小麦胚芽清蛋白提取工艺及分子量测定 硕士论文.doc

小麦胚芽清蛋白提取工艺及分子量测定摘要：小麦胚芽清蛋白是一种优质蛋白质，为了充分开发利用小麦胚芽资源，通过单因素试验和正交试验对清蛋白提取工艺进行了研究，得到最佳提取条件为粉碎粒度0.125mm，提取温度30，提取时间30min，提取料液比111，此条件下提取清蛋白占麦胚蛋白29.2%。清蛋白sds-page凝胶电泳包含7条条带，分子量分别为20.89、28.84、38.02、43.65、51.29、60.26、72.44ku.此方法实现了对小麦胚芽清蛋白最大程度的提取。关键词：小麦胚芽,清蛋白,提取率,电泳extraction technique of wheat germ albumin and determination of molecular weightdiao da-peng1,huang ji-hong1,2*,li jin3,hou yin-chen2(1.he,nan university of technology,zhengzhou 450001,china 2. he,nan province food industry research institution,zhengzhou 450000, china 3.henan caixin company.dancheng 477150,china)abstract: wheat germ albumin is a nice protein. to develop wheat germ deeply, the experiment research its extraction technique by single-factor experiment and orthogonal experiment .the optimal extraction condition is mesh number 0.125mm,temperature 30,time 30min, solid-liquid ratio(g/ml) 111. in this condition,the ratio of extracted wheat germ albumin in wheat germ protein is 29.2%. sds-page electrophoresis of albumin contains seven bands. molecular weights are20.89、28.84、38.02、43.65、51.29、60.26、72.44ku.by this way, wheat germ albumin is extracted sufficiently.keywords:wheat germ；albumin；extraction efficiency；electrophoresis小麦胚芽占小麦籽粒的23，是小麦的生命源泉，是整个麦粒营养价值最高的部分1，被营养学家誉为“人类天然的营养宝库”2-3。麦胚中的总蛋白含量高达30左右，是一种完全蛋白，它含有人体必需的8种氨基酸4,5，占总氨基酸的34.746，而且必需氨基酸的相互比值与fao/who颁布的模式基本接近7,8。小麦胚芽各种蛋白质中，清蛋白评分最高，具有最高的蛋白质效率比(per)、体外消化率(ivpd)和较好的氨基酸组成，是一种优质蛋白质9,10。小麦胚芽虽然具有高的营养价值，但因其高色泽和脂肪酶含量，混入面粉会降低面粉白度，不利于面粉贮藏，在制粉中被去除掉11,12，造成了资源的严重浪费。为充分地开发利用小麦胚芽清蛋白资源，朱科学、纪莹优化了清蛋白提取ph、料水比、温度、时间13，周惠明研究了水溶性蛋白中的糖蛋白性质14-15。本文对小麦胚芽清蛋白提取时的粉碎粒度、料水比、温度、时间进行了研究，并在此基础上制得蛋白含量较高的清蛋白粗粉及精粉，通过sds-page凝胶电泳测定了组成清蛋白亚基分子量，为进一步开发清蛋白提供了参考。1 材料与方法1.1 实验材料与实验器材新鲜小麦胚芽 河南财鑫集团第二制糖厂;bm523蛋白电泳marker 生工生物工程有限公司；硫酸铵、冰乙酸、氯化钠、tris、acr、bis、sds、temed、甘氨酸、过硫酸铵、蔗糖、巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝、甲醇。thz-100b摇床 上海-恒科学仪器有限公司；l-55台式低速大容量离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；xy-200型高速多功能粉碎机 浙江省永康市松青五金工具厂；反渗透膜系统 福建赛普特膜技术有限公司；dyy-iii型电泳槽和dyy-iii2稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂；23-10箱式电阻炉 北京市永光明医疗仪器厂；lgj-10 台式冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；索氏提取仪、凯氏定氮仪。1.2 实验方法1.2.1 水分含量测定 按gb 5009.3-20101.2.2 灰分测定 按gb 5009.4-20101.2.3 蛋白质含量测定及提取率计算 蛋白质含量测定 按gb5009.5-2010 蛋白质提取率=提取液中蛋白质含量/小麦胚芽中蛋白含量 1.2.4 油脂含量测定 按gb/t10359-20081.2.5 小麦胚芽灭酶:小麦胚芽放于80烘箱10min灭酶。1.2.6 小麦胚芽脱脂:小麦胚芽粉碎粒度至0.42mm，放入玻璃容器中，按料液比11加入正己烷，保鲜膜封口，浸提4小时，每30min搅拌一次。浸提结束，进行抽滤。抽滤后液体部分蒸发溶剂提油，脱脂麦胚平铺白色瓷盘，放入通风厨内脱溶12小时备用。1.2.7 清蛋白提取实验粉碎粒度对提取率影响：将脱脂麦胚粉（粉碎粒度0.42mm）继续粉碎至粒度0.178、0.125、0.096、0.074mm,按111料液比分别装入500ml三角瓶，调ph7.0。每个三角瓶装胚芽干基40g蒸馏水280ml，于30摇床100r/min提取30min，迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量,，计算提取率。温度对提取率影响：取粒度为0.074mm小麦胚芽粉，按111料液比分别装入500ml三角瓶，调ph7.0。每个三角瓶装胚芽干基40g,加蒸馏水280ml，于10,20,30,40,50摇床100r/min提取30min，迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量，计算提取率。提取时间对提取率影响：取粒度为0.074mm小麦胚芽粉，按111料液比分别装入500ml三角瓶，调ph7.0。每个三角瓶装胚芽干基40g,加蒸馏水280ml，提取温度30，摇床100r/min，分别提取10,20,30,40,50min，迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量，计算提取率。提取料液比对提取率影响：取粒度为0.074mm小麦胚芽粉，按17、19、111、113、115料液比分别装入500ml三角瓶，调ph7.0。每个三角瓶装胚芽干基40g,，加蒸馏水280ml，提取温度30，摇床100r/min,提取30min,迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量，计算提取率。1.2.8 正交实验：以粉碎粒度，提取温度，提取时间，提取料液比四因素，设计4因素3水平正交实验。因素与水平见表1：表1 小麦胚芽清蛋白提取工艺正交实验因素与水平表table 1 factors and level table of orthogonal experimental of wheat germ albumin extraction technology水平a粒度/mmb温度/c时间/mind料液比10.12510101:720.09620201:930.07430301:111.2.9 清蛋白粉制作：将清蛋白提取液进一步加工可得两种蛋白含量不同的清蛋白粉：反渗透膜脱盐至5%以下，喷雾干燥，得到清蛋白粗粉；加入一定量硫酸铵，配成硫酸铵饱和溶液，沉淀出清蛋白，4000r/min离心10min后，取沉淀，将沉淀在水中溶解后，用反渗透膜脱盐至5%以下，得到清蛋白浓缩液，冷冻干燥得清蛋白精粉。1.2.10 清蛋白电泳：对清蛋白提取液进行sds-page凝胶电泳分析，确定其分子量。2 实验结果与分析2.1 新鲜小麦胚芽灭酶脱脂前后成分见表2表2 小麦胚芽成分table 2 composition of wheat germ成分水分含量灰分含量油脂含量蛋白含量脱脂前含量10.2%4.1%10%30.5%脱脂后含量11.2%4.5%1.2%33.2%2.2 不同粒度对小麦胚芽蛋白提取率的影响由提取率与粒度曲线图1知，随麦胚粉碎粒度减小，清蛋白提取率增加，是由于粉碎粒度越小，比表面积越大，清蛋白浸出越充分。粒度由0.125mm增大到0.42mm时，提取率下降明显，而由0.074mm增大到0.125mm时，提取率下降不明显。因为粉碎粒度越小，能耗越大，因此选取的粉碎粒度为0.125mm。图1 粒度对提取率影响fig.1 inflance of grain size to extraction ratio2.3 不同温度对提取率影响由图2知提取温度从10升至30过程中，提取率显著增加。温度由30继续升高，提取率急剧下降，是因为超过30，接近了清蛋白变性温度，部分清蛋白变性沉淀而留于滤渣中。因此宜选取提取温度30。图2 提取温度对提取率影响fig.2 inflance of temprature to extraction ratio2.4 提取时间对提取率的影响图3 提取时间对提取率影响fig.3 inflance of time to extraction ratio由图3可知，前30min内，延长提取时间延长，蛋白提取率明显增加，超过30min,，提取时间继续延长，提取率几乎不变。节约时间起见，宜选取提取时间为30min。2.5 料液比对提取率的影响由图4知，料液比由17到111过程中，清蛋白提取率增加明显。料液比继续增加，提取率增加不明显，逐渐保持不变。为节水起见，宜选用料液比111图4 提取料液比对提取率影响fig.4 inflance of solid-liquid ratio to extraction ratio2.6 正交实验设计根据表1因素与水平设计l9(34)正交表及实验数据如下：表3 小麦胚芽清蛋白提取工艺正交实验结果table 3 orthogonal experimental results of wheat germ albumin extraction technology试验号abcd提取率/%1111122.12122226.63133329.24212326.45223126.86231226.37313226.58321326.79332128.2k178.075.07577.1k279.580.181.379.5k381.383.782.582.2k126.025.025.025.7k226.526.727.126.5k327.127.927.527.4r1.7粒度/mm 温度/ 时间/h 料液比图5 小麦胚芽清蛋白提取正交实验直观图fig.5 visualized diagram of orthogonal experimental of wheat germ albumin extraction technology由正交实验表2和极差直观图5知，对清蛋白提取影响由大到小各因素排序为温度时间料液比粒度。由于粉碎粒度对提取率影响与其它三项相比不明显，且增加粉碎粒度需增加能耗和时间，因此粉碎粒度选择0.125mm。综合以上结果得到清蛋白提取的最佳因素配比为麦胚粉碎粒度0.125mm，提取温度30，提取时间30min，提取料液比111，提取率可达29.2%。2.7 清蛋白粗粉1kg脱脂小麦胚芽制得清蛋白粗粉290g,其中蛋白含量37%。其它成分大多为可溶性糖。2.8 清蛋白精粉1kg脱脂小麦胚芽制得清蛋白精粉148.5g,其中蛋白含量高达72%。蛋白中包含30%糖蛋白，糖蛋白含糖基占糖蛋白总重的43%。2.9 清蛋白sds-page电泳 清蛋白 marker图6 清蛋白sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳图fig.6 albumin sds-page polyacrylamide gel electrophoresis figure图7 清蛋白sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量对数与相对迁移率曲线图fig.7 sds electrophoretic relative molecular mass of the logarithmic and relative migration rate curve fractions表4 sds-page标准曲线数据表table 4 sds-page standard curve data tablemarker /ku14.43142.766.297.4分子量对数1.1581.491.631.8211.989相对迁移率/mm2749586573注：条带由下至上排列表5 sds-page清蛋白分子量表table 5 sds-page albumin molecular weight table相对迁移率/mm21293844516072分子量对数1.321.461.581.641.711.781.86分子量/ku20.8928.8438.0243.6551.2960.2672.44注：条带由下至上排列由sds-page电泳图6可知，清蛋白共呈现7条谱带。由蛋白marker分子量对数与相对迁移率（此处相对迁移率指电泳谱带到电泳前沿的距离，清蛋白谱带相对迁移率与之相同）数据表4作标准曲线图7，得分子量对数与相对迁移率关系式y=0.0179x+0.6441,，r2=0.9846。将清蛋白条带相对迁移率带入公式，得到清蛋白分子量对数，进而得到清蛋白分子量见表5。清蛋白7条谱带分子量由小到大排列分别为20.89、28.84、38.02、43.65、51.29、60.26、72.44ku。3 结论通过单因素试验和正交试验优化了小麦胚芽清蛋白提取最佳工艺条件，即粉碎粒度0.125mm。提取温度30min，提取时间30min，提取料液比111。此条件下清蛋白提取率达29.2%。将清蛋白提取液纯化喷雾干燥得清蛋白粗粉，清蛋白含量37%；对清蛋白提取液进一步提取纯化后真空冷冻干燥得清蛋白精粉，清蛋白含量72%。通过对清蛋白提取液进行sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳得到7条谱带，分子量由小到大分别为7.31、9.2、19.23、27.79、33.41、52.95、83.93ku。 参考文献：1 amado r,arrigoni e.nutritive and functional properties of wheat germj.international food ingredients,1992,(4):30-35.2曲艺,王晓曦,雷宏.小麦胚芽及其脂类和蛋白质的研究现状j.粮食流通技术,2009,(1):31-35.3carlo giuseppe rizzello, luana nionelli, rossana coda. effect of sourdough fermentation on stabilization and chemical and nutritional characteristics of wheat germj.food chemistry,2010,119(3):1079-1089.4chen yun-hui, wang zhang, xu shi-ying. antioxidant properties of wheat germ proteins hydrolysates evaluated in vitroj.journal of central south university of technology,2006,13(2):141-148. 5樊永华.小麦胚芽蛋白制备及应用j.粮食与油脂,2008,(11):11-13.6zhu ke-xue,zhou hui-ming,qian hai-feng.comparative study of the chemical composition and physiochemical properties of defatted wheat germ flour and its protein isolatej.journal of food biochemistry,2006,30(3)