热激蛋白基因克隆

编码： 河西学院大学生科技创新 申报书 项目类别 自然科学类 项目名称 热激蛋白基因（HmHSP70）克隆 项目负责人 曹新文 项目合作者 秦海红、段东东、冯兴华、姚晓琴 学院、班级 农业与生物技术学院生物科学 101 班 负责人联系方式指导教师 梁倩倩 起止年限 2013 年 1 月2013 年 12 月 申报日期 2012 年 11 月 20 日 结项日期 2013 年 12 月 30 日 是否重点项目 资助金额（大写） 2 共青团河西学院委员会制 二一二年十一月五日 申报者情况（集体项目） 姓 名 曹新文 性别 男 出生年月 1991-6-7 学院班级 农生院生科 101 现学历 本科 专 业 生物科学 年级 10级 学制 四 作品全称 热激蛋白基因（HmHSP70）克隆 邮政编码 734000 申报者 情况 通讯地址 农业与生物技术学 院生物科学 101 移动电话姓名 性别 学历 所在学院班级 联系方式 段东东 男 本科 农生院生科 101冯兴华 男 本科 农生院生科 101姚晓琴 女 本科 农生院生科 101合作者 情况 秦海红 女 本科 农生院生科 101资 格 认 定 教学学院 意见 作者是否为 2012年 9月 1日前正式注册在校学 生。 是 否 若是，其学号为： 部门盖章： 年 月 日 3 指导教师意见 本作品是否为学生自已的真实作品。 是 否 指导教师签名： 年 月 日 一、立项依据 包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处。 研究意义： 高温常常限制作物、蔬菜、食用菌等的生长和推广，获得温度耐受性强的转基因新 品种，解除温度限制，将大大降低推广栽培的成本，热激蛋白（HSPs） ，又称热休克蛋 白，是细胞或生物体在一定时间（几小时、几分钟、甚至几秒钟）内遭受高于其正常生 长温度 812以上的温度时，新合成的或含量增高的一类在生物进化中最保守并由热 激基因所编码的伴随细胞蛋白，因此又被称为“分子伴侣” 。作为“分子伴侣” ，HSPs 可以与正在合成的多肽结合，使其正确折叠，能够引导新生肽穿过细胞器膜结构，使蛋 白定位于细胞的不同部位；在高温胁迫下，可以阻止热变性蛋白的聚集或阻止不可逆蛋 白变性，对蛋白质在高温胁迫变性之后的复性也有一定作用，因此，热激蛋白在生物抗 高温中的作用不言而喻。Edwards 等研究发现，许多细胞的耐热能力取决于细胞内热激 蛋白 70（HSP70）的合成， HSP70 为 HSP 中最保守、最重要的一族，其在大多数生物 中含量最多，在应激反应中最为敏感，因此成为 HSP 中最受关注、研究最深入的一种。 目前，人们对植物和动物体内热激蛋白已有较深刻的认识，但关于微生物热激蛋白却鲜 有报道。因此本研究拟采用 PT-PCR技术克隆荷叶离褶伞 HSP70全长基因，构建克隆载体， 为真菌热激蛋白研究及真菌的分子育种奠定良好的基础；为下步的分子育种工作构建耐 高温食用菌菌株做基础使食用菌过量表达热激蛋白 70基因，提高食用菌的耐受性， 应对生产过程中气温的突然变化，解除温度对食用菌栽培生产的限制，为获得较高的生 物学效率奠定了基础。 本研究预期目标若能实现，对建立食用菌基因工程研究平台具有较好的现实意义， 我们将为我国食用菌行业增添一个新的珍稀品种，为甘肃食用菌产业的发展培育出一个 4 新的增长点和新的支撑点，产生显著经济效益。 国内外现状研究分析： 热激蛋白(heat shock protein, HSP)是一类能对外界环境刺激做出应答反应并能有 效提高生物体对恶劣环境适应能力分子伴侣类型的应激蛋白。首次克隆的热激蛋白是从 热激果蝇幼虫唾液腺中分离获得(Tissere et al., 1974)。根据分子量的不同，可将热 激蛋白分为6 个家族，即 HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、分子植物育种Molecular Plant Breeding小分子 sHSP 和泛素(Carper et al., 1987)。研究发现属于分子伴侣类 型的蛋白家族能够在环境胁迫时防止未折叠蛋白变性和促进变性蛋白溶解复性 (Sheffieldet al., 1990)。因此，作为分子伴侣家族组成部分的热激蛋白等在生物体抗 逆代谢反应中发挥关键作用。在对热激蛋白家族成员研究中，HSP70 家族目前最受关注。 在真核生物体内，编码 HSP70 蛋白的基因家族高度保守 (Gupta and Golding, 1993; Boorstein et al.,1994)，这类蛋白主要参与细胞内多种蛋白质合成后加工和构象改变 过程。研究发现，在动物体内，HSP70家族参与多种调控过程，如细胞凋亡、免疫防护反 应、参与肿瘤形成及转移和变形蛋白修复等(杨秉芬等, 2009; Vega et al., 2008)。 HSP70 在植物不同发育阶断基因表达调控和多种代谢过程也发挥重要作用，其表达水平 受外界环境条件影响，如受高温胁迫后成熟小麦种子与未经胁迫处理的对照相比，HSP70 表达量增加 35%-140% (赵强 , 1998, 麦类作物学报 ,18(6): 32-36)；而拟南芥幼苗在生 长温度发生急剧变化条件下(从 12上升到 27)，HSP70 家族基因的表达水平迅速增 加，这说明编码 HSP70基因表达水平极易受温度变化影响(KumarandWigge,2010)；Cho 和 Hong (2006)发现超量表达 NtHSP70-1 能提高转基因烟草植株抗旱能力，由此可以说 明 HSP70 家族蛋白参与植物抗逆调控过程。研究发现，HSP70 蛋白不但在植物抗逆过程 中发挥重要作用，在植物抗病方面也具有重要影响。Kanzakl 等(2003)利用基因沉默技 术发现 NbHsp70c-1 参与了对假单胞杆菌侵染时烟草叶片过敏性坏死斑产生过程。截至 目前为止，已从玉米(Rochesteretal.,1986)、拟南芥(Sunget al., 2001a)、小 麦(Duan et al., 2011)、番茄、紫茎泽兰(肖艳萍等,2010)、绿豆、菠菜(Guy and Li, 1998)等植物克隆到 HSP70基因，如从拟南芥中分离得到 14 个 HSP70基因，细胞质蛋 白 5 个、内质网蛋白 3 个、2 个质体间质蛋白和 2 个线粒体蛋白(Sung et al., 2001a)，从菠菜基因组分离到 12 热激蛋白 HSP70 基因(Guy and Li,1998)，但仅报道 了 1 个普通小麦 HSP70 蛋白基因，综合拟南芥和菠菜中分离到的 HSP70 蛋白数量分 5 析，发现小麦基因组中的 HSP70 蛋白基因还有待于进一步挖掘（安艳秋，小麦热激蛋白 基因 TaHSP70克隆及其在植物防卫和抗逆反应中的表达分析. 2011） 。 利用蛋白质电泳、基因克隆和荧光定量 PCR等技术对耐高温木霉 REMI转化体的抗逆 机理进行了初步研究。结果表明,耐高温木霉 REMI转化体的蛋白质谱带明显多于出发菌 株 T21,且差异主要集中在 Rf值大于 0.593的区域,该区域主要是小分子的热休克蛋白, 说明影响耐高温木霉 REMI转化体对温度耐受性的蛋白主要以小分子量蛋白质为主。对其 中一种热休克蛋白 HSP24的基因进行克隆、测序,结果表明不同木霉 REMI转化体和 出发菌株 T21间该基因序列没有差异,但经荧光定量 PCR对 HSP24基因转录检测表明,耐 高温木霉 REMI转化体的热激蛋白 HSP24的表达量有所增加,从而表明 REMI插入提高了该 基因的转录水平（刘限，沈阳农业大学生物科学技术学院，2010） 。 为深入探讨水稻对逆境的反应机理并寻找新的植物耐逆基因,采用 Affymetrix水稻 表达芯片(含 51279个转录本)分析了培矮 64S全基因组在不同逆境(高温、干旱、低温) 胁迫下、不同生育时期叶片和穗中的表达谱,从中筛选出一个受多种逆境诱导表达的基因 OsMsr3 (Oryza sativaL.multiple stresses responsive gene3,GenBank登陆号为 FJ383169)。定量实时 PCR分析结果进一步证实了此基因在逆境条件下的诱导表达模式。 用 RT-PCR方法扩增获得了包含其完整开放阅读框的 cDNA克隆,序列分析表明,其 ORF大 小为 480 bp,编码一个具有 160个氨基酸残基的低分子量热激蛋白,推测分子量约为 18.0 kD;PI约为 6.8。对其编码的蛋白质进行分析,发现其羧基端存在一个 HSP20的蛋白保守 结构域,与其他植物中的低分子量热激蛋白的相似性介于 33.7% -97.5%。对其可能的启动 子序列分析,发现 6类与逆境反应有关的顺式作用元件。推测该基因在逆境反应中起着重 要的作用,进一步的研究正在进行中（崔延春, 2009） 。 以拟南芥为材料,对热激蛋白 HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克 隆实验体系.首先提取拟南芥总 DNA,接着在热激蛋白 HSP70编码区设计引物,扩增出 HSP70编码区的片断,再将 HSP70编码区的片断加上具有 EcoR I酶切位点双链的人工接 头,通过 EcoR I对其进行酶切.再与经过 EcoR I酶切并已经去磷酸化的 PUC19载体通过 T4连接酶进行连接,然后将连接产物置入到感受态大肠杆菌细胞中(即转化),并让这种细 胞在含有 Amp+/IPTG/X-Gal的 LB培养基上生长.挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒 DNA提取,通过酶切质粒 DNA,从而初步判断目的片段已被克隆(郭丽红,2009)。 为了进一步阐明 HSFA2功能,现采用 Trizol法分离拟南芥叶片总 RNA,用 RT-PCR方 6 法得到拟南芥 HSFA2基因,经过连接、转化和蛋白诱导对其进行了原核表达研究。结果 表明:从拟南芥叶片中分离到了高质量的总 RNA,进而扩增到了目的基因,将其连入表达载 体 PGEX-KG,且转入大肠杆菌 BL21中。不同温度条件下的诱导结果表明,16下蛋白诱导 效果较好（王瑾瑜，2010） 。 从嗜热古菌 Sulfolobus solfataricus中克隆一种新的小热激蛋白 SsHsp14. 1的基 因,并研究其表达和生物活性。方法:用 PCR技术以 S. solfataricus基因组为模板扩增 得到目的基因序列片段,并将其克隆到 pET-28a(+)中,转化到 E coliBL21(DE3)中经 IPTG 诱导表达,纯化后对产物进行生物活性测定。结果:从菌株 S. solfataricus中克隆出目 的基因,该基因的编码框由 375个碱基组成，编码的蛋白质由 124个氨基酸组成。含该质 粒的大肠杆菌经诱导表达了一个与预期理论值相符的约 14kDa的蛋白，利用亲和层析和 凝胶柱分离纯化了重组蛋白。试验证明纯化后的重组 SsHsp14. 1具有分子伴侣活性,重 组蛋白在体内表达时能提高 E. coli细胞的耐热性。结论:成功克隆 SsHsp14. 1基因并 表达出蛋白,并明确了其分子伴侣活性,为该热激蛋白的研究和应用奠定基础(徐迅， 2010)。 Edwards等研究发现，许多细胞的耐热能力取决于细胞内热激蛋白 70（HSP70）的合 成，HSP70 具有热保护作用。目前，人们对植物和动物体内热激蛋白已有较深刻的认识， 关于微生物热激蛋白鲜有报道，而关于荷叶离褶伞的热激蛋白尚未见报道。本研究采用 RT-PCR技术克隆荷叶离褶伞 HSP70全长基因，构建 HSP70全长基因的 gpd启动子驱动的 真菌表达载体。 真菌遗传转化方面的研究已取得重大进展，但仍存在很多问题。原生质体转化法是 丝状真菌转化的传统方法，但过程繁琐且转化率低。根癌农杆菌介导法(ATMT)是进行植 物遗传转化的标准方法，研究发现，该方法可以转化细菌、真菌。本研究拟通过传统的 原生质体法和 ATMT法将克隆到的编码基因导入荷叶离褶伞中进行表达，比较研究真菌的 遗传转化体系。 参考文献： 1 安艳秋,蔺瑞明,冯晶王凤涛 ,徐世昌,许玉凤 . 小麦热激蛋白基因TaHSP70克隆及其在 植物防卫和抗逆反应中的表达分析J. 生物工程学报,2011, l9(4)402-409. 2 刘 限, 赵 岩, 郭培磊, 高增贵, 庄敬华. 木霉REMI转化体耐热机理的初步研究A.沈 阳农业大学生物科学技术学院 .2010.03.012. 7 3 陈友华,张春霞 .极端嗜热古菌的热休克蛋白J.生物工程学报,2008,24(12):2011-2021. 4 黄彩虹,杨谦,刘志华.哈茨木霉Thi4基因的克隆与序列分析J.北方园艺,2009(1):92- 95. 5 Athanasios S S, Sevasti K, Georgia G, et al. Diuron biodegra-dation in activated sludge batch reactors under aerobic and anoxic conditions J . Water Research, 2009, 43 (5):1471- 1479. 6 崔延春, 徐孟亮,李落叶,王曼玲,徐国云,夏新界. 一个水稻多逆境响应基因OsMsr3克隆 与表达分析 J . 2009, 27(6): 574-581. 7 郭丽红,杨晓虹,刘开庆 ,袁 燕. 拟南芥热激蛋白 HSP70基因片段克隆实验体系的建立 J . 2009,31(6): 46-48. 8 王瑾瑜,任亚萍 . 拟南芥热激转录因子HSFA2基因克隆与原核表达A. 2010(8):157-159. 9 徐迅,王永华. 嗜热古菌S. solfataricus小热激蛋白基因的克隆及表达A. 2010,01-0009- 04. 二、研究内容 1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题。 研究目标： （1）克隆姬菇的 HmHSP70 基因到荷叶离褶伞的 cDNA； （2）构建 HmHSP70 克隆载体；注册 GENEBANK； （3）省级以上期刊发表研究论文 1 篇。 研究内容： （1） 提取姬菇、荷叶离褶伞的 DNA、RNA； （2） 采用 PCR 或 RT-PCR 技术克隆 HmHSP70 基因； （3） 构建 HmHSP70 克隆载体； （4） 测序及序列分析； （5） 注册 GENEBANK 拟解决的关键问题 荷叶离褶伞为祁连山低温型优良食用菌，由于甘肃河西地区日夜温差大，夏天高温 可达 35，本项目预期指标的实现，可望获得温度耐受性强的转基因荷叶离褶伞新品种， 解除温度对荷叶离褶伞栽培及推广的限制，大大降低了推广栽培的成本。 8 2.拟采取的研究方案及技术路线。 研究方案： 1 材料和方法 1.1 材料 姬菇、荷叶离褶伞菌丝体，由河西学院食用菌研究所提供。pART27 载体、E.coli K12 菌株由梁倩倩老师保存提供。 1.2 方法 1.2.1 RNA 提取 取 0.10.2 g 菌丝体，置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状， TrizolRNA 提取试剂盒 提取总 RNA，用 1.0%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性和质量。 1.2.2 取 0.1-0.2 g 菌丝体，置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状，CTAB 法提取 DNA。 1.2.3 基因克隆与序列分析 引物设计根据 GenBank 中 HmHSP70 序列(AF108432)，利用软件 Olig 6.0 设计，由 北京三博远志生物技术有限责任公司合成特异性引物 1 ( 5- GAAAAATGGAGAGTAATGGTG-3) 和 2(5-ACCATCTATAATTGATGTTTCA-3)。 PCR 扩增条件为 94预变性 1 min;94变性 1min，52退火 45 s,72延伸 1 min,循环 30 次,72终延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒 回收预期大小片段与 Promega 公司的载体 pGEM-T Easy vector 连接，经 PCR 检测及限制 性内切酶酶切初步确认的阳性克隆进行测序。 1.2.4 载体构建 酶切回收 HSP70 片段，连接表达载体 pART27. 技术路线 姬菇、荷叶离褶伞 DNA 提 取 RNA 提取 引物设计合成 PCR 扩增 HSP70 基因片段 克隆载体扩建 测序 表达载体构建 9 3.本项目的特色与创新之处 （1）目前以基