硕士论文-好氧反硝化细菌的分离鉴定及其应用研究.pdf

华中师范大学 硕士学位论文 好氧反硝化细菌的分离鉴定及其应用研究 姓名：李平 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：刘德立 20051201 顽士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 反硝化是硝酸盐或亚硝酸盐被还原成n ：0 或n 。的过程。细菌反硝化包括4 个还原 步骤，分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氢还原酶催 化完成。传统理论认为，细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程。然而，二十世纪8 0 年代，r o b e r t s o n 等人好氧反硝化细菌的发现以及随后人们对好氧反硝化机制的研 究突破了传统认识，为废水处理工作者设计处理工艺提供了新的理论和思路，具有 广泛的应用前景。研究表明，自然界蕴藏着丰富的好氧反硝化细菌，可在不同的环 境( 灌渠、水池、土壤以及活性污泥) 中大量分离。现已发现许多菌属如产碱菌属 ( a l c a l i g e a e 曲、副球菌属( p a r a c o c c u 曲和假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 都存在好氧反 硝化现象。本文从武汉市郊某纺织厂排污口以及武汉市郊某养猪厂排污口筛选分离 出两株脱氮能力较强的菌株，分别命名为h s 0 4 3 、h s 0 4 7 。对这两株新筛选的细菌 以及实验室原有细菌h s 0 3 的反硝化能力的进一步研究表明：在特定的培养基中， 三株细菌均具有较强的反硝化能力，能分别在1 2 1 8 & 时内将1 0m m 的硝酸盐完全去 除。在降解含氮废水中过程中，添加与不添加、添加不同的碳源以及不同浓度的f j + 和m 0 0 4 2 - 对菌株的降解能力都有很大的影响。在只添加碳源( 丁二酸钠) 时，三株 细菌能分别降解或共同降解含氮废水中1 0m m 的硝酸盐1 0 4 0 。细菌h s 一0 3 与真菌 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 组合，能在6 天内降解含氮废水中1 0m m 的硝酸盐9 8 以上。细菌h s 0 3 与真菌米益霉协同反硝化的效率高于两者单独的反硝化率。在同 时添加碳源以及微量的f e “和m 0 0 4 2 情况下，菌株降解含氮废水的能力有很大幅度 的提高。在添加1 0 0m mf e 2 + 以及1n mm 0 0 4 2 “ 的情况下，细菌h s 0 3 、h s 一0 4 3 和 h s 一0 4 7 以丁二酸钠或乙醇为碳源时，能分别在1 1 2 4 d “ 时内将废水中1 0m m 的硝态氮 去除9 8 以上。对三株细菌的生理生化鉴定、分子水平的鉴定分析以及系统发育分 析表明：细菌i - i s 一0 3 与h s 0 4 7 均属于假单胞菌属中的不同种，分别属于ps t u t z e r i ( 施 氏假单胞菌) 和p p s e u d o a l c a l i g e n e s ( 类产碱假单胞菌) ，细菌h s 0 4 3 属于d e l f t i a a c i d o v o r a n s ( 食酸丛毛单胞菌) 。细菌h s 0 3 与h s 0 4 7 的亲缘性较高，而细菌h s 一0 4 3 与细菌h s 0 3 和h s 一0 4 7 的亲缘性相对较低。到目前为止，食酸丛毛单胞菌关于其降 解硝酸盐、亚硝酸盐的特性国内外几乎从未见报道。对三株细菌降解含氮废水的研 究，为高效、经济地处理含氮废水提供了切实可行的技术资源和理论基础。并为生 物快速脱氮净化水处理提供了有用的菌源。三株细菌分别筛选于不同的自然环境， 对三株细菌降解废水能力的应用研究，将有利于合理开发利用自然资源，保护自然 生态环境。 一氧化二氮( n ：0 ) 的排放是导致目前全球气候变暖和大气平流层臭氧损耗的主 要因素。一氧化二氮给生态环境和人们身体健康带来严重危害，已引起各国私 学家 们对它的重视。开展对一氧化二氮还原酶的研究，具有重要的实际意义。本文对反 硝化细菌一氧化二氮还原酶的结构基因n o s z 趋k 行了克隆表达研究。以细菌 只s t u t z e r ih s 一0 3 核d n a 为模板，根据g e n b a n k 中的ps t u t z e r in o s 2 基因序列( 登 记序列号为m 2 2 6 2 8 ) 设计引物进行p c r 扩增，得到约1 5 0 0b p 的片断。将p c r 产物经 纯化后与质粒p m d l 8 一t 连接，构建重组质粒。经b a m i 和t t i n d 酶切鉴定证实构建 成功。且经k p n i 酶切鉴定出有目的片段插入方向不同的两种重组质粒。选择正确 方向的克隆经b a m h i 和肌力0 i 消化后与质粒p e t 2 8 连接构建重组表达质粒。经b a m t i 和肌门口= 【i i 酶切鉴定证实构建成功。将重组表达质粒转化到大肠杆菌b l 2 1 中表达。 经i p t g 分别诱导后，重组质粒p e t 2 8 一n o s z c 芏约为2 1k d 处有较大的表达量。将重组 质粒p e t 2 8n o s 痢4 序后得到目的片断的全序列，与g e n b a n k 中序列登记号为m 2 2 6 2 8 的施氏假单胞菌ps 拙 z 盯一氧化二氮还原酶n o 继因的序列同源性为9 0 。本文 为深入研究一氧化二氮还原酶的结构与功能奠定了良好的基础。 关键词：好氧反硝化细菌筛选废水处理细菌鉴定克隆和表达 一氧化二氮还原酶n o s z 基因 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t d e n i t r i f i c a t i o ni st h ea b i l i t yo fb a c t e r i at ou s en i t r o g e no x i d e s 衅0 3 。a n dn 0 2 1 ) a s e l e c t r o na c c e p t o r sp r o d u c i n gg a s e o u sn i t r o g e n ，m a i n l yn 2 t h i sp r o c e s sc o n s i s t so ff o u r c o n s e c u t i v er e d u c t i o n sc a t a l y z e db yf o u re n z y m e ss u c ha sn i t r a t er e d u c t a s e ( n a r ) n i t r i t e r e d u c t a s e ( n i 0 ，n i t r i co x i d er e d u c t a s e ( n o r ) a n dn i t r o u so x i d er e d u c t a s e i th a db e e n r e p o s e dt h a tt h ed e n i t r i f i c a t i o np r o c e s so c c u r e do n l yu n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s r e c e n t r e s e a r c hs h o w st h a t ，w i t ht h eh e l po faw i d er a n g eo fb a c t e r i a ls p e c i e s ，d e n i t r i f i c a t i o n c o u l do c c u ru n d e rf u l l ya e r o b i cc o n d i t i o n s t h em o d eo fa e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o nh a sa l s o b e e nd i s c u s s e di ns o m ec a s e s b i o l o g i c a ld e n i t r i f i c a t i o ni sa tp r e s e n to n eo ft h em o s t e f f e c t i v ep r o c e s st or e m o v en i t r o g e nf r o mw a s t e w a t e r a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o ni sa d i s c o v e r e dm e t a b o l i ca c t i v i t yt h a tc a nb ec a r r i e do u tb ym a n yd i f f e r e n tb a c t e r i a ，s u c ha s a l c a l i g e n e s ，p a r a c o c c u s ，p s e u d o m o n a s t h e r ea r ep l e n t yo fa e r o b i cd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a i un a t u r e i ti sp o s s i b l et oi s o l a t em a n ya e r o b i cd e n i t r i f i e r sf r o md i f f e r e n te c o s y s t e m s s u c ha sc a n a l s ，p o n d s ，s o i l s ，o ra c t i v es l u d g e sa ss o o na sas e l e c t i v em e t h o di sa p p l i e d a l t h o u g ha e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o ni sn o ww e l lk n o w n ，m a n yp o i n t sr e m a i nu n c l e a r s o m e b a c t e r i ab e i n ga b l et oa e r o b i cd e n i t r i f yh a sl o we f f i c i e n c yi nw a s t e w a t e rt r e ：a t m e n t i s a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o no n l yo b s e r v e d w i t hp u r es t r a i n si nl a b o r a t o r ye x p e r i m e n t s ，o rc a l l t h i sr e a c t i o no c c u ri nw a s t e w a t e rt r e a t m e n tw i t hh i g he f f i c i e n c y ? t h i ss t u d yd e s c r i b e dt h e i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fn e wd e n i t r i f y i n gb a c t e r i ai s o l a t e df r o md i f f e r e n t e c o s y s t e m s a n dd e m o n s t r a t e dt h e i r h i g hn i t r o g e n r e m o v a lf r o m w a s t e w a t e l d e n i t r i f i c a t i o ns t u d i e sw e r ec o n d u c t e du s i n gt h r e ea e r o b i cd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a s t r a i n h s 0 3w a sk e p ti no u rl a b o r a t o r y s t r a l nh s 0 4 3a n dh s 0 4 7w e r ei s o l a t e df r o mt h et h e s e w a g eo fp r i n t w o r k sa n dp i g g e r ys l u d g ei ns u b u r bo fw u h a nr e s p e c t i v e l y t h e s et h r e e b a c t e r i ac o u l d p r e s e n tf a s ta n ds t r o n gd e n i t r i f y i n gc a p a b i l i t yi ns ca n dr e m o v e d1 0m m n i t r a t ei n1 2t o1 8h o u r sw i t h o u ta c c u m u l a t i n gn i t r i t e t h ec a p a b i l i t yo fs t r a i nh s 一0 3 ， h s 0 4 3a n dh s 0 4 7t or e m o v en i t r o g e nf r o ms y n t h e s i sw a s t e w a t e rw a si n v e s t i g a t e d t h e d e n i t r i f y i n gr a t e so n l yr e a c h e d1 0 - 4 0 a f t e rb e i n gc u l t i v a t e di n d i v i d u a l l yo rt o g e t h e rf o r t w od a y sa d d i n gs o d i u ms u c c i n a t ea se x t e r n a lc a r b o ns o u r c e s t r a i nh s 一0 3c o u l dr e m o v e m o r et h a n9 8 o f1 0m mn i t r a t ef r o mw a s t e w a t e ri n6d a y sw h e ni tw a sm i x c u l t u r e d w i t hf u n g ia s p e r g i l l u so r y z a ew h i c hw a sm u c hh i 曲e rt h a nt h a to fs t r a i nh s - 0 3a n df u n g i a o r y z a er e s p e c t i v e l y t h ed e n i t r i l y i n gp e r f o r m a n c ew a sm a r k e d l yi m p r o v e di n t h e a e r o b i cc u l t i v a t i o nw h e nl o wc o n c e n t r a t i o no ff e + a n dm 0 0 4 2 w a sa d d e d t h e 硕士学住论文 m a s t e r st l i e s i s p e r f o r m a n c ew i t hb o t hf e “a n dm 0 0 4 2 w a sb e t t e rt h a l lt h a to ff e 2 + o rm 0 0 4 2 + a d d e d i n d i v i d u a l l y t h ed e n i t r i f y i n gp e r f o r m a n c ew e r en o t s a t i s f i e dw h e ne x t e r n a lc a r b o n s o u r c ei n c l u d i n gs o d i u ms u c c i n a t ea n de t h a n o lw e r ea d d e di n d i v a d u a l l yw i t h o u tf e 2 + a n d m 0 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a n sh a sn o tp r e v i o u s l yb e e ne x p l o r e d t h i si st h ef i r s tr e p o r to ft h ef a m i l yd _ a c i d o v o r a n sb e i n gi m p l i c a t e di nd e n i t r i f i c a t i o n n i t r o g e no x i d ei so n eo ft h em a i ng a s s e sc a u s i n gt h eg l o b a lw a r m i n ga n dd e s t r o y i n g t h eo z o n el a y e r , w h i c hp r e s e n t sap u b l i ch e a l t hh a z a r da n dd r a w si n c r e a s i n ga t t e n t i o nt o t h ec o n t r o lo fi t n i t r o u so x i 、d er e d u c t i o ni st h ef i n a ls t e po ft h ei n t a c td e n i t r i f i c a t i o n t h e n o s zi st h es t r u c t u r a lg e n eo fn i t r o g e no x i d er e d u c t a s e t h i sw o r kd e s c r i b e st h ec l o n i n g o ft h es t r u c t u r a lg e n e ，n o s z ，o fn 2 0r e d u c t a s e t o t a lg e n o m i cd n aw a se x t r a c t e df r o mp s t u t z e r ih s - 0 3a st h et e m p l a t ef o rp e r t h ep r i m e rw a sd e s i g n e da c c o r d i n gt on o s z s e q u e n c ed e p o s i t e di ng e n b a n k ( n o m 2 2 6 2 8 ) t h ep c rp r o d u c tw a si n s e r t e di n t o p l a s m i dp m d l 8 - t a f t e rt r a n s f o r m a t i o n a n ds e l e c t i o n ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d ， p m d - n o s z ，w a so b t a i n e d t h ed n af r a g m e n tc o n t a i n e dn o s zw a ss u b c l o n e di n t o e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8a tb a m h ia n dh i n d l i is i t e s t h er e c o m b i n a n tp e t 2 8 - n o s zt h a t c o n t a i n st 7p r o m o t e rw a st r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1a n di n d u c e db yi p t g t h ee x p r e s s e dp r o t e i nw a sd e t e c t e db ys d s p a g ea n dab a n da b o u t2 1k d aw a s p r o d u c e d ，w h i c hw a sn o tc o n e s p o n d e dw i t ht h a to fe x p e c t e d t h er e s u l to fs e q u e n c i n g f o rr e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 2 8 - n o s zw a sa n a l y s e d t h eb l a s tl e v e lo fs i m i l a r i t yt o n o s zs e q u e n c ei ng e n b a n ki s9 0 t h er e a s o nf o rt h ei n c o r r e c te x p r e s s e dp r o t e i nw a s t h a tb a s i cg r o u ph a db e e nm u t a t e di n t ot e r m i n a t e ，w h i c hs t o p p e dt h ee x p r e s s i o n t h e f u n c t i o na n ds t r u c t u r eo fn o s zn e e db ef u r t h e ri n v e s t i g a t e d k e yw o r d s ：a e r o b i cd e n i t r i f y i n g s c r e e n w a s t e w a t e rt r e a t m e n ti d e n t i f i c a t i o n n i t r o g e no x i d er e d u c t a s en o s zg e n e c l o n ea n de x p r e s s i o n 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 看辛 日期：浒，d 月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：摩 日期：a 以埠j a b 善日 导师签名 钧殇乡 日期：力多年2 月g e l 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童迨塞握童卮溢卮! 旦圭生；生生；旦三生筮盔! 作者签名：痦 日期：如心年iz 月牙日 导师签名 弦乏 日期：驰巧一年，二月扩日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章前言 1 1 生物脱氮研究进展 i i 1 细菌好氧反硝化作用机制 反硝化是硝酸盐或亚硝酸盐被还原成n 。0 或n ：的过程。细菌反硝化包括4 个还原 步骤，分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶催 化完成，即： n a rn i i “n o rn o s n 0 3 n 0 f n o n 2 0 硝z 传统理论认为，细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程。反硝化菌优先使用d o ( d i s s o l v e do x y g e n ) 呼吸，阻止了硝酸盐或亚硝酸盐作为最终电子受体。然而， 二十世纪8 0 年代，r o b e r t s o n 等报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存在“1 ， 并证实了泛养硫球菌t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a ( 现更名为脱氮副球菌p a r 3 c o c c u s d e n i t r f f i c a t d o n s “1 ) 在生长过程中，0 ：和n o 。共同存在时，其生长速率比两者单独 存在时都高。细菌好氧反硝化( a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n ) 的发现，突破了传统 理论的认识，为细菌反硝化理论添加了新的内容，同时也为生物脱氮技术提供了一 种崭新的思路。目前，越来越多的研究证明细菌好氧反硝化的存在，并发现了一些 在有氧条件下有较高反硝化率的细菌( 表1 - 1 ) 。1 “。从表中可以看出：许多菌属如产 碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 、副球菌属( p a r a c o c c u 匐、红球菌属( r h 0 4 0 e o c e u 句和假单 胞菌属( 府占出羿p _ 2 0 都存在好氧反硝化现象。 早期理论认为：o 。的得电子能力阻止了电子传递给n 0 3 _ 或n o ：+ ，抑制了反硝化的 进行。而最近研究表明，细菌反硝化酶系和有氧呼吸系统同时存在。n o 。+ 被还原的 同时，o 。被还原。氧不是抑制反硝化酶生成及其活性的直接因素。缺少n o 。一或0 。都会 降低细菌的生长率和反硝化率“、。l l o y d 等人“2 1 提出了细菌反硝化过程中的电子传 递模型( 图卜1 ) 。从图中可以看出：n 嘎一、o 。均可作为电子最终受体。反硝化菌可 将电子从被还原的物质传递给0 。，同时也可通过硝酸还原酶将电子传递给n o 。一。 在一定范围内，反硝化率不受d o 值的影响。但是当d o 值降低到某个值时，反硝 化酶系的活性开始急剧上升，反硝化率随着d o 值的降低而较大幅度地升高，这就是 硕士学侄论文 m a s t e r st h e s i s 表卜1 典型的好氧反硝化细菌及其反硝化率 o z 的浓度i ：t = 3 0 时的估计d o 值l i ：气体中氧的百分含量f ：f u l l ya e r o b i c 反硝化率a ：l 】n o l n g ( d r yw e i g h t ) - h 或m m o l n g ( e e l1 ) h b ：m m o l n l h c ：m m o l n g ( p r o t e i n ) hd ：m m o l n h u n i to fo d 5 4 0 图卜1 细菌反硝化过程中的电子传递模型 2 飞咄嚏 硕士学住论文 m a s t e r st h e s l s 所谓的阀值( t h r e s h o l d ) 。p a t u r e a u 等人“3 在研究一个好氧反硝化菌群时发现，d o 值在0 3 5 6 3 0 m g l 时，该菌群的反硝化率始终在3 4 1 0 4 2 3 0 f l m o l n l h 之间， 但是当d o 值小于0 3 5 m g l 时，反硝化率急剧上升。pd e n i t r i f ) c a t i o nd s m2 9 4 4 在 d o 值为大于空气饱和值的3 0 时其反硝化率较稳定( 在1 6 2 2 3 o m m o l g ( p r o t e i n ) m i n 之间) ，当d o 值低于空气饱和值的3 0 时，其反硝化率也 急剧上升“1 。zp n t o t r o p h a 的d o 值阀值约为1 7 0 m g l 。尸s t u t z e r i 的三种还原酶 的d o 阀值分别是：5 1 0 m g l 、2 5 0 m g l 、3 8 0 m g l 。而pn a u t i c a l _ 种还原酶的d 0 阀值分别是：4 0 5 m g l 、2 1 5 m g l 、0 2 5 m g l “。研究表明，阀值随着底物、微生 物的种类以及环境条件( 温度、气压、离子强度等) 不同而不同。d o 阀值的范围一 般在0 0 8 7 7 0 m g l ”“。而p a i 等人”1 发现一株好氧反硝化细菌的反硝化率不受o ：浓 度的影响。在有氧条件下，反硝化率与其生长所需的n 源( 无机n 还是有机n ) 有密 切关系。p a i 等人推测该菌与其它细菌有不同的好氧反硝化机制。s u 等人”0 1 分离到 一株反硝化细菌ps t u t z e r is u 2 ，当气体中0 。浓度为9 2 时，其反硝化率在9 0 h 之 内达到9 9 2 4 ，这很难用阀值理论来解释。关于阀值的机理至今还不清楚，有待 于更进一步研究。 早在1 9 8 8 年，人们就开始了对好氧反硝化酶系的研究。r o b e r t s o n 等人报道了 z p a n t o t r o p h a 的电子传递蛋白能在有氧条件下依次催化还原n o ? 、n o ：一、n o 、n 2 0 生成n ：“”，这一报道引起了众多研究者的关注。人们纷纷对好氧反硝化细菌的各种 反硝化酶进行了研究。 细菌好氧反硝化的第一步由位于细胞质膜和细胞壁之间的一种酶，即周质硝酸 还原酶( p e r i p l a s m i cn i t r a t er e d u c t a s e s ) 来完成。而厌氧反硝化菌( a n a e r o b i c d e n i t r i f i c a t i o n s ) 则通常表达膜结合硝酸还原酶( m e m b r a n e b o u n dn i t r a t e r e d u c t a s e s ) 。为解释zp a n t o t r o p h a 好氧反硝化这一特殊性质，b e ll 等人将z p a n t o t r o p h a 分别在有氧和厌氧条件下培养，并且分成细胞质膜和周质部分进行研 究“。结果显示：( 1 ) 膜结合硝酸还原酶在厌氧条件下优先表达，且仅在厌氧状态下 发挥作用：( 2 ) 周质硝酸还原酶在有氧条件下优先表达，且在有氧或无氧条件下均能 发挥作用：( 3 ) 周质硝酸还原酶也存在于厌氧生长的细胞中。当膜结合硝酸还原酶被 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 氧抑制时，它仍具有硝酸还原能力。许多研究表明，周质硝酸还原酶( n a p ) 是由 两个亚单位( n a p a 、n a p b ) 组成的二聚体。n a p a 由n a p a 基因编码，其还原硝酸的 作用位点包含辅因子m g d ( 钼蝶呤鸟苷二核苷酸，m 0 1 y b d o p t e r i ng u a n i n e d n u c l e o t i d e ) 和一个铁硫中心。n a p b 是二血红素细胞包素c 。“。周质硝酸还原 酶的活性部位与钼依赖性甲酸脱氢酶以及细菌同化过程中的硝酸还原酶在结构上 相似，但与膜结合硝酸还原酶不同。目前，一些细菌( 如h a e m o p h i l u si n f u e n z a e 、 肋o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s 、ps p s t r a i ng 1 7 9 、户s t u t z e r ia 1 5 0 1 等) 编码周质 硝酸还原酶的基因先后被鉴定。该基因呈簇状分布在长约1 5 k b 的染色体区域，共 编码l o 个o r f s 。按顺序分别鉴定为d n r e , o r f l 、n a r l 、n a r x 、n a t k , n a t m , 力a ，g 、 n a r h n n r f 和门a r l 这1 0 个o r f s 中，编码区最大的是1 7 a i “ g , 长约3 7 0 0b p ，编码 一个1 2 5 2 个氨基酸的蛋白。最小的为力a 儿，长6 0 6 b p ，编码一个2 0 “ 2 个氨基酸的 蛋白。在染色体上，这些基因按不同的方向进行转录。基因在染色体上排列非常紧 密，编码区之阳_ l 甚至互相交迭。其中n n r l 与n n r x 编码区交迭1 9 个碱基，力甜7 与 n n t l 的编码区交迭4 个碱基，加，仅n a r h 和1 7 a f ，基因之问的间距分别仅有1 5 、7 个 碱基3 。 在反硝化过程中，主要有两种亚硝酸还原酶。人们熟知的是细胞色素c d l ，由力j 坩 基因编码：另一种亚硝酸还原酶位于外周胞质，是一种可溶性含铜酶，由力j 附基因 编码。s t o u t h a m e r 等人证实了rp a n t o t r o p h a 中的亚硝酸还原酶是含铜型的酶，而 不是细胞色素c d l 型“。含铜型亚硝酸还原酶的晶体结构因其复杂性而很久未被鉴 定。t o c h e v a 等人于2 0 0 4 年研究了含铜型亚硝酸还原酶的晶体结构，发现n 原子和0 原子与铜助因子等距离的侧向配位结合模式与该酶的催化机理密切相关“。而m o i r 等人报道i t p a n t o t r o p h a 在有氧或无氧条件下生长时，细胞中均含有一种亚硝酸还 原酶，并鉴定为细胞色素c d l 型“。细胞色素c d l 型亚硝酸还原酶是一种双功能酶， 它能催化亚硝酸得到一个电子转变成n 0 ，并使0 。得到四个电子生成水“。细胞色素 c d l 是由n i r s 基因编码的二聚体。x 射线衍射显示：该酶包含了与两个轴向的组氨酸 配基( h i s1 7 、h i s 一6 9 ) 共价结合的血红素c ，以及与酪氨酸( t y r 一2 5 ) 和组氨酸 ( h i s 一2 0 0 ) 非荚价结合的血红素d 1 。血红素c 是电子的结合位点，血红素d 1 是还原 4 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 亚硝酸和0 。的铁离子中心。最近研究发现，一种四血红素c 型细胞色素n a p c 能增强c d l 型亚硝酸还原酶的活性。“。m o i r 等人还提纯了一种含铜蛋白，即假天青蛋白，发现 这种蛋白能在体外将电子传递给c d l 型亚硝酸还原酶，且这种蛋白的c u ”中心被二乙 基硫氨基甲酸酯( 一种螯合剂) 螫合。而亚硝酸还原酶被二乙基硫氨基甲酸酯抑制， 所以认为假天青蛋白在体内将电子传递给了亚硝酸还原酶。在反硝化酶系中，1 2 0 t ， 门j 衍口力d s 基因簇按照一定的顺序在染色体上相邻排列，形成一个“岛”状区域。力打 基因簇全长约1 3 0 0 0b p ，编码1 6 个o r f s 。按照这些基因在染色体上的排列分别被鉴 毒三为n i r h , n i r g 、n n l 、n i r d 、n i r f 、n i r c , n i r m , n i r b 、n i r t 、m r s 、n i r q 、n i r o 、 力j 以力出 n i r e 和n i r n o 根据转录方向的不同可以将1 1 打基因簇分成两部分，以 基因力打断门j 朋中间的4 4 9 个核苷酸的非编码区向外延伸。1 2 j ，基因之间排列紧密， 其中n ? 研口n i r 饺迭2 2 个碱基，n i r 6 和n i r l 的交迭4 个碱基，力打e 和门， 基因编码 区交迭6 个碱基“。关于好氧反硝化亚硝酸还原酶仍有争议，有待于进一步研究。 一氧化氮还原酶已在户s t u t z e r i 、尸d e n i t r i f i c a t i o n s 等细菌中分离提纯，其 部分特征已被确定。一氧化氮还原酶由月们切基因编码。好氧反硝化细菌的一氧化 氮还原酶是一种膜结合的细胞色素b c 型酶，由两个亚基组成，其大亚基n o r b 是疏水 性细胞色素b 类，小亚基n o r c 是细胞色素c 类。该酶很不稳定，这也是很久以来未被 鉴定的原因之一。到目前为止，刀基因簇已被基本鉴定“。该基因簇全长约8 0 0 0b p ， 编码8 个基因，位于门o r 门打一力d 占“岛”的一端，这8 个基因分为两种类型，加瘌 d n r ，分别鉴定为n o r c 、n o r b 、n o r d 、门d ，廊d n r n , d n r o 、咖彻、咖，rn o r l 6 基因 位于i i o t c 门o f b , n o r d 、n o r r 基因的最下游。在n o r l ) n o r r 之间分布着d n r n , d n r o 、 d n r d , d n r p on o r & 基因与力打基因簇的1 7 打堪因相连，中间有2 5 8b p 的非编码区。 力。r 平口d n j 两种类型的基因分别以相反的方向转录。基因之间分布非常紧密。其中 如r 能d n r o , n i d d n r p 间的间距只有0 、1 3 8 和5b p 。而d o r d , n o b , n o r c z 间的 间距只有8 7 5 d 4 7b p 。 现已发现的一氧化二氮还原酶是一种含铜蛋白。根据氧化还原特性和光谱学分 析可分为i 型( p u r p l e 型) 和i i 型( p i n k 型) ，其中i i 型是从有氧状态下的培养物 中分离而来。“。该酶的每个亚基都包含六个c u 原子，它们排列成两个不同类型的活 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 性中心，一个是双核电子传递位点c u 。，另一个是四核催化位点c u ：”。在有氧条件下， zp a n t o t r o p h a 中的一氧化二氮还原酶能将n 0 、n ：o 两种气体同时还原，但这两种气 体相互抑制。实验证明，n o 。一、n o 。一被还原为n ：0 ，其中问产物是n o 。fp a n t o t r o p h a 细胞中的一氧化二氮还原酶已被提纯，研究发现它与厌氧反硝化菌的一氧化二氮还 原酶相似。用马心细胞色素c 、zp a n t o t r o p h a 的细胞色素c 。以及假天青蛋白作为 电子供体时，提纯的一氧化二氮还原酶的活性在体外重现。马心亚铁细胞色素c 作 为电子供体将电子传递给一氧化二氮酶时，o 。不会抑制n ：0 在体外被还原。由此推断， ，p a n t o t r o p h a 的这两种电予传递蛋自将电子传递给一氧化二氮还原酶。燕永亮等 人“6 3 在一株施氏假单胞菌a 1 5 0 1 的染色体上鉴定了6 个一氧化二氮还原酶基因，分别 为n o s l 、n o s y 、n o s f 、n o s d 、n o s z 、n o s r 。这些基因以相同的方向转录，组成长度 为7 9 2 4b d 的一氧化二氮还原酶类基因簇。基因之间排列紧密。其中n o s y 、n o s f 和n o s d 的编码区按次序直接相连，n o s l 、n o s y 之间的基因间距为2 9b p ，n o s d 、n o s z 之间的 基因间距为2 3 4b p ，