植检专业毕业论文19039.doc

1 毕 业 论 文 题目：放线菌 t111 发酵液理化性质及发酵产物对核盘菌抑菌 机制初探 2 目 录 中文摘要 4 英文摘要 4 1 前言 5 1.1 生防菌应用的种类 .6 1.2 拮抗放线菌的主要作用机制 .7 1.3 本研究的目的及意义 .8 2 材料与方法 8 2.1 材料 .8 2.2 拮抗放线菌发酵液抑菌活性测定方法 .9 2.3 t111 发酵液的理化性质 9 2.4 放线菌 t111 发酵产物对核盘菌的抑菌机制研究 10 3 结果与分析 .11 3.1 t111 发酵液的理化性质 11 3.1.1 发酵液抗菌谱 11 3.1.2 贮存稳定性 12 3.1.3 热稳定性 13 3.1.4 酸碱稳定性 13 3.1.5 紫外光稳定性 14 3.2 t111 发酵产物对核盘菌的抑菌机制结果 15 3.2.1 t111 发酵产物对核盘菌菌丝生长的影响结果 .15 3.2.2 t111 发酵产物对核盘菌菌丝形态的影响结果 .15 3.2.3 t111 发酵产物对核盘菌菌核形成及单重的影响结果 .16 3.2.4 t111 发酵产物对核盘菌菌核萌发的影响结果 .17 3.2.5 t111 发酵产物对核盘菌菌丝体细胞膜渗透势的影响结果 .18 4 讨论 .19 5 参考文献 .20 6 致谢 .21 3 catalogue chinese abstract4 english abstract 4 1 introduction .5 1.1 the category of antagonism fungus .6 1.2 the antagonistic mechanisms of streptomyces7 1.3 purpose and significance of the study 8 2 material and methods 8 2.1 material.8 2.2 antifungal abilities of fermentation conditions9 2.3 physical and chemical properties of t111 strain9 2.4 antagonistic mechanisms to sclerotinia sclerotiorum of t111 .10 3 results and analyse .11 3.1 physical and chemical properties of t111 strain11 3.1.1 inhibition spectrum of fermentation extracts of t11.11 3.1.2 effects of storage time on the activity of fermentation extracts12 3.1.3 effects of temperatures on the activity of fermentation extracts.13 3.1.4 effects of ph on the activity of fermentation extracts 13 3.1.5 effects of uv irradiation time on the activity of fermentation extracts14 3.2 the result of antagonistic mechanisms to sclerotinia sclerotiorum 15 3.2.1 inhibition toxicities on mycelium growth of s. sclerotiorum .15 3.2.2 effect of fermentation broth of t111 on sclerotium mycelium shape 15 3.2.3 effect of antifungal substance of t111 on sclerotium formation time and single weight .16 3.2.4 effect of antifungal substance of t111 on sclerotium bourgeon 17 3.2.5 effect of antifungal substance of t111 on membrane osmotic potential18 4 discussion .19 5 reference.20 6 thanks .21 4 放线菌 t111发酵液理化性质及发酵产物对核盘菌 抑菌机制初探 作者:韩红宁（06 植检一） 指导教师：慕卫 摘要：为明确放线菌 t111 的理化性质，研究了其抗菌谱，及贮存时间、温度、酸碱条件、紫 外光照射等对其发酵液稳定性的影响。结果表明，t111 发酵液对黄瓜菌核、黄瓜蔓枯、棉花 红腐病菌等有较高的抑制活性；贮存稳定性和热稳定性良好，4贮存 60d 抑菌活性为对照的 88.3%，80处理 60min 抑菌活性为对照的 90.9%；对 ph 值较敏感，在 ph 57 时活性较高； 对紫外线稳定，紫外光照射 12h，其活性基本不受影响。初步研究了 t111 发酵产物对核盘菌 的抑菌机制，采用菌丝生长速率法测定了其对黄瓜菌核病菌 sclerotinia sclerotiorum 菌丝 生长的毒力，及其对菌丝形态、菌核形成、菌核萌发和菌体细胞膜透性的影响。结果表明， t111 发酵产物对核盘菌菌丝生长的 ec50值为 12.5g/ml，低于对照药剂乙霉威及嘧霉胺；经 发酵产物处理后，菌丝形态出现黄化、畸形等现象，但尚未发现细胞质外渗；菌核形成的时间 有所延长，数量有所减少，且重量略有降低；在发酵产物浓度为 250g/ml 时不能完全抑制菌 核萌发；对菌体细胞膜渗透势的影响不大。 关键词：黄色链霉菌；黄瓜菌核病菌；发酵液；理化特性；抑菌机制 characterizations of t111 fermentation extract and antagonistic mechanism to sclerotinia sclerotiorum author: han hongning tutor: professor mu wei abstract: the physical and chemical properties of the fermentation extract were studied by using agar-well diffusion method. the results showed that the fermentation extracts had high inhibitory activities on sclerotinia sclerotiorum, ascochyta citrullina and fusarium moniliforme var. intermedium. and it was well-stored and thermalstable, 88.3% of the initial activities remained after stored 60d at 4, 90.9% of the initial activities remained after heating at 80 for 60min. the 5 fermentation extract was sensitive to the changes of ph, only in the ph range of 5-7 was stable; the antifungal activities were almost not destroyed when it was under uv irradiation for 12h. to ascertain the antagonistic mechanisms of the antifungal substance to s. sclerotiorum, the inhibition activities on mycelium growth against s. sclerotiorum were determined by mycelium growth rate method in lab. and its effect on this pathogens biology characteristics, such as mycelium shape, sclerotium formation, sclerotium germination and membrane osmotic potential were also studied. the results showed that its ec50 value was 12.5g/ml, which was lower than diethofencarb and pyrimethanil. after treated with the antifungal substance, the mycelia became etiolation and malformation, but had not yet found in the cytoplasm extravasation. this antifungal substance could delay the formation of sclerotium, the sclerotium numbers decreased contrasted that of the water control, and the weight reduced slightly. at the concentration of 250g/ml of this antifungal substance, it could not restrain the sclerotium germination completely. and it had no significant effect on the membrane osmotic potential. key words: streptomyces flavus; sclerotinia sclerotiorum（ lib.）de bary; fermentation extract; physical and chemical properties; antagonistic mechanisms. 1、前 言 植物土传病害，其病原菌一般为多寄主微生物，通常侵染植物根部，引起植 物根部乃至全株性病害。土传病害的发生和流行通常属于积年流行病害，年度间 波动不大。在防治方面，化学防治和抗病育种目前只对部分病害有效，对大多数 病害防效不甚理想 1。黄瓜菌核病就是近几年来严重为害温室黄瓜产量的一种重 要土传病害，该菌以菌核的状态在自然条件下可以长期存活，防治非常困难。目 前生产上主要依靠化学防治，但由于抗药性的发生，使得菌核病菌对多种杀菌剂 存在着较高的抗性。目前正在寻找一种简单、有效、安全的植物病害防治方法， 即生物防治。 生物防治是指通过除人以外的一种或多种生物来降低病原微生物数量或减弱 病原菌的致病能力，从而减少病原微生物所致病害的发生 2。它是通过植物、病 原物、生防菌、植物表面及其周围微生物群落和自然环境等因素的互作关系，来 达到促生防病的作用 3。 拮抗微生物具有不易使病原菌产生抗性、对环境安全、生产工艺相对简单以 及不少微生物同时具有促进作物生长等优点而受到人们的关注和重视 4。利用拮 抗微生物产生的抗菌物质进行生物防治已成为研究的热点，已开发的有灭瘟素、 6 放线菌酮、井冈霉素、多抗霉素、农抗 120 等。近年来，随着研究的深入和生防 要求的提高，人们开始将更多的注意力转移到一些新型抗菌物质上，如新型抗生 素、抗真菌蛋白等，因而需要不断地发掘和利用新的拮抗微生物资源。 1.1 生防菌应用的种类 生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌等。真菌主要 有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等；细 菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌（pgpr） 、放射性土壤农杆菌和 巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种。 对生防真菌研究最广泛的是木霉菌（ t. richoderma） ，常见的木霉菌有哈茨 木霉、绿色木霉、钩状木霉、长枝木霉、康氏木霉和绿粘帚霉等。它广泛存在于 土壤及植物表面，经常可从植物病残体、种子、球茎表面分离到。如文成敬等 5 将油菜菌核作为诱饵埋入土壤中 2 个月后从菌核表面和内部分离到 52 株木霉，分 别为黄绿木霉、钩状木霉、哈茨木霉、康化木霉、拟康化木霉。 目前国际上用于防治土传病害的拮抗细菌常见的有以下属：产碱菌属 6、无 定形孢囊菌属、节杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄 杆菌属、哈夫尼菌属、小单孢菌属、假单孢菌属、巴斯德氏芽菌属、根瘤菌属、 沙雷氏菌属和黄单胞菌属 7。已开发为生防农药的生防细菌主要有芽孢杆菌属、 链霉菌属、假单胞菌属和土壤杆菌属等。目前国内外 8应用芽孢杆菌防治植物病 害非常广泛，据报道，芽孢杆菌对马铃薯环腐病菌 9、梨灰霉病菌 10、油菜菌核 病菌 11、水稻白叶枯病菌 12、稻瘟病菌 13和小麦赤霉病菌 14等具有潜在的生防 利用价值。张学君等 15表明芽孢杆菌对棉花枯萎病菌、立枯病菌、黄萎病菌、炭 疽病菌、棉铃疫霉病菌和棉叶斑病菌均有强烈的抑菌作用。魏春妹等 16制得的生 防制剂青枯散，不仅对青枯病菌的拮抗率为 83.5%，而且能促进番茄、花生、黄瓜、 烟草、油菜等作物生长。目前用于生防细菌的种类有：枯草芽孢杆菌（ b. subtilis） 、多粘芽孢杆菌（ b. polvmvxa） 、蜡状芽孢杆菌（ b. cereus） 、巨大芽 孢杆菌（ b. megaterium）和短小芽孢杆菌（ b. pumilis）等 17。 放线菌由于菌落呈放射状而得名。从 cohn（1872）发现放线菌至今，已经报 道了 69 个属，1687 个种 18。应用于生物防治的放线菌主要是链霉菌属 （streptomyces） ，其次有诺卡菌属（nocardia） 、游动放线菌（actinoplanes） 、 小单孢菌属（micromonospora）等 19。据统计，已发现的抗生素，61.7%是放线菌 产生的。而目 前 广 泛 应 用 的 许 多 重 要 农 用 抗 生 素 是 从 链 霉 菌 属 中 分 离 得 到 的 放 7 线 菌 所 产 生 的 。 如 井冈霉素用于防治水稻纹枯病，在蔬菜上应用防治苗期立枯病 和白绢病；春雷霉素用于防治黄瓜的炭疽病、细菌性角斑病、枯萎病，番茄叶霉 病；农抗 120 主要用于防治蔬菜、果树、花卉等作物的白粉病，对瓜果的炭疽病、 番茄疫病也有一定防效；多抗霉素防治瓜类、番茄白粉病、灰霉病，丝核菌引起 的叶菜和其他蔬菜的糜烂、猝倒病，以及黄瓜霜霉病和番茄晚疫病；农用链霉素 主要用于防治黄瓜角斑病等细菌性病害。 1.2 拮抗放线菌的主要作用机制 放线菌一般通过两种途径对靶标致病菌发挥生防作用：它能够在寄主体外通 过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用降低病原菌的致病性、侵染效率以及 接种体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降，人们利用它的这一特性开发 一些活体菌制剂。放线菌也可以在寄主植物组织内，诱发其产生抗性或对寄主产 生抑菌物质（主要是抗生素） ，影响病原菌的繁殖、生长，最后导致靶标致病菌死 亡，在这方面对其产生的抗生素研究较多。 1.2.1 抗生作用 抗生的发生主要依赖于生防菌抗生素的产生，一般单株生防放线菌可以合成 多种抗生素。抗生素的作用机理主要是：（1）抑制微生物细胞代谢的某些环节或 代谢中的某些酶系统，微生物重要代谢环节被抑制，生长发育出现障碍，甚至死 亡。 （2）广谱抗生素的抗菌机制：某些抗生素能抑制微生物共同的代谢途径，如 蛋白质和核酸的合成，则可抑制许多不同种类微生物的生长。 （3）除了干扰代谢 作用外，有时也可影响病原菌的形态结构。 1.2.2 竞争作用 生防放线菌对土壤或植物根际中碳源的竞争利用，可以阻止病原菌的生长， 从而阻止了病原菌对植物的侵染。竞争方式为（1）空间竞争：由于能够产生抗生 素，放线菌能够抑制许多植物病原菌，但它们的应用价值还在于它们在植物根围 的定殖能力以及是否对有益菌有抑制作用等；（2）营养竞争：铁离子（fe 3+）利 用度是土壤环境对微生物生长的一个限制因子，链霉菌能够分泌嗜铁素 （siderophore） ，鳌合铁离子，从而更多地利用铁离子，限制了病原微生物对铁 离子的需求，从而达到抑制病原菌的目的。 1.2.3 重寄生作用 由水解酶介导的重寄生是生防菌的作用机制之一。放线菌可以分泌多种胞外 水解酶，主要包括：几丁质酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯 8 酶、脂肪酶和核酸酶等。植物病原高等真菌的细胞壁是以几丁质为骨架，以 - 1，3-葡聚糖为主要填充物组成的。处于生长过程中的菌丝尖端几丁质多呈裸露状 态，易被水解酶攻击而导致细胞破裂，生长受阻或者细胞死亡，阻止病害的发生 发展。 1.2.4 促进植物生长 benson 于 1993 年报道植物根际的链霉菌具有固氮作用，可与植物形成共生关 系，促进植物生长。近年来，我国也开展了弗兰克氏菌共生固氮放线菌的研究， 该菌能够诱导大范围放线菌根瘤植物产生根瘤，并促进植物对 fe 等元素的吸收。 1.3 本研究的目的及意义 本实验室以黄瓜菌核病菌为指示菌，筛选到一株对其有强拮抗活性的放线菌 株t111。本文在此基础上测定了其拮抗谱、贮存稳定性、酸碱稳定性、热稳定性、 紫外光稳定性等理化性质，然后进一步研究了其发酵产物对核盘菌的抑菌机制， 为进一步分析抗菌物质结构和开发利用提供依据。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 供试菌株 拮抗放线菌：t111，分离于泰安市郊保护地黄瓜根际土壤中，本实验室保存。 指示菌：黄瓜菌核病菌（sclerotinia sclerotiorum） 、黄瓜蔓枯病菌 （ascochyta citrullina） 、棉花红腐病菌（fusarium moniliforme var. intermedium） 、黄瓜枯萎病菌（fusarium oxysporium） 、棉花黑斑病菌 （xanthomonas campestris pv. malvacearum） 、番茄叶霉病菌（cladosporium flulvum） 、棉花炭疽病菌（colletotrichum gossypii southw） 、番茄灰霉病菌 （botrytis cinerea） 、黄瓜猝倒病菌（pythium spp.） 、苹果腐烂病菌 （cytospora mandshurica） 、水稻纹枯病菌（rhizoctonia solani khn） ，均为 本实验室分离鉴定保存。 2.1.2 供试培养基 高氏一号液体培养基：可溶性淀粉 20g，kno 3 1g，nacl 0.5g，k 2hpo43h2o 0.5g，mgso47h2o 0.5g，feso47h2o 0.01g，去离子水 1000ml；用于放线菌 9 t111 发酵液的培养。 pda 培养基：马铃薯（去皮）20g，葡萄糖 20g，琼脂 17g，去离子水 1000ml；用于指示菌黄瓜菌核病菌的培养及拮抗活性的测定。 2.1.3 主要仪器与试剂 2.1.3.1 仪器 cr22 高速冷冻离心机（日本日立公司） ；生化培养箱（上海跃进医疗器械厂） ； ga110 万分之一电子天平（德国制造） ；ldzx-40bi 自动电热压力蒸汽灭菌器（上 海申安医疗器械厂） ；紫外灯（长沙市鑫辉特种光源电器厂） ；光学显微镜 （olympus 公司） ；xl80 漩涡振荡器（上海第一医学院仪器厂） ；swcjld 超 净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司） ；wd700 微波炉（顺德格兰仕电 器厂） ；thz82 空气浴摇床（江苏太仓） ；ddsj-308a 型电导率仪（上海精密科学 仪器有限公司雷磁仪器厂） 。 2.1.3.2 化学及生化试剂 琼脂粉（上海山浦化工有限公司） ；葡萄糖（分析纯，上海伯奥生物试剂有限 公司） ；酵母浸膏（天津市英博生化试剂有限公司） ；氯化钠（天津市凯通化学试 剂有限公司） ；胰蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司） ；硫酸链霉素（山 东瑞阳制药有限公司） ；95.5乙霉威原药（江苏苏化集团新沂农药厂） ；95腐 霉利原药(日本住友化学工业株式会社)。 2.2 拮抗放线菌发酵液抑菌活性测定方法 2.2.1 平板对峙法 在 pda 平板上以原点为中心划垂直的十字，沿一条线接生防菌，另一条线两端 与中心等距离（20mm）处接供试病原菌菌饼。25培养 48h 后观察抑菌带大小判 断抑菌活性大小（方中达，2005） 。 2.2.2 生长速率法 将培养好的发酵液于 4 10000r/min 离心 15min 除去菌体，取 2ml 上清与 18ml pda 培养基（内含 50mg/l 硫酸链霉素）混匀后倒平板，平板冷却后在中央接 种黄瓜菌核病菌菌饼，以不加上清的 pda 平板做对照，25培养箱中培养 48h，测 量菌落直径，计算抑菌率，根据抑菌率大小判断抑菌活性强弱。 10(%) 对 照 菌 落 直 径处 理 菌 落 直 径对 照 菌 落 直 径抑 菌 率 2.2.3 琼脂孔扩散对峙法 将黄瓜菌核病菌菌饼（8 mm） 10 接种于 pda 平板中央，在菌饼周围 2 cm 处均匀打 3 个孔（8 mm） ，将待测物 注入孔内，每孔约 60 l，25下培养 48 h，测量抑菌圈半径，以抑菌圈半径大 小评价抑菌效果大小。 2.3 t111发酵液的理化性质 2.3.1 抗菌谱 用平板打孔法分别测定发酵上清液对黄瓜菌核病菌（ sclerotinia sclerotiorum） 、黄瓜蔓枯病菌（ ascochyta citrullina） 、棉花红腐病菌 （ fusarium moniliforme var. intermedium） 、黄瓜枯萎病菌（ fusarium oxysporium） 、棉花黑斑病菌（ xanthomonas campestris pv. malvacearum） 、番 茄叶霉病菌（ cladosporium flulvum） 、棉花炭疽病菌（ colletotrichum gossypii southw） 、番茄灰霉病菌（ botrytis cinerea） 、黄瓜猝倒病菌 （ pythium spp.） 、苹果腐烂病菌（ cytospora mandshurica） 、水稻纹枯病菌 （ rhizoctonia solani khn）的抑菌作用，以不含抗菌发酵液的液体培养液作对 照。 2.3.2 抗菌效果的稳定性 取发酵上清液 50ml，平均分为两份，分别装入无菌的密 封三角瓶中，分别在 4冰箱和室温条件下保存，在保存 3、7、15、30、60d 时测 定抑菌活性。 2.3.3 热稳定性 将发酵液于 50、60、70、80、90 和 100下分别处理 60min，以 黄瓜菌核病菌作为指示菌，未经热处理的发酵液作对照，平板打孔法测定活性。 2.3.4 ph 稳定性 将 t111 发酵液 100ml 分别用 1mol/l hcl 和 1mol/l naoh 处理至 ph 值 4、5、6、7、8、9、10，分别静置 2h，然后将 ph 调回发酵液的自然 ph 值 （经 ph 计测定原发酵液 ph 为 6.5） ，未经酸碱处理的发酵液作对照，平板打孔法 测定活性。 2.3.5 紫外光稳定性 将发酵上清液置于无菌培养皿中，然后将盛满发酵液的培养 皿放在据 20w 紫外灯 10cm 处紫外照射，在照射 1、3、5、7、9、12h 后，平板打 孔法测活。以未经紫外光照射的粗提液为对照。每个处理重复 3 次。 2.4 放线菌 t111发酵产物对核盘菌的抑菌机制研究 2.4.1 t111 发酵产物的制备 得到上清液后，用等体积的乙酸乙酯萃取 3 次，萃取液经无水硫酸钠脱水后， 27、150rmin -1旋转蒸发，得到黄色固体粗提物，后续试验用去离子水定量溶 解。 2.4.2 t111 发酵产物对核盘菌菌丝生长的影响 采用菌丝生长速率法。在预备试验的基础上，无菌条件下选择放线菌 t111 发 11 酵液对核盘菌菌丝生长抑制率在 1090范围内的 5 个系列浓度，制成含药培 养基，将菌饼倒置接种于含药平板中央（平板中加入硫酸链霉素抑制细菌的生长） , 每处理设 3 次重复，置于 25下培养 48h，十字交叉法测量菌落直径，计算抑 制率。所得数据用 dps 统计软件求出毒力回归方程及 ec50值和 ec90。 2.4.3 t111 发酵产物对核盘菌菌丝形态的影响 在 2.6.1 试验的基础上，观察经不同浓度发酵液处理后的菌丝形态，并挑取 经 ec90浓度发酵液处理的菌丝，制成玻片，在显微镜下观察菌丝形态。 2.4.4 t111 发酵产物对核盘菌菌核形成及单重的影响 在 2.6.1 试验的基础上观察各浓度的发酵液对菌核形成的影响。同时选择放 线菌 t111 发酵液的 ec50和 ec90 浓度进行皿内抑制培养处理，至各培养皿菌丝不 再快速生长、产生黑褐色菌核为止，记录菌核形成的时间、菌核数量，并称量菌 核单重。 2.4.5 t111 发酵产物对核盘菌菌核萌发的影响 将黄瓜菌核病菌接种到 pda 培养基上，25培养 15d，待菌核开始变褐时收集 大小一致的菌核，置于铺有灭菌滤纸的无菌培养皿中，滴加少量灭菌水保湿培养， 至菌核完全变褐成熟，菌丝全部死亡。 在上述试验基础上，根据发酵液 ec50浓度设计并配制系列浓度，将表面无菌 丝的成熟菌核置于含有系列浓度发酵液的 pda 平板上。25恒温培养，统计菌核 萌发率，测出抑制萌发的最低浓度。试验重复 3 次，每重复测定 10 个菌核。 2.4.6 t111 发酵产物对核盘菌菌丝体细胞膜渗透势的影响 将黄瓜菌核病菌置于 pda 平板上，25下培养 5d，在菌落边缘制取直径为 4mm 的菌饼分别接入 pd 培养液中，120r/min 振荡培养 2d 后取菌丝备用。新鲜菌 丝用重蒸水冲洗，真空抽滤后称取菌丝鲜重 0.2g 放入锥形瓶中，分别加入由 25ml 重蒸水稀释的系列浓度发酵液中。25下恒温水浴中振荡（120r/min） ，分别测定 在 0、5、15、30、60、120、150min 时的电导率。以不加入发酵液但含有相同浓 度硫酸铵的 tris-hcl 缓冲液为对照，对照药剂腐霉利以不加入腐霉利原药的其他 助剂为对照。 3 结果与分析 3.1 t111发酵液的理化性质 3.1.1 t111 发酵液的抗菌谱 12 从表 1 中可以看出，在被测的 11 种供试病原真菌中，t111 对黄瓜菌核、黄瓜 蔓枯、棉花红腐病菌抑制效果最好，菌丝抑制率均在 70%以上；对黄瓜枯萎、棉花 黑斑、棉花炭疽、番茄叶霉、番茄灰霉病菌抑菌率在 50%以上；而对水稻纹枯病菌 抑制率低于 30%。数据表明，t111 菌株发酵液抗菌活性范围较广，且对部分植物 病原真菌有很好的抑菌效果。 表 1 t111 发酵液抗菌谱测定结果 table 1 inhibition spectrum of fermentation extracts of t111 病原菌 pathogenic fungus 抑制率 inhibitory rate 病原菌 pathogenic fungus 抑制率 inhibitory rate 黄瓜菌核病菌 s. sclerotiorum + 棉花炭疽病菌 c. gossypii southw + 黄瓜蔓枯病菌 a .citrullina + 苹果腐烂病菌 c. mandshurica + 黄瓜猝倒病菌 p. spp. + 番茄叶霉病菌 c. flulvum + 黄瓜枯萎病菌 f. oxysporium + 番茄灰霉病菌 b. cinerea + 棉花黑斑病菌 x. campestris pv. malvacearum + 水稻纹枯病菌 r. solani khn - 棉花红腐病菌 f. moniliforme var. intermedium + 注：+：抑制率 70100%；+：抑制率 5070%；+：抑制率 3050%；-：抑制率30%。 note: +: inhibitory rate 70-100%; +: inhibitory rate 50-70%; +: inhibitory rate 30-50%; -: inhibitory rate30%. 3.1.2 贮存稳定性 13 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 3 7 15 30 60 贮 存 时 间 storage time（ d） 抑 制率 inh ibito ry r ate（ %） 4常 温 图 1 不同贮存时间对 t111 发酵液活性的影响 fig.1 effects of different storage time on the activity of fermentation extracts of t111 由图 1 可知，总体上，t111 发酵液贮存稳定性良好，4条件下贮存 60d，活 性为刚刚发酵完的粗提液的 88.3%，常温下贮存 60d 活性为刚刚发酵完的粗提液的 73.9%。4条件下贮存更有利于维持较高的抑菌活性。 3.1.3 热稳定性 0 10 20 30 40 50 60 70 80 50 60 70 80 90 100 ck 温 度 temprature（ ） 抑制 率 i nhib itory rate （% ） 图 2 不同温度处理对发酵液活性的影响 fig. 2 effects of different temperatures on the activity of fermentation extracts of t111 图 2 显示，t111 发酵液具有较强的热稳定性。5080各处理 60min，抑菌活 性均维持在对照的 90%以上；80处理 60min 抑菌活性为对照的 90.9%，100处 14 理 60min，活性为对照的 80.3%。 3.1.4 酸碱稳定性 010 2030 4050 6070 80 4 5 6 7 8 9 10 ph 抑制 率 in hibit ory rate（ %） 图 3 不同 ph 处理对 t111 发酵液活性的影响 fig.3 effects of different ph on the activity of fermentation extracts of t111 由图 3 可知，在碱性条件下，t111 活性很低，ph 大于 10 基本没有活性，说 明 t111 对碱敏感；ph 57 活性较高，说明 t111 适于弱酸性和中性环境，最适 ph 为 6.0。所以在对 t111 菌株处理时，要注意控制 ph 值，尽量控制在弱酸性和中性， 以减少抗生素活性的损失。 3.1.5 紫外光稳定性 010 2030 4050 6070 80 0 1 3 5 7 9 12 照 射 时 间 irradiation time（ h） 抑制 率 i nhib itory rate（ %） 图 4 不同紫外光照射时间对 t111 发酵液活性的影响 fig.4 effects of different uv irradiation time on the activity of fermentation extracts of t111 在紫外光下连续照射 12h 后，t111 发酵液活性基本保持不变，抑菌活性仍能 15 达到对照活性的 82.1%，表明 t111 具有良好的紫外稳定性（图 4） 。 3.2 放线菌 t111发酵产物对核盘菌的抑菌机制结果 3.2.1 t111 发酵产物对核盘菌菌丝生长的影响结果 表 2 为放线菌 t111 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝生长抑制作用的毒力测定结 果。结果显示，放线菌 t111 发酵产物对黄瓜菌核病菌的 ec50值为 12.5g/ml，不 及对照药剂乙霉威和嘧霉胺（ec 50值分别为 4.15g/ml 和 0.72g/ml） 。 表 2 放线菌 t111 发酵产物对核盘菌菌丝生长的抑制作用 table 2 inhibition toxicities on mycelium growth of s. sclerotiorum by antagonistic activity of fermentation broth 处理 treatment 毒力回归方程 toxicity regresssion equation ec50（g/ml） (95%cl） ec90（g/ml ） (95%cl） 发酵液 fermentation broth y=3.227+1.821x 12.51（7.3319.87） 65.35（36.04152.6） 乙霉威 diethofencarb y=3.827+1.966x 4.15（3.335.27） 23.86（13.7352.43） 嘧霉胺 pyrimethanil y=5.240+1.691x 0.72(0.5350.923) 4.13(2.8407.507) 3.2.2 t111 发酵产物对核盘菌菌丝形态的影响结果 a. ck 10g/ml 45g/ml b. ck 45g/ml 图 5 t111 发酵产物处理对菌丝形态的影响（a.肉眼观察 b.显微镜观察） fig.5 effect of fermentation broth of t111 on sclerotium mycelium shape of s. sclerotiorum（a. visual observation b. microscopic observation） 经放线菌 t111 发酵产物处理后，菌丝生长缓慢，并出现黄化现象，发酵液浓 度越高，黄化越严重。4d 后菌丝生长出现停滞现象，而 7d 后又开始扩展，但扩展 无规律，菌丝生长密集（见图 5a） 。菌丝的微观形态也发生了明显变化（图 5b） ， 清水对照菌丝细长平直；而经发酵液处理后菌丝形态发生畸形，菌丝开始增粗， 16 分枝增多并有膨胀现象，菌丝节间明显变短，在隔膜处缢缩，节中间膨大，呈念 珠状。 3.2.3 t111 发酵产物对核盘菌菌核形成及单重的影响结果 经放线菌 t111 发酵产物处理，25培养 7d 后，菌丝仍然继续扩展，但扩展 无规律，出现畸形现象，无菌核出现。而清水对照开始在培养皿边缘出现菌核。 培养 15d 以后，发酵产物处理的菌丝开始在生长缓慢的菌丝边缘处出现菌核（图 6） 。从菌核平均单重及数量来看，经发酵液处理后，菌核单重降低，数量有所减 少。对照药剂乙霉威和嘧霉胺在 ec50浓度处理后，菌核数量和平均单重都明显减 小，在 ec90浓度处理后，菌核数目进一步减少，但菌核单重有所增加（图 7，8） 。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 发酵 液 fer men tat ion bro th 乙霉 威 die tho fen car b 嘧霉 胺 pyr ime tha nil 清水 对照 ck 处 理 treatment 菌核 形成 时间 （d ） scl ero tiu m f orm ati on tim e ec50 ec90 图 6 t111 发酵产物对核盘菌菌核形成时间的影响 fig. 6 effect of antifungal substance of t111 on sclerotium formation time of s. sclerotiorum 17 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 发酵 液 fer men tat ion bro th 乙霉 威 die tho fen car b 嘧霉 胺 pyr ime tha nil 清水 对照 ck 处 理 treatment 菌核 单重 （m g） scl ero tiu m w eig ht ec50 ec90 图 7 t111 发酵产物对核盘菌菌核单重的影响 fig. 7 effect of antifungal substance of t111 on single sclerotium weight of s. sclerotiorum 0 2 4 6 8 10 12 14 发酵 液 fer men tat ion bro th 乙霉 威 die tho fen car b 嘧霉 胺 pyr ime tha nil 清水 对照 ck 处 理 treatment 菌核 数（ 个） scl ero tiu m n umb er ec50 ec90 图 8 t111 发酵产物对核盘菌菌核形成数量的影响 fig. 8 effect of antifungal substance of t111 on sclerotium number of s. sclerotiorum 3.2.4 t111 发酵产物对核盘菌菌核萌发的影响结果 经放线菌 t111 发酵产物 250g/ml 的浓度（ec 50浓度的 20 倍）处理后，菌核 18 的萌发与清水对照相比虽然延迟了 3d，且萌发率有所降低，但并不能被完全抑制。 对照药剂乙霉威和嘧霉胺在约相当于其 ec50浓度的 20 倍时（分别为 80g/ml 和 15g/ml）也不能完全抑制菌核的萌发。 3.2.5 t111 发酵产物对核盘菌菌丝体细胞膜渗透势的影响结果 黄瓜菌核病菌菌丝体在经放线菌 t111 发酵产物处理后，随时间的延长及发酵 产物浓度的提高，其电导率并未显著升高，在处理 150min 后，仍与未处理时（即 0 分钟时）无显著差异。而对照药剂嘧霉胺可以使电导率在 5min 内迅速提高，且 随时间的延长，电导率不断增大（图 9 a，b） 。这表明二者的在此方面的抑菌作用 机制有显著不同。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 15 30 60 120 150 时 间 time/min 电导 率 con duc tivi ty（ us/c m） ck 发 酵 液 6.25g/ml 发 酵 液 12.5g/ml 发 酵 液 25g/ml a 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 120 140时 间 （ 分 钟 ）time（ min） 电导 率( s /cm ) ele ctr ica l co ndu cti vit y( s/c m) 0.1g/ml 0.5g/ml 2.5g/ml ck b 图 9 t111 发酵产物对核盘菌菌丝细胞膜透性的影响 19 注：a 发酵产物处理 b 嘧霉胺处理 fig. 9 effect of antifungal substance of t111 on membrane osmotic potential of s. sclerotiorum note: a, antifungal protein of bacillas pumilus strain bsh-4 b, pyrimethanil 4 讨论 在获得一株有效的放线菌后，需要明确其抑菌谱及对靶标致病菌的作用机制。 再根据放线菌的生态习性及将要应用的环境，确定适宜的生产及使用剂型。由于 放线菌具有特殊的生物学及生态学习性在大量发酵生产后如何将其制成高活性、 适宜较长期保存的制剂，是一个亟待研究解决的课题。要克服对环境敏感的放线 菌活菌剂在田间防病效果不稳定的弊端，在实际应用中可以人工改造自然的放线 菌获得具有抗药性的菌株,与低剂量的高效、低毒、低残留的杀菌剂混合使用，这 不仅能够明显提高放线菌的防病效果，也会增加其生态竞争能力。 国内、外防治菌核病菌等核盘类真菌病害的链霉素菌株尚不多见，董美玉等 20分离到一株能够拮抗油菜菌核病菌的放线菌株zy105，在高温、强酸和强碱的环 境下抑制活性变化不大。齐艳春 21从土壤中分离到一株黄色链霉菌a01，喷施a01 发酵液，有效降低了甜叶菊斑枯病病情指数，防效达56.3%，且明显提高了甜叶菊 叶片产量，平均增产18.7%。另外，曾庆飞 22等利用放线菌菌株da07118发酵液用 于根结线虫的防治，对根结线虫的击倒率在93.7%。本实验室分离获得的黄色链霉 菌t111除了对黄瓜菌核病菌表现出强烈的抑制活性外，对棉花红腐病菌等11种供 试菌均表现出不同程度的抑制；另外t111发酵液的热稳定性、贮存稳定性、紫外 光稳定性良好，在对菌核病等真菌病害的生物防治上具有一定的应用潜力。 关于放线菌发酵液对核盘菌的作用机制的探索，国内外的文献的报道非常有 限，多数文献只是从发酵液对病原菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用入手，探索 其对病原菌菌丝造成生长缓慢，扭曲，肿大，畸形，有的顶部出现膨大的泡囊， 有的原生质体外露 23。因而使菌丝不能向前扩展，失去了侵袭能力。同时产孢能 力下降，孢子萌发率及芽管长度下降。这可能与发酵液抑制菌丝和孢子的呼吸作 用有关。有报道杀稻瘟菌素-s 便是通过抑制孢子和菌丝的呼吸作用而强烈抑制孢 子萌发和菌丝生长的 24。此外，发酵液造成敏感菌菌丝尖端形成膨胀泡而破裂， 原生质外泄，从而造成溶菌现象，这可能是由于发酵液中的活性物质作用于病原 菌的细胞壁、细胞膜，造成细胞壁、细胞膜破裂而引起的，有此类现象的抗生素 很多，研究清楚的为多氧霉素-d 和多烯类抗生素，多氧霉素主要是作为几丁质合 20 成酶的竞争性抑制剂抑制几丁质的合成从而破坏病原菌的细胞壁。多烯类抗生素 通过与质膜中含有的麦角醇作用损伤细胞质膜造成细胞内物质泄漏，而使菌体减 少造成溶菌，而放线菌 t111 发酵产物处理黄瓜菌核病菌菌丝体，随时间的延长及 发酵液浓度的提高，其电导率并未显著升高，在处理 150min 后，仍与未处理时 （即 0 分钟时）无显著差异，这表明发酵液对细胞壁、细胞膜的作用极小，不同 于以往研究的放线菌产生的抗菌物质。关于其抑菌作用机制，还要进一步研究。 5 参考文献 1 王玉菊, 祁红英, 等. 植物土传病害的微生物防治研究进展j.世界农业, 1995, 1: 37-39. 2 baker k. f. evolving concepts of biologi