如何规范病原体检测及结果的正确解读

如何规范病原体检测及如何规范病原体检测及 结果的正确解读结果的正确解读 1 内内 容容 病原体检测的目的1 临床标本的正确采集2 3 检测结果的正确解读4 病原 体 检测 方法 2 一 . 病原体检测的目的 3 抗感染治疗抗感染治疗 n 经验治疗经验治疗 (empirical therapy ) n 推测推测 可能的病原体及敏感性选用药物；可能的病原体及敏感性选用药物； n 建立在建立在 流行病学流行病学 资料之上（重要参考资料之上（重要参考 耐药监测耐药监测 资料）；资料）； n 建立在建立在 概率权衡概率权衡 上，为上，为 保证有效概率常常以选用广谱、强保证有效概率常常以选用广谱、强 效抗菌药为代价；效抗菌药为代价； n 治疗初始的必然选择，亦用于非重症感染。治疗初始的必然选择，亦用于非重症感染。 n 病原治疗病原治疗 (目标治疗，目标治疗， target therapy) n 根据病原学诊断、药敏选择药物，是理想之选；根据病原学诊断、药敏选择药物，是理想之选； n 医院感染、重症社区感染应确保达到病原治疗；医院感染、重症社区感染应确保达到病原治疗； n 临床微生物室起关键作用；临床微生物室起关键作用； n 培养结果的准确解读。培养结果的准确解读。 4 临床病原体检查目的临床病原体检查目的 1.感染性疾病的明确感染性疾病的明确 诊断诊断 ； 2.通过药敏试验指导临床通过药敏试验指导临床 合理用药合理用药 ； 3.病原体监控和耐药性病原体监控和耐药性 监控监控 。 5 临床病原体检查的意义临床病原体检查的意义 病原学检测是抗感染治疗的病原学检测是抗感染治疗的 基石基石 ，对提，对提 高疗效、改善预后、降低费用和减少不高疗效、改善预后、降低费用和减少不 良反应极其重要；良反应极其重要； 临床微生物实验室是临床的重要临床微生物实验室是临床的重要 “情报情报 部门部门 ”，是抗感染治疗的，是抗感染治疗的 “眼睛眼睛 ”； 临床与实验室的临床与实验室的 充分沟通充分沟通 有助于改善双有助于改善双 方工作。方工作。 6 协助明确疾病诊断 推测病程进展 制定治疗措施 观察病情 7 各种不同病原体的实验诊断方法 遵循以下基本原则 1.正确、规范采集和运送标本。 2.直接显微镜查见病原体或检出病原 体抗原，借助分子生物学的方法检 测病原体核酸，结合病人的病史、 症状或体征，快速作出初步诊断。 8 各种不同病原体的实验诊断方法 遵循以下基本原则 3.初步诊断同时，对病原体进行分离与 鉴定。 4.检测机体对病原体的免疫产物。 5.参与临床选择抗菌药物，指导和监控 微生物的治疗方案，避免 耐药菌株的 产生。 9 二 . 临床标本的正确采集 10 临床病原体检查的基本程序临床病原体检查的基本程序 n 医生、护士、病人、检验师：正确采集医生、护士、病人、检验师：正确采集 运送标本。运送标本。 n 检验科：直接镜检、免疫学和分子生物检验科：直接镜检、免疫学和分子生物 检测、病原体分离培养鉴定、药敏实验检测、病原体分离培养鉴定、药敏实验 报告结果。报告结果。 n 医生：明确诊断、合理用药。医生：明确诊断、合理用药。 n 有资料显示有资料显示 ， 微生物室的误差微生物室的误差 71%是是 实验实验 前因素前因素 造成的。造成的。 11 标本采集的基本原则标本采集的基本原则 n 无菌、及时、按照要求、标注清晰无菌、及时、按照要求、标注清晰 n 根据病史与临床表现确定标本采集的类型与根据病史与临床表现确定标本采集的类型与 部位，尽量采集病变明显部位标本。部位，尽量采集病变明显部位标本。 n 在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗 菌药物使用前（如使用过抗菌药物应在申请菌药物使用前（如使用过抗菌药物应在申请 单上注明）。单上注明）。 n 采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖 密封、立即送检。密封、立即送检。 n 标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检 。 12 标本送检标本送检 n 标本要求在标本要求在 30min内送检，否则影响阳内送检，否则影响阳 性率。性率。 n 烈性传染病标本需专人护送。烈性传染病标本需专人护送。 13 遵照医嘱 充分准备 严格查对 正确采集 及时送检 14 标本的采集和送检六原则 避免杂菌污染 不同期不同标本 用抗菌药物前 采集病变明显部位 运送注意保存 标本必须新鲜 15 拒收标本拒收标本 1.样本上无病患标签或病患标签与检验申请单不符合。样本上无病患标签或病患标签与检验申请单不符合。 2.样本以不适当的温度、运送培养基及容器运送。样本以不适当的温度、运送培养基及容器运送。 3.样本的量不足、已被防腐剂固定和运送时间过长。样本的量不足、已被防腐剂固定和运送时间过长。 4.样本外漏、容器破损及明显受污染的样本。样本外漏、容器破损及明显受污染的样本。 5.样本的检验项目申请不适合进行。样本的检验项目申请不适合进行。 6.当日重复送样本（除血液培养外）。当日重复送样本（除血液培养外）。 7.已接触空气的厌养菌检测标本。已接触空气的厌养菌检测标本。 8.被正常厌养菌污染的标本，要求检测。被正常厌养菌污染的标本，要求检测。 16 三 . 病原 体 检测 方法 17 临床常见病原体检查方法临床常见病原体检查方法 n 直接显微镜检直接显微镜检 n 血清学诊断血清学诊断 (查特异性抗原查特异性抗原 /抗体抗体 ) n 病原体核酸检测病原体核酸检测 (PCR.DNA探针探针 ) n 病原体的分离培养和鉴定病原体的分离培养和鉴定 18 致病菌的检验程序致病菌的检验程序 直接涂片 染色镜检 分离培养 形态特征 生化试验 血清学试验 动物实验 明确 诊 断 初步诊断 血清学诊断 细菌的快速鉴定 形态学检查 （常规培养或 特殊培养） （凝集试验、 沉淀反应、免疫标记技术等） (微生物数字编码分类鉴定法、血培养自动化检测系统、核 酸杂交技术、 PCR技术、 DNA芯片技术等） 药 物 敏 感 试 验 19 临床感染常见病原体检查临床感染常见病原体检查 n 细菌形态学检查细菌形态学检查 n 直接观察法直接观察法 n 染色标本镜检染色标本镜检 20 革兰氏阳性球菌 革兰氏阴性杆菌 21 墨汁染色找 新型隐球菌 抗酸染色 阴性杆菌生长速度快于阳性球菌、念珠菌！ 22 常用的血清学诊断方法常用的血清学诊断方法 类型类型 诊断应用举例诊断应用举例 直接凝集试验直接凝集试验 伤寒和副伤寒（肥达试验）、立克次体（外伤寒和副伤寒（肥达试验）、立克次体（外 斐试验）、钩端螺旋体（显微凝集试验）斐试验）、钩端螺旋体（显微凝集试验） 乳胶凝集试验乳胶凝集试验 检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等抗体检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等抗体 沉淀试验沉淀试验 梅毒（梅毒（ VDRL、 RPR试验）试验） 补体结合试验补体结合试验 检测检测 Q热柯克斯体等抗体热柯克斯体等抗体 中和试验中和试验 风湿热（抗风湿热（抗 O试验）试验） ELISA 广泛用于病原体的诊断和流行病学调查广泛用于病原体的诊断和流行病学调查 23 24 病毒感染的微生物学检查法病毒感染的微生物学检查法 24 临床感染常见病原体检查临床感染常见病原体检查 n 真菌感染真菌感染 (fungi infection) 1.直接检查：孢子与菌丝直接检查：孢子与菌丝 2.分离培养分离培养 3.血清学检测血清学检测 4.分子生物学检查分子生物学检查 25 G试验试验 n (1-3)-D-葡聚糖葡聚糖 是真菌的重要组成成份是真菌的重要组成成份 , 广泛存在于广泛存在于 除接合菌之外的真菌细胞壁中除接合菌之外的真菌细胞壁中 ,占真菌细胞壁成分的占真菌细胞壁成分的 50% 以上。深部真菌感染时以上。深部真菌感染时 ,(1-3)-D-葡聚糖可从胞葡聚糖可从胞 壁中释放出来壁中释放出来 ,进入血液及其他体液中进入血液及其他体液中 ,即可以检测到即可以检测到 其中的其中的 (1-3)-D-葡聚糖水平异常升高。而浅表真菌葡聚糖水平异常升高。而浅表真菌 感染或真菌定植时血清感染或真菌定植时血清 (1-3)-D-葡聚糖则常不会升葡聚糖则常不会升 高。通过对血清中高。通过对血清中 (1-3) -D-葡聚糖的检测葡聚糖的检测 ,发现其对发现其对 系统性真菌感染系统性真菌感染 的诊断有重要价值的诊断有重要价值 ,为早期快速确诊为早期快速确诊 深部真菌感染提供有力证据。深部真菌感染提供有力证据。 n 含量大于含量大于 50pg/ml判为阳性判为阳性 26 GM试验试验 n GM试验试验 检测的是检测的是 半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖 ， 曲霉菌曲霉菌 特有的细胞壁多糖特有的细胞壁多糖 成分是成分是 （ 1-5）呋喃半乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚）呋喃半乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚 糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的 抗原抗原 。 GM释放量释放量 与菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测与菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测 GM可作为治可作为治 疗疗效的监测。疗疗效的监测。 n 以下情况可出现以下情况可出现 假阳性假阳性 ： 已使用半合成青霉素尤其是哌拉已使用半合成青霉素尤其是哌拉 西林西林 /他唑巴坦；他唑巴坦； 新生儿和儿童；新生儿和儿童； 血液透析；血液透析； 自身免疫自身免疫 性肝炎等；性肝炎等； 食用可能含有食用可能含有 GM的牛奶等高蛋白食物和污染的牛奶等高蛋白食物和污染 的大米等。的大米等。 n 以下情况可出现以下情况可出现 假阴性假阴性 ： 释放入血循环中的曲霉释放入血循环中的曲霉 GM（包（包 括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除； 以前使用了以前使用了 抗真菌药物；抗真菌药物； 病情不严重；病情不严重； 非粒细胞缺乏的患者。非粒细胞缺乏的患者。 n 阳性：阳性： 0.5 27 临床感染常见病原体检查临床感染常见病原体检查 n 其他病原体感染：其他病原体感染： 1.支原体检测：分离培养和分子生物学技术支原体检测：分离培养和分子生物学技术 2.螺旋体检测：暗视野显微镜检、血清学检测螺旋体检测：暗视野显微镜检、血清学检测 3.立克次体检测立克次体检测 4.衣原体检测：分离培养衣原体检测：分离培养 5.原虫检测原虫检测 螺旋体 28 四 . 检测结果的正确解读 29 1.细菌培养的意义 培养阳性 感染 排除污染 排除定植 任何结果都必须结合临床症状及其它相 关检查进行综合分析 30 培养阴性 排除感染 n 标本采集部位和方法 n 是否在使用抗菌药物时留取的标本？ n 标本运送时间和方法是否正确 n 标本接种、培养基及培养方法的选择是否正确 n 是否可能是厌氧菌或其它难培养的细菌感染 细菌培养的意义 31 32 当前血培养存在的问题当前血培养存在的问题 采样时污染严重采样时污染严重 培养一次阴性作为诊断依据培养一次阴性作为诊断依据 血液与培养基比例不正确血液与培养基比例不正确 采样时间不正确采样时间不正确 少做厌氧培养少做厌氧培养 不能及时报告不能及时报告 国际上仍然公认国际上仍然公认 血培养是诊断血流感染的金标准！血培养是诊断血流感染的金标准！ 33 痰培养阳性结果分析痰培养阳性结果分析 常见有三种情况常见有三种情况 u 第一种情况：第一种情况： 患者有典型的呼吸道感染症状，患者有典型的呼吸道感染症状， 按细菌药敏报告选抗菌药物疗效明显按细菌药敏报告选抗菌药物疗效明显 这类患者的痰标本共同特征：痰涂片革兰染色这类患者的痰标本共同特征：痰涂片革兰染色 : 见大量的白细胞，并见白细胞吞噬或伴行大量形见大量的白细胞，并见白细胞吞噬或伴行大量形 态一致的非上呼吸道正常菌；痰培养：生长大量态一致的非上呼吸道正常菌；痰培养：生长大量 非上呼吸道正常菌，痰培养与痰涂片所见一致非上呼吸道正常菌，痰培养与痰涂片所见一致 结论：报告的细菌为病原菌。结论：报告的细菌为病原菌。 34 痰培养阳性结果分析痰培养阳性结果分析 u 第二种情况：第二种情况： 患者有典型的呼吸道感染症状，按患者有典型的呼吸道感染症状，按 细菌报告选用的抗菌药物治疗无效，改为凭经验细菌报告选用的抗菌药物治疗无效，改为凭经验 联合用药联合用药 这类患者痰细菌检验时有如下特征：痰涂片：大这类患者痰细菌检验时有如下特征：痰涂片：大 量白细胞，吞噬或伴行的是革兰阳性球菌（形似量白细胞，吞噬或伴行的是革兰阳性球菌（形似 葡萄球菌）、革兰染色阴阳不定的小球菌或杆菌葡萄球菌）、革兰染色阴阳不定的小球菌或杆菌 （形似厌氧菌）、出芽的念珠菌，偶见革兰阴性（形似厌氧菌）、出芽的念珠菌，偶见革兰阴性 杆菌；痰培养：生长大量阴性杆菌，痰涂片所见杆菌；痰培养：生长大量阴性杆菌，痰涂片所见 的大量细菌不生长或少量生长，痰涂片镜检与痰的大量细菌不生长或少量生长，痰涂片镜检与痰 培养结果不一致。培养结果不一致。 结论：报告的细菌为定植菌结论：报告的细菌为定植菌 35 痰培养阳性结果分析痰培养阳性结果分析 u 第三种情况：第三种情况： 患者的感染已基本治愈，做痰检的目患者的感染已基本治愈，做痰检的目 的是希望得到一张阴性报告作为停止治疗、出院的的是希望得到一张阴性报告作为停止治疗、出院的 凭证凭证 这类患者的痰做细菌检验时的特征：这类患者的痰做细菌检验时的特征： 痰涂片：显示标本来自上呼吸道痰涂片：显示标本来自上呼吸道 ,大量上皮细胞大量上皮细胞 , 大量阴性杆菌，少量白细胞。大量阴性杆菌，少量白细胞。 痰培养：生长大量阴性杆菌，较常见的是绿脓杆痰培养：生长大量阴性杆菌，较常见的是绿脓杆 菌和不动杆菌菌和不动杆菌 结论：报告的细菌为定植菌。结论：报告的细菌为定植菌。 36 痰标本涂片检查痰标本涂片检查 合格痰液标本 鳞状上皮 25个 /低倍视野 不合格痰液标本 大量鳞状上皮细胞 未见吞噬细胞 37 38 细菌分离培养与鉴定的结果评价细菌分离培养与鉴定的结果评价 正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考 虑细菌为感染的病原体。虑细菌为感染的病原体。 存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合 细菌的量考虑是否为致病菌。细菌的量考虑是否为致病菌。 如临床表现支持感染，但培养阴性，应考如临床表现支持感染，但培养阴性，应考 虑为标本不合格、培养不恰当等因素。虑为标本不合格、培养不恰当等因素。 直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考 虑有虑有 L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。 39 2.病毒分离培养与鉴定的意义病毒分离培养与鉴定的意义 必须结合流行病学资料、临床表现、标本来必须结合流行病学资料、临床表现、标本来 源及病毒种类加以分析。源及病毒种类加以分析。 从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明 确诊断。确诊断。 从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人 体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒 、流感病毒等。反之需相应的临床表现，才、流感病毒