4.把转基因生物作为制药反应器 动物生物反应器 1990s,美国、日本，老鼠， 生长激素，类风湿。 英国爱丁堡，绵羊，抗胰蛋 白酶， 35克 /升， 4000英镑 . 英国鲁斯林研究所 ,转基因 山羊 ,血友病 ,50万英镑 . 转基因动物是指通过实验方法，人工地把 外源基因导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞 ），使外源基因与动物本身的基因组整合在一 起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并 能稳定地遗传给下一代的一类动物。 12 荷兰的 GenPharm公司 用转基因牛生 产乳铁蛋白， 预计每年从牛 奶生产出来营 养奶粉的销售 额是 50亿美元 。 13 商业要求： 1 g/L 14 血液蛋白质 15 16 Example. microinjection 17 Example. Phenotypic analysis Phenotypic Analysis on founders harboring GFP gene (9.5 dpc) GFP+, GFP- embryos GFP+ tail GFP-, GFP+ mice 18 19 植物生物反应器 植物生物反应器 是指通过 基因工程 途径，以常见的农 作物作为 “化学工厂 ”，通过大规模种植生产具有高经济附 加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物 可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂 的方法。 1992年，美国人 C.J.Arntzen和 H.S.Mason率先提出了用转 基因植物生产疫苗的新思路。 20 植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由 星球生 物技术有限公司 （ PlanetBiotechnology,Inc）报道的， 该公司位于美国加利福尼亚境内。该公司利用 转基因烟草 中表达的抗体 sIgA生产新药 CaroRxTM，主要目的是预防和 治疗由细菌引起的龋齿。临床实验证实 CaroRxTM可以有效 清除人口腔内的变异链球菌（ S.mutans）并预防志愿者口 腔产生龋齿。该公司也正在设计和开发一些新的 sIgA抗体 ，用来有效预防口腔、呼吸道、消化道，生殖和尿道等粘 膜系统和皮肤受到一些传染性病菌和毒性因子的感染。 21 美国 著名的孟山都公司（ Monsanto）已经培育出一种转基因玉米， 每公顷玉米可以产生 3.7公斤达到药用蛋白标准的人类抗体。 基因制药的反思和管理 1.反思 需求量有限 高水平的队伍 周期长 投资大 研发成果归个人或小团体所有 人员素质要求高 2.管理 服用基因工程方法方法 生产的人生长激素奶牛 的奶后， 儿童发病率比正常儿童 增加了三倍，日本报道 了 5例后， 欧洲发现了 6例。 22 三、荆棘路上的基因治疗 1.基因病及其治疗 遗传 病是指由 遗传物质 发生改变而引起的或者是由致病 基因 所控制 的疾病 基因病的类型 单基因病（镰刀型红细胞贫血病） 多基因病（冠心病、 65%、哮喘病 80%、 精神分裂症 80%、高血压 62%） 获得性基因病 （艾滋、乙肝） 23 24 镰刀型贫血症的发生率为 8/100000，但是在某些人 种中却有较高的发生率，例如非洲裔的美国人发生率为 1/600以及西班牙裔的美国人为 1/1000-1400。这个疾病 因具有遗传性所以在出生时便就已经存在了，病征大约 在出生后 4个月会开始出现。在非洲大陆研究发现，具有 镰刀形细胞特征的人比具正常性征的人更不容易罹患疟 疾 (malaria)。 25 血红蛋白病 镰刀形细胞贫血症 26 基因突变类型 异常 Hb 氨基酸变化 临床特征 错义突变 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG) 不稳定 Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG) 镰刀型细胞贫血 Hb Bibba 136LeuPro(CUGCCA 不稳定 Hb病 无义突变 Hb Mckees Rocks 145Tyr 终止 (UAUUAA) 不稳定 Hb病 终止密码突变 Hb Constant Spring 142UAACAA- - - 地贫 (延长： 142Gln- -173UAA) 密码子缺失 Hb Gun Hill 91 95缺失 不稳定 Hb病 密码子插入 Hb Grady 118与 119间插入 3个氨基酸 无明显症状 移码突变 Hb Tak 147UAAACU AA- 不稳定 Hb病 -158UAA(Thr) 融合突变 Hb Lepore-Boston 87(Gln)-116(His) -地贫 Hb Kenya 81(Leu)-86(Ala) -地贫 27 2.基因病的传统疗法 苯丙氨酸 酪 氨酸 (正常 ) 苯丙酮酸 积累正常酶无法合成 酶 损伤 神经 系统另一种酶 12号染色体苯丙氨酸羧化酶基因突变 28 糖原储积症 : 溶酶体中缺少 a-1.4糖苷酶 ,不能将糖原转化成葡萄糖 ,心肌造成损 伤 ,2岁前夭折 半乳糖血症 : 常染色体隐形遗传病 ,缺少半乳糖 -1-磷酸尿苷酰转移酶 ,半乳糖不 能转化成葡萄糖 ,半乳糖积累 ,患儿生长停滞 ,智力迟钝 ,肝脏受损死 亡 ,还可引发白内障 . 侏儒症 : 补充生长激素 . 先天性缺少甲状腺的 : 注射甲状腺素治疗 . 29 3.什么是基因治疗 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过 一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治 疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。 30 二、基因治疗途径和进展 1.基因治疗技术 基因补偿：校正和替代 反义技术： 自杀信号途径 : 共刺激信号途径 : 31 2.基因治疗的历史和现状 l 1966年：安德森提出 “基因治疗 ”概念。 l 1970年：美国医生罗杰斯尝试基因治疗精氨酸血症。 l 1980年：美国加州大学马丁 克赖恩教授进行人类第一 例真正意义上的基因治疗，未获批准，也未获成功。 马丁 克赖恩教授被誉为 “基因治疗的先驱 ”。 l 1989年：美国批准进行 5例标志基因的人体转移试验。 安德森被誉为 “基因治疗之父 ”。 l 1990年：布利等人进行了世界上首次人体基因治疗的 临床试验，取得初步治疗效果。 l 1991年起：国内外基因治疗临床试验越来越多。 32 3. 基因治疗的类型 q生殖细胞基因治疗（ Germline gene therapy ） :是 在生殖细胞中进行操作，改变生殖细胞的程序，这 些细胞能将改变传递给下一代，使其后代从此再不 会得这种遗传疾病。 q体细胞基因治疗（ Somatic gene therapy ） :是在 体细胞中进行基因操作，以改变身体已分化细胞 DNA 的程序，但这些细胞没有能力将这种改变传递给一 代，其子孙后代仍会患这种病。 33 4.成功的例子不多 : 20世纪 70年代中期 ,美国科学家在原西德 ,7岁、 2岁的姐妹俩， 缺少一种酶，呈明显的精神痴呆症。实验失败，但是也无副作用， 没有引起舆论界的关注 1980，美国人，克林，垂危状态的地中海贫血病人，一个以色列人 ，一个意大利人，由于方法不成熟，技术上存在问题，实验失败， 并且实验没有受到学校当局的批准，受到舆论界的批评，失去了美 国联邦基金的支持。 34 5.基因治疗成功实例 复合免疫缺陷综合征的基因治疗 （人类 Gene治疗成功例子） l ADA缺乏症 - 致死性疾病，患者由于 腺苷酸脱氨酶（ ADA） 缺乏。 35 ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者 T Ly C IL-2刺激 C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次 , 10个月 患儿体内 ADA水平达正常人的 25% 1990.9月， 4岁女孩， 1991.5月，达到 25%10个 月内接受了 7次输注，停半年后还要每隔 3-5个月 输注，同时还要服药。 1991.1月， 9岁女孩， 2000.4月，法国三例， 2002英国两例，一个 18个 月，一个 2.5岁 . 36 l 现状： 从 1990年至 1994年， 40余项基因治疗方案被批准； 至 1998年，已实施 373个临床方案， 3134人接受了基因转 移试验（其中肿瘤方案 234个，受试者 2134人）；至 2002 年， 400余项基因治疗方案进入临床试验；至 2003年，基 因治疗药物上市。 37 l 重点： 遗传病（如血友病、囊性纤维病、家族性高胆固醇 血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋 病、类风湿等），而且 以恶性肿瘤为基因治疗研究的重点 对象。 38 三、基因治疗的类型和用于基因治疗的载体 l 体外法（ ex vivo）： 将病人的细胞取出，在体外加入 正常基因校正细胞，再将校正后的细胞放回到病人体 内，使新的功能得到表达。 l 原位法（ in situ）： 将新基因直接引入病人疾病部位 （如癌块、肺树内膜等），可用病毒宿主或裸露的 DNA 引入。 l 体内法（ in vivo）： 将宿主注入血流，将治疗性基因 以安全有效的方式带至组织，目前尚未研制成功。 1.人类体细胞基因治疗方法 : 39 2.用于基因治疗的载体（ Vector）： q病毒载体：主要有反转录病毒（ Retrovirus, RV）、 慢病毒（ Lentivirus, LV）、腺病毒（ Adenovirus, AV）、腺相关病毒（ Adeno-Associated Virus, AAV ）等。 q非病毒载体：主要有脂质体（ Liposome）、裸露 DNA （ Naked DNA）、细菌及物理方式（ Physical means ）。 40 四、基因治疗面临的问题与分歧 一是技术方面，认为对生殖细胞的基因操纵可能 使后代产生缺陷，即认为目前对人体系统的运作知之 甚微，建立于盲目基础上的良好愿望可能带来不测的 危险结果。 二是社会伦理方面，人能否改变人？人的尊严何 在？以什么标准来改变人？等等。 结论：这些异议表明，生殖细胞基因治疗既然涉 及人类种族的繁衍，我们就必须严格控制其临床应用 ，以免因为滥用而造成严重危害。 1.生殖细胞基因治疗的伦理思考 ： 41 2.体细胞基因治疗的伦理思考： 第一，不应该伤害患者，如增加患者的健康风险、产 生有害基因突变和治疗导致的传染性的传播等； 第二，不能伤害医务人员和患者家属，伤害形式是治 疗导致的致病感染、法律责任和心理伤害等； 第三，不能伤害一般公众，这种可能的伤害是新病毒 的产生并传染的危害、治疗费用的负担、治疗带来的进化 效应（如对生殖细胞的意外感染）及其它意外事件。 42 五、基因治疗的伦理原则 q安全原则： 具有合适的靶基因，即作为 替代、恢复或调控的目标基因；具有合适 的靶细胞，即接受靶基因的细胞；具有高 效专一的基因转移方法，以使外源靶基因 导入靶细胞内；基因转移后对组织、细胞 无害；在动物模型实验中具有安全、有效 的治疗效果；过渡到临床试验或应用前需 向国家有关审批部门报批。 43 q知情同意原则。 世界卫生组织和国际医学委员会发 表的 伦理学与人体研究指南 和 人体研究国际 伦理学指南 中规定：基因治疗必须遵循最后选择 原则，即在某种疾病在所有疗法都无效或微效时， 才考虑使用基因治疗。基因治疗还必须尊重患者的 知情同意权，让患者认识到将采用的基因治疗方案 对他本人有何益处，同时亦可能导致哪些伤害，让 患者自主地决定。 44 q公正原则。 目前基因治疗的费用高昂，这种高昂的 投入和相对微弱的效益，不能不引起公共卫生事业 界人士的异议。基因治疗只能用于治病救人的目的 。 q保密原则。 基因治疗的前提不可避免地要知道患者 的遗传信息。如果把患者的遗传信息尤其是基因缺 陷泄漏给外界，有可能会影响患者的升学、就业和 保险申请，产生社会歧视等严重的社会问题。 45 46 常染色体单基因遗传病 软骨发育不全 白 化 病 并 指 此外，重点介绍苯丙酮尿症的发病原因 47 进行性肌营养不良抗维生素 D佝偻病 性染色体单基因遗传病 48 兔 唇 无 脑 儿 此外，还有青少年型糖尿病、原发性高血压 等 学生活动： 总结多基因遗传病特点 49 21 三 体 综 合 征 （多了一条 21号染色体 ） 13 三 体 综 合 征 （多了一条 13号染色体） 50 先天性愚型先天性愚型 (21三体）三体） 51 遗传病的危害遗传病的危害 q1、我国遗传病患者占总人口比例：、我国遗传病患者占总人口比例： 20%-25% q2、新生儿先天性遗传缺陷约为、新生儿先天性遗传缺陷约为 1.3% q3、在自然流产中，约、在自然流产中，约 50%是染色体异常引起！是染色体异常引起！ q4、我国人口中患、我国人口中患 21三体综合症的人在三体综合症的人在 100万万 以上。以上。 q5、每年仅由、每年仅由 染色体畸变，染色体畸变， 造成造成 52万万 例自发流产。例自发流产。 我国遗传的发病现状：我国遗传的发病现状： 危害 患者、后代、家庭、社会 环境污染是导致遗传病发病率上升的主要原因。 52 素质素质 负担负担 名 称 人 数智力低下 34.