硕士论文-三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究.pdf

广西大学 硕士学位论文 三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究 姓名：李春玲 申请学位级别：硕士 专业：化学工艺 指导教师：韦藤幼 20080701 三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究 摘要 三七是我国的传统珍贵药材，三七中皂苷成分是三七的主要有效成分， 总皂苷( p n s ) 含量达1 2 ，其中尤以人参皂苷r 9 1 和r b l ，三七皂苷r l 含量最高。此外，还含有非皂苷成分，如挥发油、黄酮类、糖类成分等。近 年来，三七广泛应用于内、外科疾病辨证治疗中。三七除了具有传统的止血 补血、消肿止痛，双向调节血糖血脂的功效外，还有抗血栓、抗纤维化活 性、抗炎、抗肿瘤等作用。其在各科l | 缶床应用上发挥巨大作用，是一味具 有广阔开发应用前景的药物。 本文对三七总皂苷的提取纯化工艺进行了系统的研究，采用减压内部 沸腾提取与大孔树脂吸附分离相结合的方法，提取分离三七总皂苷，并对 减压提取及大孔树脂吸附分离的条件进行了优化，最后用结晶法进一步进 行纯化。研究结果表明：无论是提取工艺还是纯化工艺，与其它一些提取 方法和纯化方法相比均有自己的独特之处，而且比传统提取方法的提取得 率和产品纯度都有提高。 本方法的创新点在于：一、采用减压内部沸腾提取与大孔树脂吸附分 离相结合的工艺，具有提取速度快、无需水沉或醇沉工序、收率高、生产 效率及产品质量明显好于传统方法。二、对热敏性成分r b l 的提取取得了 明显的效果。三、采用双注法结晶。采用此法结晶，既可以得到较高纯度 的三七皂苷，又可以保证较高的产品得率。为进一步分离出单体皂苷打下 良好基础。 关键词：三七总皂苷提取纯化 an e wt e c h n i co fe x t r a c t l 0 na n d s e p a rk n q n ( 垤_ 1 4 n a xn o t o g i n s e n g t o t a ls a p o n i n a bs t r a c t p a n a xn o t o g i n s e n g ( p n ) i so n eo ft h ep r e c i o u st r a d i t i o n a lm e d i c i n a lh e r b s i nc h i n a s a p o n i ni st h em a jo ra c t i v ec o m p o n e n ti np n t h ec o n t e n to ft o t a l s a p o n i n sc a l l r e a c ht o12 ，a n dg i n s e n gs a p o n i nr g la n dr b j p a n a x n o t o g i n s e n gs a p o n i nr l a r et h e h i g h e s t i na d d i t i o n ，i tc o n t a i n so t h e r c o m p o n e n t so fn o n s a p o n i n , s u c ha sn a p h t h a ，f l a v o n o i d ，g l u c i d e ，e r e i nr e c e n t y e a r s ，p ni sw i d e l yu s e d t od i a l e c t i c l yt h e r a p yo fm e d i c a la n ds u r g i c a ld i s e a s e s t h ep nh a sn o to n l yt h et r a d i t i o n a le f f i c a c i e so fh e m o s t a s i a , e n r i c h i n gt h eb l o o d ， d e t u m e s c e n c ea n da c e s o d y n e ，r e g u l a t i n gt h eb l o o ds u g a ra n db l o o dg r e a s e i ni n d o u b l ed i r e c t i o n s ，b u ta l s oo t h e re f f i c a c i e s ，s u c ha sa n t i - t h r o m b o t i c ，a n t i f i b r o s i s a c t i v e ，a n t i i n f l a m m a t i o n ，a n t i t u m o r , a n ds oo n i tp l a y sat r e m e n d o u sr o l ei n v a r i o u sk i n d so fc l i n i ca p p l i c a t i o n s i th a sab r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c ti nt h e f u t u r e i nt h i sp a p e r , as y s t e m a t i c a ls t u d yo nt h ep r o c e s so ft h ee x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o no fp a n a xn o t o g i n s e n gt o t a ls a p o n i nw a sg i v e n f i r s t l y , am e t h o d 1 1 i c o m b i n i n gd e c o m p r e s s i n gi n n e re b u l l i t i o ne x t r a c t i o na n dm a c r o p o r o u sr e s i n s e p a r a t i o nw a sd e v e l o p e dt oe x t r a c ta n dp u r i f yt o t a ls a p o n i no ft h ep a n a x n o t o g i n s e n g s e c o n d l 5t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so ft h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n w e r es t u d i e de x p e r i m e n t a l l y f i n a l l y , t h ec r y s t a l l i z a t i o nm e t h o dw a su s e dt o p u r i f yt h es a p o n i nf u r t h e r t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep r o c e s s e so ft h ee x t r a c t i o n a n dp u r i f i c a t i o ni no u re x p e r i m e n t sh a v es p e c i f i ca d v a n t a g e sa n dh i g h e rp u r i t y a n dy i e l dc o m p a r e dw i t hs o m eo t h e rt r a d i t i o n a lm e t h o d s i n n o v a t i o n p o i n t s o ft h i st e c h n i c a r e ：1 ) t h e m e t h o d c o m b i n i n g d e c o m p r e s s i n gi n n e re b u l l i t i o ne x t r a c t i o na n dm a c r o p o r o u sr e s i ns e p a r a t i o nh a s t h e a d v a n t a g e s o ff a s t s p e e de x t r a c t i o n , o m i t t i n gt h ep r o c e s s e s o fw a t e r p r e c i p i t a t i o no ra l c o h o lp r e c i p i t a t i o n , h i g h e ry i e l da n de f f i c i e n c y , a n dg o o d p r o d u c tq u a l i t yi nc o m p a r i s o nw i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d s 2 ) i ti m p r o v e dt h e e x t r a c t i o nm e t h o do ft h et h e m o s e n s i t i v ec o m p o n e n to fr b l 3 ) a p p l y i n gd o u b l e c o l u m n c r y s t a l l i z a t i o nm e t h o d ，w e c o u l d g e th i g h e rp u r i t y o fp a n a x n o t o g i n s e n gs a p o n i na n dk e e ph i g h e rp r o d u c ty i e l d t h e ni ti sag o o db a s i sf o r f u r t h e rs e p a r a t i o no fs a p o n i n k e y w o r d s ：p a n a x n o t o g i n s e n g t o t a ls a p o n i n ；e x t r a c t i o n ；s e p a r a t i o n i v 符号说明 意义 上柱液的浓度 泄漏液的浓度 洗脱液的浓度 上柱液的体积 洗脱液的体积 峰面积 进样量 单位或量纲 m g m 1 , m g m l m g m l m l m i ， 枵 岛 o o 乃 乃 y x 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：李春硷 矿护孑年多月i o 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： c 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 啪口时发布 口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论二作者签名：窖备硷 导师签名：参 加苔年月汐日 三七慧皂：g - 的提率q 爻纯化新工艺研究 1 1 三七及其制品 第一章前言 三七麟n o t o g i n s e n g ( b u r k ) f h c h e n ) 为五加科植物，干燥的根入药。别名山膝、 金不换、田三七、田漆、田七、参三七、血参、人参三七、滇三七。三七用于治疗疾病 已有悠久的历史，在本草纲目以前的医门秘旨和跌损妙方已有记载【l l ，是我国 的传统珍贵药材。三七还是驰名中外的“云南白药”的主要成分，主要功能为活血化瘀、 消肿止痛等，现主要用于心、脑血管系统疾病的治疗。主产于我国云南文山、广西靖西， 多为栽培品。 三七中皂苷成分是三七的主要有效成分，总皂苷( p n s ) 含量达1 2 。迄今为止已从 三七的根块、根茎( 剪口) 、茎叶和花果等各部位分离和鉴定出7 0 余种达玛烷型四环三萜 皂苷，这些单体皂苷成分大多数为达玛烷型的2 0 ( s ) 一原人参二醇型【2 0 ( s ) - p r o t o p a n a x a d i o l 】 和2 0 ( s ) - 原人参三醇型 2 0 ( s ) - p r o t o p a n a x a t r i 0 1 ，但未发现含有齐墩果酸型皂苷，这与人 参和西洋参有显著区别【2 1 。这些单体皂苷中也有很多与人参和西洋参中所含皂苷成分相 同，如人参皂苷i 沁l 、r b l 、r e 、r c 、i m 等，除此以外，也有一些是三七所独有的皂苷 类成分，如三七皂苷r l 、r 2 、r 3 、心、等。其中，尤以人参皂苷l 沁l 和r b l ，三七皂 苷r l 含量最高。化学结构式如下： h 8 i r a 沁r m n i d er 0 - 图1 - 1 人参皂苷r g l 化学结构式 f i g i - it h ec o n f i g u r a t i o no f g i n s e n o s i d ei 沁l 1 三七总毫苷的提取及纯化新工艺研究 o h g i 正s e n o s i d er b e 图1 - 2 人参皂苷r b l 化学结构式 f i g 1 - 2t h ec o n f i g u r a t i o no f g i n s e n o s i d er b l n o t d 1 1 1 暑n o 曩i d r 图l - 3 三七皂苷r l 化学结构式 f i g 1 - 3t h ec o n f i g u r a t i o no f n o t o g i n s e n o s i d er 1 人参皂苷r g l 是原人参三醇皂苷的代表，人参皂苷r b l 是原人参二醇皂苷的代表， 三七皂苷r l 是三七特有的皂苷成分，是三七最具代表性的特征化合物。 此外，还有非皂苷成分：l 、挥发油：从三七挥发油总油分离鉴定出3 4 种化合物【3 】。 2 广西大掌硕士掌位论文三七怠皂昔的提耳u 叉纯化新工艺研究 有倍半萜、脂肪酸、酯类、苯取代物、烷烃等。临床上有止咳平喘、祛痰发汗、驱风解 表、抗茵消炎等功效。2 、三七素( d e n c i c h i n e ) ：很久以来，三七一直作为止血化瘀药应 用，现代研究表明，三七的止血活性物质是一种特殊的氨基酸即三七素( d e n c i c h i n e ) ，它 的结构是p n 7 , - - 酸酰基- l 吨，p - 二氨基丙酸( p - n - o x a l o l a ，p d i a m i n o p r o p i o n i ca c i d ) ，现 已能够人工合成 4 i 。3 、黄酮类成分：如三七黄酮、三七黄酮苷( 山奈酚3 0 半乳糖0 葡 萄糖) ，槲皮素等，槲皮素能增强心脏收缩力，减少心脏搏动数【5 】。4 、甾醇成分。5 、聚 炔醇类成分：林琦等 6 1 从三七的石油醚提取物中分离得到2 个聚乙炔醇类化合物。6 、糖 类成分：从三七根中分离出一种三七多糖a ( s a n c h i n a m a ) ，另外三七中也有蔗糖等糖类 成分。7 、氨基酸成分：三七含有1 9 种以上的氨基酸【j 丌，有8 种人体必需的氨基酸，占 三七总氨基酸含量的3 2 6 9 。8 、有机酸。9 、环二肽成分和人参内酰成分及其它成分： 谭宁华等【8 1 从三七中分离出1 4 种环二肽成分。l o 、无机成分：郝南明掣明对三七不同部 位中的微量元素进行测定分析。三七的根、茎、叶中含有丰富的人体必需m g 、p 、c a 、 m n 、n a 、f e 、c o 、c u 、z n 、m o 、g e 、s e 等有益元素。 三七的化学成分和药理作用与人参相似，而其治疗外伤和心血管病的功能则是人参 无法比拟的。近年来，经科学实验研究得知主要有效成分后，三七广泛应用于内、外科 疾病辨证治疗中【l 们。三七具有止血补血，通脉行瘀，消肿止痛，双向调节血糖、血脂的 功效。还有抗血栓、抗休克、抗纤维化活性、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力和保 肝利胆等作用。己开发出“三七冠心宁片”、“血塞通”、“七叶神安片”等商品药【1 1 1 ，对治 疗心、脑血管疾病及中枢神经系统疾病，疗效显著。三七所含每种化合物和单体分子物 质的药理性及临床治疗靶向性都各不相同，具有多病谱、标本兼治、多向调节、防治结 合的临床意义，特别是对三七的双向药理作用解释已经达到分子水平【1 2 1 。三七必将在各 科临床应用上发挥巨大作用，是一味具有广阔开发应用前景的药物。 1 2 本课题研究的背景、目的和意义 近年来，随着中药药剂学的发展，三七皂苷的作用与功效日益受到瞩目，临床应用 越来越广泛，使该药物制剂、剂型得到不断增加和更新，制药企业纷纷提高标准，申报 国家新标准。目前，单体皂苷的全合成还未成功，仍需从三七根、茎、叶等部位提取以 满足医疗需要。而且，由于单体皂苷作用不同，有必要制成单体皂苷制剂来研究其生物 活性，因而对中药的提取、分离、纯化工艺新技术提出了更高的要求。 广西大掌硕士掌位论文三七急皂苷的提取及纯化新工艺研究 目前国内外对该课题进行了广泛的研究。在提取方法上主要采用：l 、传统的提取 方法：常用的有渗漉法、浸渍法、煎煮法、回流提取法；2 、现代的提取方法：如：超 声波提取法、超临界提取法、酶法提取法、微波辅助提取法、加速溶剂提取法等。在传 统的提取法中，其中浸渍法和渗漉法属于冷提法，适用于对热不稳定或易被破坏成分的 提取，含淀粉、果胶、粘液质等杂质较多的中药提取同样可选择浸渍法和渗漉法。但因 其提取时间长、消耗溶剂多，提取效率低于热提法。煎煮法、回流提取法属于热提法， 提取效率高于浸渍法、渗漉法，但只适用于对热稳定的成分的提取。三七中含有大量淀 粉，且含有热敏性有效成分，因此用上述四种方法提取各有利弊。文献显示，回流提取 适合三七总皂苷类成分的浸出，优于渗漉法、浸渍法，煎煮法含量最低。但回流提取法 存在不可忽略的问题：溶剂消耗大，加热时间长，热敏性有效成分的损失，提取率低， 杂质含量多，给后续分离纯化带来困难。 现代的提取方法较传统提取方法而言，具有简便、快速、溶剂消耗少，提取率高、 提取物有效成分含量高、无污染等特点，但现代的提取方法所需设备复杂昂贵、实验条 件要求较高、运行成本高、难以普及，有些方法还有一定的局限性，很难实现工业化生 产。目前，大规模应用在工业生产上的仍为传统的回流提取法。 三七总皂苷分离纯化工艺种类繁多，它包括有：溶剂法、沉淀法、柱层析法( 硅胶、 氧化铝、大孔吸附树脂等) 、结晶法等。其中大孔树脂吸附分离工艺是对中药提取纯化 工艺影响大、带动面最广的技术之一。该工艺操作简便，成本较低，树脂可反复使用， 适合工业生产。大量文献显示，用大孔吸附树脂提取精制三七总皂苷，所得产品纯度高， 提取率高，质量稳定，成本低。可作为分离纯化三七总皂苷的一种有效手段。但大孔树 脂吸附分离技术存在缺点：1 、对提取液纯度有一定要求，杂质含量较多的提取液需经 过前处理方能上柱。2 、只适用于产品的粗分离，如需更高含量的产品还需要再处理。 本课题的研究重点就是克服传统工艺的不足，经过分析比较寻找到一种省时、操作 简单、设备要求低、成本低廉、污染指数不高并适用于大规模工业生产的提取及分离纯 化方法。本实验主要是应用减压内部沸腾法提取三七中的有效成分一总皂苷，该方法 可降低浸膏中所含的杂质，并能缩短提取的时间。因提取时间短、温度低，杂质含量少， 提取液无需处理就直接上柱，达到提取大孔吸附树脂纯化有效结合。上柱液经简单 洗脱、结晶，则可得到纯度较高的皂苷，为进一步分离出单体皂苷打下良好基础。 4 三七总粤苷的提取及纯化新工艺研究 1 3 本课题研究的内容 为了获得更好的提取效果，同时又更容易实现工业生产，本文在课题小组前面所做 的研究方法的基础上进行了延伸，把减压内部沸腾提取与大孔树脂吸附分离相结合，对 三七总皂苷进行了提取与分离。 ( 1 ) 采用减压内部沸腾提取工艺：由于三七根中淀粉的含量较高，为了避免淀粉 糊化，目前主要采用醇提，然后采用水沉和大孔树脂吸附分离的工艺。醇提过程乙醇消 耗量大，水沉过程中有效成分损失多，经济效益不明显。本文采用减压内部沸腾提取： 首先将干燥后的三七原料用一定浓度的乙醇在室温下解吸一段时间，待解吸充分后，加 入一定温度热水，同时迅速降低提取压力，使物料内部有少量汽泡溢出，实现内部沸腾 强化提取，提取两次。这个提取方法可以使物料在较低的温度下沸腾汽化，降低浸膏中 所含的杂质，并能缩短提取的时间。与传统法【1 3 】相比，生产效率及产品质量都有明显的 提高。 ( 2 ) 大孔树脂纯化：提取液经浓缩后，直接采用大孔树脂进行吸附分离。纯化过 程要考虑的条件有：树脂的选择、上样浓度和上样量的选择、上样流速的选择、洗脱剂 浓度选择和洗脱剂用量以及洗脱流速的选择。 ( 3 ) 双注法底物结晶提纯：将三七解吸液用水饱和正丁醇萃取后，浓缩，然后与 丙酮同时慢慢加入具有一定量的丙酮底物中进行双注入法结晶，该法可以得到较高的产 品纯度和得率。 本研究的创新点是：一、采用减压内部沸腾提取与大孔树脂吸附分离的结合，可以 省去水沉或醇沉工序，生产效率及产品质量明显好于传统方法。而且由于存在热敏性成 分r b 。，减压低温提取对三七是比较适宜的。二、采用双注法结晶。采用此法结晶，既 可以得到较高的产品纯度，又可以保证较高的产品得率。由于本法具备以上的优点，从 而为实现以后的工业化生产奠定了良好的基础。 5 三七忘皂苷的提邱。瓦纯化新工艺研究 2 1 三七的提取方法 2 1 1 三七的传统提取方法 第二章文献综述 溶剂提取法：溶剂提取法的原理是根据各种成分在溶剂中的溶解度的不同，选用适 当的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。常见的提取溶剂可分为三类： 1 、水2 、亲水性的有机溶剂3 、亲脂性的有机溶剂。用于三七总皂苷提取的溶剂主要有 乙醇、甲醇、丁醇、石油醚、氯仿等。 2 1 1 1 煎煮法 煎煮法是我国最早使用的传统提取方法。操作时将中药粗粉放在适当的容器中( 如 砂锅、金属夹层锅等，应避免铁器) ，加水浸过药面，充分浸泡后，直火或蒸气加热煮 沸，一般煮2 “ - 3 次，每次0 5 h “ - “ l h ，使其有效成分煎出，这是制剂中常用的浸出方法 之一。此法方便易行，能煎出大部分有效成分，但煎出液中杂质较多，容易霉变、腐败， 一些不耐热及挥发性成分在煎煮过程中易被破坏、挥发而损失。煎煮法对提取三七多糖 有利，但三七中含有大量淀粉，提取时不宜采用水煎煮法，以免糊化，过滤困难，且容 易造成皂苷水解。 2 1 1 2 浸渍法 浸渍法是简便而最常用的一种浸出方法。除特别规定外，浸渍法在常温下进行，如 此制得的产品，在不低于浸渍温度条件下能较好的保持其澄明度。浸渍法尤其适合于有 效成分遇热易挥发和易破坏的药材。中国药典应用的三七提取方法是冷浸法，但较为费 时，且往往不易完全浸出有效成分。区洁雯【1 4 j 比较三七叶总皂苷提取的煎煮法与浸渍法， 具体做法：l 、采用不同水量( 1 0 倍、1 5 倍、2 0 倍) 煎煮l 小时，滤液浓缩成膏，烘干、 称重，测定三七叶总皂苷含量，计算皂苷收率。2 、采用不同水量( 1 0 倍、1 5 倍、2 0 倍) 冷浸2 4 k 滤液如上处理。结果：1 5 倍量的水冷浸2 4 h 的三七叶皂苷含量最高，且 总皂苷收率最高。 6 三七总j 鲁昔的提取及纯化新工艺研究 2 1 1 3 渗漉法 渗漉、法【”】其设备简单，操作安全，减少成分破坏，有煎煮法不可比拟的优点。该 法浸出效果优于浸渍法，提取也较完全，而且省去了分离浸出液的时间和操作。但其操 作仍然很费时。闰光军【1 5 】等以粉末粗细、乙醇浓度、乙醇用量、渗漉速度作为考察的四 个因素，采用正交试验，以三七总皂苷的含量为考察指标，采用分光光度法以人参皂苷 r 9 1 为指标成分进行测定，得出最优工艺：用三七中粉( 过2 0 目筛) ，1 5 倍量的7 5 乙 醇，渗漉速度为5 m l m i n 进行提取，三七总皂苷含量平均为1 0 2 5 ，提取率为9 3 1 ， 可认为已基本提尽。 2 1 1 4 回流提取法 回流提取法为两种，一种是回流热浸法：是在应用乙醇等易挥发的有机溶剂进行加 热提取有效成分时，为了减少溶剂的消耗，提高提取效率而采用的提取方法；另一种是 循环回流冷浸法：采用少量的溶媒，通过连续循环回流进行提取，使药物有效成分充分 提取( 即索式提取法) 。樊钰虎【1 6 l 三七醇回流提取的最佳工艺条件为：药材加5 0 乙醇 浸泡4 0 r a i n ，加醇量为药材的8 倍量，回流2 次，每次2 h 。 以上四种传统的提取方法，是目前提取三七总皂苷的主要方法。张杰【17 】等对上述这 四种提取方法做了比较。具体操作( 1 ) 煎煮法：取三七粗粉l o o g ，加8 倍量水，浸泡 0 5 h ，加热煎煮2 h ，过滤；药渣再加7 倍量水，煎煮2 h ，过滤，合并两次滤液，浓缩， 定容至2 5 0 m l ，备用。( 2 ) 回流法：取三七粗粉l o o g ，加8 倍量7 0 乙醇，浸泡0 5 h ， 回流2 h ，过滤；药渣再加7 倍量7 0 乙醇，加热回流2 h ，过滤，合并两次滤液，减压 回收乙醇，定容至2 5 0 m l ，备用。( 3 ) 渗漉法：取三七粗粉l o o g ，以7 0 乙醇为溶媒， 参照中国药典 2 0 0 0 年版一部附录i o 流浸膏剂项下试验，浸泡2 4 h ，流速为3 0 m l m i n 收集渗漉液1 5 0 0 m l ，减压回收乙醇，定容至2 5 0 m i , ，备用。( 4 ) 浸渍法：取三七粗粉l o o g ， 以7 0 乙醇为溶媒，4 0 “ c 温浸3 次，每次加5 倍量，温浸4 8 h ，过滤，合并3 次滤液， 减压回收乙醇，定容至2 5 0 m l ，备用。选择人参皂苷r g l 为考查指标。提取工艺研究结 果表明，醇提优于水提，且回流法优于渗漉法、浸渍法，煎煮法含量最低。故应选择三 七回流提取工艺进行优选。最佳工艺为以7 0 乙醇为溶媒，提取2 次，第一次加6 倍量， 回流2 h ，第二次加5 倍量，回流1 5 h 。 高春波 i s l 对煎煮法、回流法、渗漉法、超声提取法也做了比较。具体操作( 1 ) 水煎煮法：取三七药材适量，精密称定。加1 0 倍量水，煎煮2 次，每次1 5 h ，合并药 液并定容到2 5 0 m l 。( 2 ) 醇回流法：取三七药材适量，精密称定。加1 0 倍量6 0 乙醇 7 三七患皂苷的提邳乙孔纯化新工艺研究 回流提取2 次，每次1 5 h ，合并药液定容到2 5 0 m l 。( 3 ) 渗漉法：取三七药材适量，精 密称定。以6 0 乙醇为溶媒，参照中国药典2 0 0 0 年版一部附录i o 流浸膏剂项下试 验，浸泡2 4 h ，收集1 0 倍量渗漉液，定容到5 0 0 m l 。( 4 ) 超声提取法：取三七药材适 量，精密称定。加5 倍量6 0 乙醇，超声提取2 次( 功率1 5 0 w ，频率3 0 h z ) ，每次2 0 m i n ， 合并超声液，定容到2 5 0 m l 。以不同提取方法所得皂苷类成分r g l 和r b i 含量做比较， 醇回流法提取所得r g l 和i l 含量均高于其他方法。结论：回流提取适合总皂苷类成分 的浸出，三七醇回流提取优化条件为：药材加6 0 乙醇浸泡1 0 h ，回流提取2 次，每次 2 o h ，第1 次加醇量为药材的1 0 倍量，第二次加醇量为药材的8 倍量。 2 1 2 三七的现代提取方法 现在广泛关注的现代提取方法，如微波【1 9 五1 1 、超声波及超临界提取等，提取速度快 及得率高，但要实现工业化，目前的生产成本还较高。 2 1 2 1 超声波提取 超声波是一种高频机械波。频率范围在1 5 - 、一6 0 1 d - i z 的超声常被用于过程强化和引 发化学反应。利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物溶 出速度和溶出次数，缩短提取时间的浸取方法。该法有利于提高效率，且不影响中药中 有效成分的结构，省时，省溶剂，步骤简单，提出杂质少，超声波在人参上提取皂苷已 有研究【2 2 2 3 1 。在索氏提取中加入超声波提取葵花籽中的总脂肪，提取时间减少了一半， 提取得率提高了近5 0 l z 4 j 。同时也可以直接利用超声波，从玉米中提取木聚糖，同传统 碱水提法相比，提取得率提高了4 0 1 2 5 l 。 马妮等【2 6 】采用高效液相色谱( h p l c ) 法比较不同超声提取时间与常规浸泡对三七皂 苷的提取率。结果：三七中皂苷的提取率随超声提取时间的增加而增加，在0 5 h “ - - 8 h 的时间范围内差异不显著，和常规浸泡相比，超声提取缩短提取时间数十倍，提取率略 高于常规浸泡，但也无显著差异。结论：超声法提取三七皂苷能显著提高提取效率，采 用超声提取0 5 h “ - - l h 可以代替常规浸泡3 6 h 处理的方法【2 6 1 。 马银海【2 7 】等采用正交实验法对三七皂苷( r l + r 9 1 ) 超声提取条件进行优化，拟筛 选出三七超声提取的最佳方案为：超声提取温度4 5 “ c ，超声时间3 0 m i n ，提取次数2 次， 乙醇体积分数8 5 。按优选的最佳工艺实验5 次，精制三七皂苷平均收率达到1 6 3 ， 为常规浸提法的2 倍。 8 三七总皂苷的提耳乙及纯化新工艺研究 周琳【2 s 】等以三七提取液中总皂苷的含量和提取物得率为指标，考察到超声复合酶法 所得三七总皂苷含量和提取物得率均较高，提取工艺稳定，因此选择该方法进行工艺条 件优选。最佳提取工艺：在p h 为4 5 ，酶解温度为5 0 ，酶解时间为2 5 h 条件下，纤 维素酶用量为1 5 u g ( 生药) ，果胶酶用量为1 4 0 u g ( 生药) ，超声时间为9 0 r a i n ，加水 量为8 倍量。所得三七提取液中总皂苷的含量为1 0 3 3 ，提取物得率为3 5 1 7 。 超声波提取有如下特点：超声波提取节省时间，通常回流提取和煎煮耗时大于l 小 时，而超声波提取则可将提取时间缩短为2 0 “ - - 3 0 r a i n 。超声波提取时不需加热，避免了 常规煎煮法、回流法等长时间加热对有效成分的破坏，适用于对热敏物质的提取。提取 物有效成分含量高，有利于进一步精制。 超声波提取设备的工程化是其向产业化发展的最大障碍，由于没有适合大生产的提 取设备，目前有关超声波提取的研究报道所用的设备绝大部分都是普通的超声波清洗 器，该设备现为化学实验室中的常规设备，应用起来比较方便，对于少量样品的分析具 有无可比拟的优势。但其样品处理能力太小，达不到工业生产的要求。这种条件下得出 的结论，还需要得到大生产的验证。因此，如何尽快研究出能满足工业生产要求的超声 波提取设备，是使超声波提取走向产业化亟待解决的问题。 2 1 2 2 微波辅助萃取法 微波辅助萃取是颇具发展潜力的一种新的萃取技术 2 9 , 3 0 l 。微波萃取是高频电磁波穿 透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，微波能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升， 当细胞内部压力超过细胞壁承受能力，细胞破裂，细胞内有效成分自由流出，在较低的 温度下溶解于萃取媒质再通过进一步过滤和分离，便获得萃取物料。在微波辐射作用下 被萃取物料成分加速向萃取溶剂界面扩散，从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃 取温度，最大限度保证萃取的质量。微波萃取效率高、纯度高、能耗小、操作费用低， 符合环境保护要求【3 1 。3 3 1 。可广泛用于中草药、香料、保健品、食品、化妆品、茶饮料、 调味料、果胶、高粘度壳聚糖等行业。 郭子杰【蚓等以三七为研究对象，以皂苷百分含量为指标，应用正交实验法，研究了 微波对三七中皂苷浸取作用的影响效果。结果表明：8 0 甲醇是较理想的提取溶剂，并 且微波强化浸取的最佳工艺条件为：辐射功率6 0 0 w 、辐射时间1 0 r a i n 、料液比l ：4 。 经过微波处理后，三七中皂苷物质的浸取速度至少是未经微波处理的4 倍。因此提取效 率得到了较大的提高。 9 三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究 沈岚等【3 5 1 探索了微波萃取对不同形态结构植物及含不同极性的有效成分的提取规 律，结果，微波提取法对大黄中不同极性葸醌类成分的提取选择性并不明显，而同一温 度下，根茎类中药大黄中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的提取率明显高于种子类中药决 明子中相同成分的提取率。此外采用本法辅助提取金银花中的绿原酸和桂皮中的肉桂醛 等【3 6 期，均取得较好提取率。 微波对某些化合物有一定的降解作用，所以提取时应严格控制提取时间，不可长时 间提取。对于富含淀粉的药材，采用本法提取易产生糊化现象。在应用时还需考察微波 加热的均匀度，选择合理的提取工艺条件。另外，微波提取法设备投资费用较高，产品 的成本费用也较高，同时微波泄露对操作者影响很大，对人体，尤其对眼睛有影响，应 用时需注意微波的泄漏和防护【3 6 1 。 2 1 2 3 酶法提取 酶法是通过加入某些特定的酶，使包裹于植物细胞内的有效成分转移到溶剂中。如 采用半纤维素酶和果胶酶提取桔子、甜西红柿和胡萝l - 中的类胡萝卜素，同传统法比较 能显著提高提取时间和得率p 酊。隋晓等【4 1 1 均匀设计优化纤维素酶解提取三七中有效成分， 影响酶解效率的因素大d , j 颐序为酶解时间 纤维素酶用量 酶用量与酶解时间的交互作 用。前两者的影响呈二次曲线模型而后者呈负相关。最优条件为0 4 7 h ，2 8 6 u g ( 生药材) ， 预期试验结果最大值为9 6 2 m g 。采用0 5 h ，3 0 u 进行实验，结果总皂苷含量为8 1 2 3 m g ， 比同提取条件不加酶工艺提取率提高1 3 9 。结论：纤维素酶可提高三七中有效成分的 提取率，确定酶解工艺为3 0 u g ( 生药材) ，0 s h 。 酶法提取技术同时也存在着一定的局限性。酶法提取对实验条件要求较高，为使酶 发挥最大作用，需先通过实验确定最佳温度、p h 值及最佳提取时间等，还需要考虑酶 的浓度、底物的浓度、抑制剂、激动剂等对提取物的影响，以及酶对植物中其它成分、 药效和毒性的影响。 2 1 2 4 加速溶剂提取法 加速溶剂提取技术是近年来发展起来的一种新的样品提取技术，它具有提取时间 短、溶剂消耗少、提取效率高、操作模式多样化以及操作过程自动化等诸多优点，并已 广泛地应用于环境3 9 , 4 0 l 、食品【4 1 4 2 】、药物【4 3 , 4 4 1 等诸多领域。其主要原理m 是在密闭容器 内，通过升高压力使提取溶剂的沸点升高，使得提取过程可以在高于正常溶剂沸点的温度 下进行。 李鹏等e 4 6 1 同时采用总皂苷以及人参皂苷r b l + r g l 作为考查指标，首次用单因素考察 1 0 广西大学硕士学位论文三七总毫，昔的提昂爻纯化新工艺研究 法对影响加速溶剂提取三七皂苷类成分的因素进行优化。优选出三七皂苷类成分加速溶 剂提取的最佳条件为：以甲醇为溶剂，药材粒径为0 3 0 4 5 m m ，提取温度1 5 0 ， 提取压力6 8 9 5 m p a ，提取1 5 r a i n ，提取1 次。结果表明，a s e 与索氏提取相比，提取 率相当。但毕竟这项技术在中药质量控制中的系统研究还刚刚起步，尤其是中药化学 成份复杂，化学性质多样化，其适用范围的选择、提取条件的优化以及与其它分析技术 的联用等都是考察的重点【4 7 】。 温度是影响加速溶剂提取效率最主要的因素。首先，升高温度可增加溶剂的溶解性 能。其次，升高温度可以加快分子扩散的速度，从而加速整个提取过程的质量转移。另 外只有在一定的压力下溶剂才可能保持在液体状态，保证提取的顺利进行。因此高温对 加速溶剂提取是有利的。但对三七皂苷的提取，尤其对于热敏性成分r b l 提取不利。 2 1 2 5 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取技术( 简称s c f e ) 是一种以超临界体( 简称s c f ) 代替常规有机溶剂对 中草药有效成分进行萃取和分离的新型技术，其原理是利用流体( 溶剂) 在临界点附近某 区域( 超临界区) 内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质 的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，利用这种s c f 作溶剂，可以 从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分。c 0 2 是最常用的超临界流体。 超临界流体萃取技术萃取能力强、提取效率高、生产周期短，极少损失易挥发组分 或破坏生理活性物质，易于发现中药中新的活性成分，且无溶剂残留，产品质量高。 居靖等【铝】用超临界c 0 2 萃取三七的脂溶性化学成分，分析并测定提取物的主要成分 及其含量。结果：萃取最佳条件为：萃取釜压力3 0 m p a ，萃取温度4 8 ，分离釜i 压 力8 m p a 、分离温度3 0 ，分离釜i i 压力5 m p a 、分离温度3 0 ，萃取时间2 o h ，c 0 2 流量3 5 k g m ，三七颗粒度6 0 目；经气相色谱质谱联用法分析，超临界c 0 2 萃取物与乙 醚溶剂直接提取物的组成有显著不同，检出多种炔醇类成分，包括人参炔醇( 5 9 5 ) 。 结论：用超临界c 0 2 萃取三七，可以较好的获得其脂溶性成分，提取物可以供进一步深 入研究。 超临界流体萃取技术设备属于高压设备，一次性投资较大，运行成本高。目前，在 工业化生产中，已有部分大型中药制药企业应用，但还难以普及。同时，超临界流体萃 取主要提取脂溶性成分，对水溶性成分的提取具有局限性。 2 1 2 6 中药水提取技术 中药水提取技术【4 9 】完全不同于中药产业中目前普遍采用的溶剂法( 如水提，醇提， 三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究 水提醇沉，醇提水沉等) ，也不同于目前正在兴起的溶剂树脂混合法。在技术应用上， 中药水提取技术起点高于现行方法。王兴文【例等以水为溶剂，应用生物酶、发酵、组合 大孔吸附树脂、脱色树脂、离子交换树脂等现代科学技术从三七中提取、分离、精制、 纯化三七总皂苷。 中药有效成分的成功分离与提纯，提取液的前处理是关键。该技术中水提取的三七 总苷，不能直接上膜分离机或吸附柱进一步分离纯化，必须经过生物酶工程提取【4 9 】( 利 用a 、b 、c 、d 系列生物混合酶及处理剂可有效地使目标物分解溶出，控制非目标物的 溶出( 如蛋白、鞣质、色素、胶体) ，破坏淀粉类物质，使糊化分子链断裂，利于过滤) 固液分离絮凝技术( 配合适当的沉淀剂，有效地产生絮凝，达到脱色、净化， 目标物与非目标物的液、固分离得很好的效果) 盼离液，滤液才可直接上膜分离机 或吸附柱进一步分离。 2 1 2 7 减压内部沸腾法 文献【5 0 】提出采用内部沸腾法提取植物有效成分，该法先用乙醇溶液渗透植物细胞组 织，使细胞内部的有效成分充分解吸；然后突然加入温度高于乙醇溶液沸点的提取溶剂， 使渗透到细胞内部的乙醇来不及扩散就在细胞内部沸腾，在强化过程提取的同时，为了 降低渗透到细胞内部的乙醇沸点，降低提取温度，文献【5 l 】提出了减压内部沸腾的方法， 对金银花进行了提取，取得了较好的效果。减压内部沸腾法【5 l 】与现有的提取技术相比， 该方法的优点是：提取时间缩短5 倍以上，通过减压可实现6 0 以下快速提取，使提取 液中淀粉、多糖、蛋白质、树脂等杂质含量降低1 5 以上，对热敏性有效成分提取率可 提高1 0 以上。 2 2 三七的分离纯化方法 用各种方法提取三七所得的提取液是包含诸多成分的混合物，要想得到相对较纯的 三七皂苷，尚需经过反复的分离精制和纯化处理。常用方法有以下几种。 2 2 1 溶剂法 溶剂分离法一般是将总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，按极性由小到大的 顺序分步进行提取分离。各组分依其在不同溶剂中溶解度的差异得到分离。通过分离不 同极性部分，有利于进一步结合临床或药理试验，确定有效部位，再进行逐步划分追踪， 1 2 三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究 最后分离得到单体。 目前在研究不明成分时溶剂分离法仍最为常用。如传统的醇沉法、有机溶剂萃取法。 韩金玉等1 5 2 1 研究了正丁醇萃取法对三七皂苷r b 3 的精制作用。 但这种方法操作手续繁琐，相同成分可能会分散在不同的提取部位，不易于浓集， 影响药理试验的灵敏性，且较大地限制了微量成分、结构性质相似成分的分离纯化。可 作为大孔吸附树脂等分离纯化手段的前处理。 2 2 2 沉淀法 沉淀法是指在天然药物的提取液中加入某些试剂，使产生沉淀或降低溶解性而从溶 液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。常用韵沉淀法有试剂沉淀法。试剂产 生沉淀的性质，利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或溶剂， 使生成沉淀，与其他成分分离。黄桂宽等【5 3 】在三七茎叶皂苷提取与纯化的实验中用碱性 助沉剂代替有机溶剂，利于除去大量叶绿素等杂质，大大节约成本与时间，减少环境污 染，产品纯度高。 2 2 3 泡沫分离法 泡沫分离【5 5 】是以气泡作分离介质，利用被分离物质在气液两相界面吸附性质的差异 来富集分离溶液中表面活性物质，是泡沫分离的现代研究。实验表明三七皂苷是表面活 性物质，因其分子结构中亲水的配糖部分与亲脂的皂苷元所表现出的亲水性与亲脂性达 到分子内动态平衡。另外，三七水溶液中还有三七多糖、三七黄酮、多种氨基酸、多肽 及无机盐等，这些物质均不是表面活性物，因此可根据它们表面活性差异用泡沫吸附来 富集分离三七皂苷，残余液相因没有被有机试剂污染可直接利用。王良贵等瞰l 对三七粗 提液进行泡沫分离，实验结果表明，在p h = 7 0 0 ，进料浓度2