应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件_食品科学与工程毕业论文.doc

应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件目 录前言- 2 -1 材料与方法- 4 -1.1材料- 4 -1.2仪器设备- 4 -1.3试验方法- 4 -1.3.1发酵条件优化- 4 -1.3.2验证试验- 5 -2 结果与讨论- 6 -2.1产酶条件优化- 6 -2.2五元二次回归方程的建立及检验- 7 -2.3试验因子间交互作用分析- 7 -2.4发酵条件的优化及验证- 9 -3 结论- 9 -参考文献- 10 -abstract- 11 -致谢- 11 -应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件摘要：本试验通过五元二次回归正交旋转组合设计对果胶酶的发酵条件进行了优化，并建立了其产酶性能优化条件的数学回归模型。试验结果表明：碳源与发酵培养基初始ph，碳源与温度，表面活性剂与温度的互作效应对菌株产酶效果影响显著。菌株的最适发酵碳源浓度1.434%；发酵氮源浓度0.6%；表面活性剂浓度0.01%；发酵初始ph4.03；发酵温度41.3，在此条件下菌株产酶活性可以达到11174 u/ml。关键词：果胶酶 正交旋转组合 发酵条件优化前言 果胶质(pecticsubstance)是植物产生的结构性多糖，广泛存在于高等植物的组织中，尤其是水果和蔬菜组织的细胞间质和细胞初生壁中。果胶质属异多糖(heteropolysaceharides)，分子量在30kda300kda，主要由(1-4)-d-半乳糖醛酸(d-galacturonan)经-1,4糖苷键连接成直链状聚合物，部分(1-4)-d-半乳糖醛酸上的羧基可与甲醇酯化形成甲酯1。果胶(pectin)即为甲酯化的多聚半乳糖醛酸物质(polalaeturonieaeids)，其分子中约75%羧基是被甲酯化的。果胶按其分子中d-半乳糖醛酸上羧基的酯化程度不同，可分为低甲酯果胶(酯化度25%50%)和高甲酯果胶(酯化度50%80%)2。果胶酶(pectinases）是指能分解果胶质的多种酶的总称，不同来源的果胶酶其特点也不同，微生物来源的果胶酶主要有聚半乳糖醛酸酶(pg)，聚半乳糖醛酸裂解酶(pgl)、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(pmgl）和果胶酯酶(pe) 3 。pg在果胶酶系中发现较早，它可以水解d-半乳糖醛酸-1,4糖苷键，产物为单半乳糖醛酸和二半乳糖醛酸；pgl通过切断果胶分子-1,4糖苷键，生成具有不饱和键的半乳糖醛酸酯；pmgl可以切断果胶分子-1,4糖苷键，产物为28个糖醛酸单位的不饱和甲基半乳糖酸低聚物；pe能使果胶中的甲酯水解，生成果胶酸和甲醇4。果胶酶的应用十分广泛。例如可降低果汁粘度，澄清果汁果酒，从而保持产品的稳定性，同时，果胶酶还可保持果粒的完整性；有些果蔬榨汁较困难，若先用果胶酶处理，可使果蔬汁粘度下降，有利于过滤和浓缩，提高出汁率，改善成分5；果胶酶还可以应用于水果和蔬菜的浸解、液化，生产单细胞果蔬汁；果胶酶还可用于果实脱皮。由于含有纤维素酶和半纤维素酶的粗果胶酶制剂能作用于果实皮层，使细胞分解而脱落。橘子囊衣、莲子内皮和大蒜膜层经果胶酶处理后可以很快脱落6；砍伐后的木材常对防腐剂如杂酚油或铜一铬一硼的处理有抗性。经果胶酶制剂或产果胶酶细菌处理后，木材的通透性增加，从而加强了防腐剂的使用效果；麻类植物中除含有纤维素、果胶半纤维素、木质素等，还含有胶类物质即非纤维类物质，占麻类成分的2030%，纺织时须去除。常用的化学脱胶法操作条件较复杂，且会产生大量废水。我国土法脱胶就是将麻浸入池塘或河沟，利用存在于麻类植物本身或水中的细菌等微生物产生的果胶酶分解果胶7。此外，果胶酶还可应用于棉织物精炼加工。t.sakai (1988)等人发现碱性果胶酶可使原果胶水解成为可溶于水的高聚合度的果胶分子，从而开发了一种针对棉织物精练的生物化学工艺，并称之为生物精练(bioseouring)8。国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代。八十年代以来我国学者对果胶酶菌种选育进行了大量的研究。杨天波等以碳黑曲霉(a.carbonarius) asp.3.396为出发菌株，对孢子悬液进行紫外线和高能电子辐射复合处理，获得产酶能力提高的白色孢子突变株9。崔福绵等以0.03%亚硝基胍处理黑曲霉(a.niger)cp-831，获得高产果胶酶突变株cp-85211，此菌株在无锡酶制剂厂通过了中试，作为生产菌株进行批量生产10。据杜国军等报道，以黑曲霉(aspergillus niger) hy为出发菌株，进行紫外线诱变突变株hy-d3，其产酶遗传特性稳定，果胶酶产量可达2000u/g干基以上，比出发菌株提高了1倍11。国外对果胶酶的研究较多，kashyap等人从土壤中分离的bacillus sp.产生的裂解酶的分子量为106kda，酶活比同类报道提高了53 units/ml。目前国内工业上采用的果胶酶大多依赖进口产品，因此增加了生产成本，本试验旨在筛选果胶酶的高产菌株，并对其发酵条件进行优化，为实现果胶酶的国产化提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1材料菌株由试验筛选得到。果胶（美国sigma公司），马铃薯（市售），硝酸铵，硫酸钠，硫酸镁，氯化钾，硫酸铁，磷酸氢二钾，硝酸钠，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，硫代硫酸钠，碘，碘化钾，可溶性淀粉，硫酸铵，蔗糖，葡萄糖等（均为甘肃中瑞试剂公司提供）。1.2仪器设备微量移液器（finnpipette，上海雷勃分析仪器有限公司），摇床（sha-c，金坛市恒丰仪器厂），高温灭菌锅（yx-280b型，上海绿宇精密仪器制造有限公司），水浴锅（r-201型，上海申胜生物技术有限公司），电磁炉，烧杯，试管，培养皿，接种针，酒精灯，碘量瓶，酸式滴定管等。1.3试验方法1.3.1发酵条件优化1.3.1.1酶活测定参考孙越（1997）、陈静（1999）12,13方法，进行酶活测定：（1）酶液制备：将发酵液于4，8000r/min离心10min后取上清液作为粗酶液。（2）1%果胶溶液配制：取果胶粉1g，加热溶解，煮沸，冷却后过滤，调节ph值3.5，定容至100ml。（3）酶活测定：取两个100ml三角瓶，一个为酶液瓶(a瓶)，一个为空白瓶(b瓶)，并分别在a瓶、b瓶中各加入10ml 1%果胶溶液，a瓶加5ml重蒸馏水和5ml酶液后调ph值至3.5，b瓶加10ml重蒸馏水，40水浴1h后立即加热煮沸并冷却。取上述a瓶、b瓶中溶液各5ml，分别加入另外两个三角瓶a1、b1瓶中，各加1ml浓度为1mol/l的碳酸钠溶液摇匀，再各加5ml浓度为0.05mol/l碘-碘化钾溶液于两个三角瓶中，摇匀，加塞，放置20min后，分别吸取2ml浓度为1mol/l硫酸加入上述两个三角瓶中，用0.05mol/l硫代硫酸钠滴定至淡黄色时停止滴定，加入1ml浓度为0.5%的淀粉指示剂，此时溶液呈蓝色，继续滴定至蓝色消失为止，分别记下消耗硫代硫酸钠的体积数。（4）结果计算：将每小时酶促催化果胶分解成1mg游离的半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活性单位，具体计算公式如下:活性单位数/毫升酶液=(b-a)m0.5120/(515)式中：b空白消耗硫代硫酸钠溶液体积(ml) a试样消耗硫代硫酸钠溶液体积(ml) m硫代硫酸钠摩尔浓度 0.511摩尔硫代硫酸钠相当于0.51g游离半乳糖醛酸 20反应液体积(ml) 5吸取反应液体积(ml) 1反应时间(h)1.3.1.2发酵培养基最佳配方及条件的选择根据单因素试验结果，选择对果胶酶产酶水平影响显著的碳源(x1)，氮源(x2)，表面活性剂(x3)，发酵培养基初始ph(x4)和发酵温度(x5)五个因素进行二次回归正交旋转组合设计试验，通过测定果胶酶活力，确定最佳的发酵培养基配方。试验因子水平及编码见表1。表1因素水平编码表码值因素x1(%)x2(%)x3(%)x4x5()22.50.60.55.538120.50.453601.50.40.34.534-110.30.2432-20.50.20.13.5301.3.1.3数据分析根据试验结果，采用spss16.0建立五元二次回归方程以确定最佳试验条件并对相关性强的两因素的交互作用进行响应面分析。1.3.2验证试验根据试验得到的数据，进行产果胶酶菌株的发酵试验，以验证最佳生产工艺条件。2 结果与讨论2.1产酶条件优化利用二次回归正交旋转组合设计方案对菌株进行发酵条件的优化，其试验组合及结果见表2。表2 五因素二次回归正交旋转组合1/2实施试验结果表处理号x1x2x3x4x5结果（u/ml）1-1-1-1-115888.32-1-1-11-13031.63-1-11-1-110040.34-1-11113206.55-11-1-115771.76-11-11-16354.77-111-1-14547.48-111116471.391-1-1-111399.2101-1-11-110552.3111-11-1-12506.9121-11116762.81311-1-115013.81411-11-110463.315111-1-13381.416111116063.217-20000816.218200007229.2190-20005421.920020005888.32100-2006587.9220020011320.423000-206354.724000202856.7250000-27345.826000025713.427000006937.728000007287.529000006296.430000007345.831000006413.032000006354.733000005305.334000006471.335000007229.236000007753.92.2五元二次回归方程的建立及检验根据试验结果，采用spss16.0计算各项回归系数，以建立菌株产酶酶活与碳源(x1)，氮源(x2)，表面活性剂(x3)，发酵培养基初始ph (x4)和发酵温度(x5)五因子的数学回归模型：y=129.406+5130.403x1-2915.000x2+4314.199x3-1166.000x4-6646.200x5+915.003x1x2-2126.397x1x3+6.79x1x4+74.200x1x5-2578.198x2x3+112.599x2x4+3498.001x2x5-10494.001x3x4-201.801x3x5+610.599x4x5-19190.402x12-6131.203x22+3896.402x32-15526.396x42+864.802x52 式中x1、x2、x3、x4、x5为碳源、氮源、表面活性剂、发酵培养基初始ph值和发酵温度的编码值。由方差分析可知：回归方程的失拟性检验f1=0.256f0.05(9，6)=3.37不显著，可以认为所选用的二次回归模型是适当的；回归方程的显著性检验f2=3.606f0.01(15，20)=2.33极显著，说明模型的预测值与实际值吻合，模型成立；对回归系数进行显著性检验，在 =0.10 显著水平剔除不显著项, 得到优化后的方程为：y=129.406-2126.397x1x3+6.79x1x4+74.200x1x5-2578.198x2x3+112.599x2x4-201.801x3x5+610.599x4x5-19190.402x12-15526.396x42 2.3试验因子间交互作用分析 由回归系数的显著性检验可知，碳源(x1)与发酵培养基初始ph(x4)、碳源(x1)与温度(x5)、表面活性剂(x3)与温度(x5) 的互作效应对菌株的产酶效果影响显著，对其分别作图，可直观地分析各因子间的互作效应。由图1可以看出，碳源和温度对产酶的影响较大。当碳源浓度处于低水平时，随着ph的升高，菌株产酶性能逐渐提高；当碳源浓度处于高水平时，随着ph的升高，菌株产酶性能逐渐降低。当ph值较低时，随着碳源浓度的升高菌株产酶性能逐渐升高；当ph值较高时，随着碳源浓度的增加，菌株产酶性能急剧降低。这可能是由于在低ph条件下，碳源可以逐渐水解成微生物容易利用的小分子营养物质；另外，由于菌株产生的酶为酸性水解酶，ph过高会影响酶的活性，造成菌株产酶性能降低。图1 碳源和发酵培养基初始ph值对产酶的交互作用分析由图2可以看出，当碳源浓度处于较低水平时，随着发酵温度的升高，菌株的产酶性能先急剧上升，随后缓慢下降；当碳源浓度处于较高水平时，随着发酵温度的升高，菌株的产酶性能先缓慢上升，再急剧下降。当温度较低时，随着碳源浓度的提高，菌株的产酶性能逐渐升高；当温度较高时，随着碳源浓度的增加，菌株的产酶性能迅速降低。 图2 碳源和发酵温度对产酶的交互作用分析由图3可以看出，当表面活性剂浓度处于零水平附近时，温度对菌株产酶性能影响微弱。当表面活性剂处于较低水平时，随着温度的升高，菌株的产酶性能急剧升高，当表面活性剂浓度处于较高水平时，随着温度的升高，菌株的产酶性能急剧下降。这可能因为低浓度的表面活性剂可促进胞内酶的外渗，从而使菌株的产酶性能提高。图3表面活性剂和温度对产酶的交互作用分析2.4发酵条件的优化及验证 采用matlab6.5对方程2进行求解，得出极大值点及极大值。试验结果如下：发酵碳源浓度1.434%；发酵氮源浓度0.6%；表面活性剂浓度0.01%；发酵初始ph4.03；发酵温度41.3，在此条件下菌株理论产酶活性可以达到11535u/ml。通过验证试验得到菌株实际产酶性能为11174u/ml，两者相差不大。3 结论3.1菌株产酶性能优化条件的数学回归模型为y=129.406-2126.397x1x3+6.79x1x4+74.200x1x5-2578.198x2x3+112.599x2x4-201.801x3x5+610.599x4x5-19190.402x12-15526.396x42 此模型能在试验范围内准确测得微生物产酶性能的条件。3.2通过因素之间的交互作用分析可以得出碳源(x1)与发酵培养基初始ph(x4)，碳源(x1)与温度(x5)，表面活性剂(x3)与温度(x5)的互作效应对菌株的产酶效果影响显著。3.3菌株发酵最优条件为发酵碳源浓度1.434%；发酵氮源浓度0.6%；表面活性剂浓度0.01%；发酵初始ph4.03；发酵温度41.3，在此条件下菌株理论产酶活性可以达到11535u/ml。通过验证试验得到菌株的实际产酶性能为11174 u/ml，两者相差不大。参考文献1王璋.食品酶学.北京:轻工业出版社,1990,164175.2罗仓学,张长青.果胶酶制剂对草莓汁澄清作用的研究.青海大学学报(自然科学版),2001,19(5):56.3全桂静.果胶酶高产霉菌的筛选及固体发酵条件的优化.沈阳化工学院学报,2008,22(1):3640.4邱雁临,王金华.果胶酶对山楂酒澄清的研究.湖北农业科学,1996,(6):6770.5杨军,梅艳.黑曲霉a1果胶酶在苹果汁澄清中的应用研究.湖北农业科学,1999,(2):4851.6赵丽莉.微生物果胶酶研究及其在果蔬加工中的应用进展.2007,7(6):951953.7张树政.酶制剂工业(下册).北京:科学出版社,1984,652.8尤华,陆兆新,冯红霞.微生物原果胶酶的研究进展.工业微生物,2002,32(1):5053.9杨天波.微生物学通报,1985,12(4):162165.10崔福绵.果胶酶cp-8521菌株的选育及其液体发酵条件的研究.微生物学报,1987,27(l):3744.11杜国军.产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种.农业与技术,2008,28（2）:68-70.12孙越.果胶酶活性的测定方法j.食品科技,1997(3):3738.13陈静,王淑军,杨从发,等. 果胶酶产生菌的选育j.淮海工学院学报, 1999(3):6365.application of quadratic regression and orthogonal rotation combination to design optimization onfermentation conditions of pectinasediao wangqiang(college of