基因组学基因诊断与基因治疗

基 因 组 学 1 Content 基因组学的概念 基因组学的特点：七性三化 基因组学发展的里程碑 基因组学的重要进展 基因组学研究的意义 小鼠基因组技术 2 基因组学的概念 所有生命都具有指令其生长与发育，维持其结 构与功能所必需的遗传信息，生物所具有的携 带遗传信息的遗传物质总和称为 基因组 。 基因组学 是研究生命体全部遗传信息的一门科 学。基因组学是一门年青的学科，并处在迅速 发展之中。 3 基因组学的概念 基因组学的特点：七性三化 基因组学发展的里程碑 基因组学的重要进展 基因组学研究的意义 小鼠基因组技术 内 容 4 1991 人类基因图数据库正式建立 1992 人类染色体低分辨率的基因联锁图出版 ,BAC克隆技 术问世 1993 国际基因分子表达式分析组织开始，建立起有效的 基因图和 cDNA基因序列， PAC克隆技术问世 1994 基因图 5年计划提前一年完成。完成了每个人类染 色体的绘制 1995 鸟枪法完成流感嗜血杆菌基因组测序，发表人类基 因组 YAC重叠群物理图和 STS物理图 基因组学的重要进展 5 1996 有 30000个序列的人类基因图的细节被描出来。完 成酵母基因组和第一个古细菌詹氏甲烷球菌基因组 测序 1997 完成大肠杆菌基因组测序 1998 完成第一个多细胞生物线虫基因组测序 1999 Celera Genomics宣布首条人类染色体完成测序，人 类第 22号染色体 DNA全序列测定。 1999 中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因 组全部序列的 1%。 2000 完成果蝇基因组测序 6 基因诊断与基因治疗 蚌埠医学院 实验动物中心 7 Content 基因诊断 gene diagnosis 基因治疗 gene therapy 8 基因诊断的概况 基因诊断经历了三个基本发展阶段 第一阶段： 以 DNA分子 杂 交 为 基 础 ； RFLP进 行分析 第二 阶 段： 应 用 PCR技 术 第三 阶 段： 应 用基因芯片技 术 9 工 具： 放射性同位素标记或荧光分子标记 的 DNA分子探针 原 理： 碱基互补配对原则（ DNA分子杂交） 基因诊断： 是以 DNA或 RNA为诊断材料，通过检 查基因的存在、缺陷或表达异常， 对人体状态和疾病作出诊断的方法 和过程，又称 DNA诊断或分子诊断 10 基因诊断过程 制备基因探针 提取目的基因，获得单链 DNA PCR扩增 DNA 目的 DNA与尼龙膜结合 探针与目的 DNA互补配对 冲洗尼龙膜 检测杂合分子 关键要素： 探针 DNA、目的 DNA、信号检测 11 基因诊断的基础技术 核酸杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术 12 基因诊断的临床应用 遗传病的基因诊断 肿瘤的基因诊断 感染性疾病的基因诊断 基因诊断在法医学鉴定中的应用 基因诊断在器官移植配型中的应用 13 举例：镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子 AT 表达产物：谷氨酸 缬氨酸 一个碱基突变 缺失 1个 Mst 内切酶位点 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb 14 5 3 5 3 1.1 kb 1.3kb Mst II酶切位点 （ CCTNATG） 正常基因 突变基因 1.3kb 1.1kb 0.2kb 1 2 3 1、正常人 2、突变携带者 3、患者 15 基因治疗的概念 狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺 陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内 发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 16 基因治疗的类型 体细胞基因治疗（ somatic cell gene therapy）： 需要对普通的细胞进行操作，通常是可以从有机体内取出 细胞，转染然后放回体内。 生殖细胞基因治疗（ germ cell gene therapy）： 受精卵缺陷的基因被正常的基因所代替，然后重新移植到 母体中。胚胎治疗通常通过微注射的方法进行的，从理论 上讲可以用来治疗任何遗传性疾病。 伦 理 17 基因治疗的总体策略 基因矫正 基因置换 基因增补 基因失活 “自杀基因 ”的应用 免疫基因治疗 耐药基因治疗 18 （一）基因矫正（ gene correction） 对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使 其恢复正常功能； （二）基因置换（ gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞 DNA完全恢复正常状态； 19 （三）基因增补（ gene augmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到 染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。 （四）基因失活（ gene inactivation）： 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互 补作用与 mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因 的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。 反义 RNA: 干扰 mRNA的互补 RNA; 反义 DNA: 干扰 DNA的互补 DNA. 20 （ 五） “ 自杀基因 ” 的应用 自杀基因，这种基因导入受体细胞后可产 生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物 前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀 死，这种基因被称为 “ 自杀基因 ” 。 自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞 杀死。但对正常细胞则无伤害作用。 21 （六）免疫基因治疗 将某些细胞因子（ IL-2、 GM-CSF等）基因 导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （七）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性 的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更 大剂量的化疗。 22 基因治疗的应用及前景 (一 )基因治疗应满足的条件： 1、单基因缺陷疾病 2、仅限体细胞的基因治疗 3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。 4、治疗效果应胜过对病人的危害。 5、表达水平无需调控且无副作用。 6、需经动物实验验证安全可行。 23 （二）基因治疗有待解决的问题 1、难以获得真正有治疗作用的基因。 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。 5、随机整合潜在的威胁。 24 基因治疗实例 1.复合免疫缺陷综合征的基因治疗 ADA缺乏症 - 致死性疾病，患者由 于腺苷酸脱氨酶（ ADA）缺乏。 SCID患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中 25 2.乙型血友病 XR ，患者凝血因子 缺乏，临床表现，易 出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出 血不止。发病率为 1/30000。 例如：我国学者薛京伦实施的 F 的基因治 疗。 26 3.黑色素瘤的基因治疗 肿瘤 Gene治疗是人们十分关注的问题，进 行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋 巴细胞 TIL ，它积聚肿瘤部位，并在 该处持续存在而无副作用，利用此特点协 助治疗肿瘤。 27 4.胰腺癌的基因治疗研究 28 胰腺癌是腹部外科最难获得早期诊断，且预后最差的 恶性肿瘤。 虽然目前在胰腺癌的发生、演进、早期诊断和综合治 疗等方面取得了一些进展，但仍需要更多的研究去解 决这些问题，攻克胰腺癌依然任重道远。 胰腺癌治疗现状： 29 传统的细胞毒药物对胰腺癌并无益，目前治疗胰腺癌的一线 药物是吉西他滨。 1996年美国 FDA批准吉西他滨用于治疗进展期胰腺癌。 研究结果表明，接受吉西他滨治疗者生活质量优于氟尿嘧啶 ，但治疗反应率和生存时间相似。 吉西他滨 +特罗凯联合用药延长了数星期的生存期，其他的 联合用药方案亦在研究中。 30 胰腺癌治疗现状： 近年来，胰腺癌的远期疗效和预后并未带来突破性进 展，研究表明胰腺癌的发生发展为多基因参与、多步 骤发生的复杂的生物学过程。 基因治疗是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤 治疗的最有前景治疗方案之一。 31 自杀基因治疗： 又称基因定向酶药物前体疗法： 是利用转基因的方法将 药敏基因 导入肿瘤细胞，从而 增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。 也就是说，使无毒的药物前体通过该基因表达的产物 转化为对细胞有毒性作用的药物，干扰肿瘤细胞 DNA 的合成，抑制肿瘤细胞的生长，从而杀死肿瘤细胞。 这种使肿瘤细胞自杀的基因称 “自杀基因 ”。 32 如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体 药物前体 无毒 Gene 酶 药物复合物 有毒 细胞死亡 33 旁观者效应 :“自杀基因 ”治疗不仅使转导了 “自杀基因 ”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且 与其相邻的未转导 “自杀基因 ”的肿瘤细胞也被 杀死。 旁观者效应 34 自杀基因治疗进展： 胰腺癌的自杀基因治疗已经取得了重大进展，有着广阔的 前景； 但目前的成果尚局限于动物实验阶段，要想进一步应用于 临床治疗，还有许多问题尚待解决。 虽然从基础实验过渡到临床应用仍有一段距离，相信随着 研究的不断深入，基因治疗在胰腺癌的治疗中能够发挥更 大的作用，必将成为一种有效的胰腺癌辅助治疗手段。 35 反义基因治疗： 这种方法的目的是阻止肿瘤相关基因的转录与翻译。 反义寡核苷酸以互补的形式与特定的 DNA或 RNA序 列结合 , 从而阻止 DNA的转录或 RNA的翻译 , 使肿瘤 基因无法表达。 由于 K-ras基因突变在胰腺癌中最为常见 , 因此许多反 义基因治疗都以其为靶点，许多研究表明针对 K-ras 的反义寡核苷酸对胰腺癌有抑制作用。 36 干扰 RNA基因治疗 对 RNA干扰的认识来源于用线虫（ C. elegans）和果蝇。实 验结果显示，有义链 RNA（ sense RNA）或反义链 RNA（ anti- sense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链 RNA比单链 RNA 更为有效。 将特异的双链 RNA注入线虫体内可抑制有同源序列的基因 的表达。得到的结果是有义链 RNA和反义链 RNA都同样阻断基 因表达途径。 这与传统上对反义 RNA技术的解释正好相反。而且其抑制 基因表达的效率比反义 RNA至少高 2个数量级。 1.RNA干扰现象 RNA干扰 （ RNA interference， RNAi） 是一种由双链 RNA诱发 的基因沉默现象。在此过程中，与双链 RNA有同源序列的信 使 RNA（ mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。 37 2. RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有 2个步骤： （ 1）小干扰性 RNA（ siRNA）