硕士论文-钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）藻蓝蛋白的酶解及酶解产物的生物活性研究.pdf

分类号： 密级： y 9 8 2 3 2 0 单位代码：1 0 4 2 2 学 号：2 e d 弓j 牌， 厶篓z 客 硕士学位论文 s h a n d o n gu n i v e r s i t ym a s t e r st h e s i s 论文题目：名屯预坡系贼( 币批? 搬步磁坻岿j 藻篮 歌酉荫确郴反确解产物昏生物娘烛研易 作 专 指导 专业 者姓名龚益 业擞丝物 敦师 按术 蛙各 职务 御驴年乒月勿目 山东大学硕十学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：丕逝导师签名 期： 、， 兰筮! 16 山东大学项士学位论文 钝项螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) 藻蓝蛋白的酶解 及酶解产物的生物活性研究 摘要 自由基过剩是机体衰老的主要原因，可引起多种疾病( 如动脉粥样硬化、心 血管疾病、脑神经细胞变性、糖尿病及肿瘤等) 。目前，服用过多的合成抗衰老 药物对人体有毒副作用。因此，寻求新的天然抗氧化剂、抗衰老药物对人类健康 具有重要意义，海洋生物抗氧化剂因其抗氧化作用强、种类多、结构复杂、副作 用低等优点成为人们研究的热点。研究表明，螺旋藻和藻胆蛋白具有抗氧化活性， 能抑制机体内自由基积累，延缓机体衰老，抑制肿瘤的发生，并具有降血压活性。 国外已有报道，从紫球藻中已得到具有明显降血压作用的活性肽。因此合理开发 和利用螺旋藻及藻蓝蛋白提高其应用价值对人类抗衰老工程具有极其重要的意 义。 本论文以钝顶螺旋藻( s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 及其所含的藻蓝蛋白为研究对 象，围绕其高值化开发利用这一研究主题，进行了研究，结果如下： 采用胰蛋白酶酶解螺旋藻干粉的蛋白粗提液得到抗氧化、降血压活性增强的 产物，提高了干藻粉的应用价值。螺旋藻粉粗提液经过两种不同的酶解方法进行 酶解，酶解过程中光谱变化不同，但都能有效提高螺旋藻干藻粉抗氧化、降血压 活性。一种方法反应体系为蛋白粗提液、胰蛋白酶、p h 7 0 磷酸盐缓冲体系，此 方法酶解后，酶解产物在6 2 0n m 处藻蓝蛋白特征吸收峰降低，但仍具有吸收和 传递能量的功能，清除自由基能力与降血压活性增强，另一种方法反应体系为蛋 白粗提液、胰蛋白酶、p h 7 0 磷酸盐缓冲体系、h c i 、n h 4 h c 0 3 ，酶解产物在6 2 0 r i m 处藻蓝蛋白特征吸收峰变化明显，几乎不具备吸收和传递能量的功能，自由基清 除能力与降血压活性增强，且略高于前一种方法。酶解产物在6 2 0 r i m 处的藻蓝 蛋白的藻蓝胆素特征吸收峰发生变化，说明其生物活性功能与藻蓝蛋白结构变化 有关，后面的藻蓝蛋白的酶解利用实验也证实了这一点。 与传统的藻蓝蛋白提取方法相比，本论文建立了藻蓝蛋白的制备型分离纯化 方法，节省了纯化步骤，提高了纯化效率，为藻蓝蛋白的应用研究奠定了基础。 山东大学硕士学位论文 通过硫酸铵盐分级沉淀，p h5 0 醋酸盐缓冲体系改变蛋白构象，去除连接蛋白， 再经过阴离子交换树脂层析，得到纯化的c p c 。该方法步骤简单，与传统的h a 层析方法相比，提高了上样量，节约时间，降低了藻蓝蛋白制备成本，而且层析 柱再生容易，可重复使用，为藻蓝蛋白的应用研究奠定了基础。 通过光谱分析技术研究了藻蓝蛋白酶解过程中藻蓝蛋白的结构与抗氧化活 性变化的关系，为高活性抗氧化肽的制备奠定了理论基础。胰蛋白酶的作用位点 ，为碱性氨基酸，c p c 经过胰蛋白酶酶解后，随着时间的延长，其吸收光谱也发 生明显的变化，但都表现出与藻蓝胆素相近的吸收峰。酶解产物清除自由基的能 力和降血压能力增强。 关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；酶解；自由基清除；降血压活性 2 a n dl o ws i d e - e f f e c t s a c c o r d i n gt ot h er e c e n tl e s e a l c h ，s p i r u l i n ap l a t e n s i sa n d c - p h y c o c y a n i nc a n a c ta sa s c a v e n g e ro f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n dt h e yc a l lr e s t r a i n t h ea c c u m u l a t i o no ff r e er a d i c a li nv i v o m o r e o v e r , t h e yc a nd e l a ys e n e s c e n c e ， r e s t r a i nt u m o r i g e n e s i sa n dd e p r e s sh y p e r t e n s i o n i ti sr e p o r t e dt h a ta c t i v ep e p t i d e so b t a i n e df r o mp o r p h y r i d i a c e a ec a ng r e a t l y r e d u c eb l o o dp r e s s u r e s t h e r e f o r ei ti sm e a n i n g f u lt od e v e l o p ea n du t i l i z es p i r u l i n a p l a t e n s i s a n dc p ci nh u m a na n t i s e n i l i t yp r o g r a m i nt h i ss t u d y , t h ev a l u e a a d e du t i l i z a t i o no fs p i r u l i n ap l a t e n s i sa n dc p ca r c i n v e s t i g a t e d t h i st h e s i si n c l u d e st h ef o l l o w i n gs e c t i o n s ： i i lt h i sp a p e r , t h ec r u d ee x t r a c tf r o ms p i r u l i n ap l a t e n s i sw a sd i g e s t e db yt r y p s i n , a n dt h e nt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h e i rh y d r o l y s a t e sw a sa s s a y e d r e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ea n t i o x i d a ma n da c e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e so ft h eh y d m l y s a t ew e r ee n h a n c e d t h ed i v e r s i f i c a t i o no fs p e e t n m a sw a sd i f f e r e n tb e t w e e nt h et w oh y d r o l y t i ew a y s , b u t a n t i o x i d a n ta n da c e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e so f t h eh y d r o l y s a t ew e r eb o t hi m p r o v e d t h e c r u d ee x t r a c tw a st r e a t e db yt r y p s i n , a n dt h e ni t ss p e c t r u m sa n de f f i c i e n c yo f g e n e r a t i n ga n ds c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a lw e r ed e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h es t r u c t u r eo fc p c c h a n g e d ，b u tt h e yc o u l ds t i l lh a v et h ef u n c t i o no fa b s o r b i n ga n d t r a n s f e r i n gt h el i g h te n e r g yp a r t l y o nt h eo t h e rh a n d , t h ea b i l i t yo fs c a v e n g i n g h y d r o x y lr a d i c a li n c r e a s e dr e m a r k a b l y c r u d ee x t r a c tw a st r e a t e db yt r y p s i ni nh c i a n dn h 4 h c 0 3b u f f e rr e s p e c t i v e l y , a n da f t e r w a r d st h es p e c t r u m sa n di t sa b i l i t yo f g e n e r a t i n ga n ds c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a lw e r ed e t e c t e d t h ep h o t o s p e c t r u mo f 3 山东大学硕士学位论文 c p c c h a n g e dr e m a r k a b l y t h e i rc h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a k sd i s a p p e a r e d ，a n dt h e y c o u l dn o ta b s o r be n dt r a n s f e rt h el i g h te n e r g y t h eh y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t y o f h y d r o l y t ew a si n c r e a s e d an e w s i m p l ep r o c e d u r ef o rt h ei s o l a t i o ne n dp u r i f i c m i o no fs p i r u l i n ap l a t e n s i s c p ci n c l u d i n gc e n t r i f u g a t i o n , h i g hc o n c e n t r a t i o ns a l tp r e c i p i t a t i o n , a n dd e a e - s e p h a r o s ef a s tf l o wc h r o m a t o g r a p h yw a sd e v e l o p e d ，b yw h i c ht h ec p cw i t hh i g h p u r i t yw a so b t a i n e d i nt h i sp a p e r , d u r i n gt h ee n z y m a t i cp r o c e s s ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nv a r i e t i e so f c p cs t r u c t u r ea n dt h ea c t i v i t i e so fs c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a lw a ss t u d i e d t h e p h o t o s p e c t r u m o fc p cc h a n g e dr e m a r k a b l ya f t e r t r y p s i nh y d r o l y s i s t h e i r c h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a k sd i s a p p e a r e dg r a d u a l l y t h e ya l ls h o w e dt h es i m i l a r a b s o r p t i o np e a k so fp h y c o b i l i n t h ea b s o r p t i o no fc p ca t6 2 0 h mw a sd e t e c t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh y d r o l y s i ss p e e dd e c r e a s e d a tt h es 锄et i m e t h ea b i l i t yo f g e n e r a t i n ga n ds c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a lo fc p ch y d r o l y t ew a sd e t e c t e d t h e h y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t yo fc p c sh y d r o l y t ei n c r e a s e db e c a u s et h a tt h e t r e a t i n gt i m ep r o l o n g e d k e yw o r d s ：s p i r u l i n ap l a t e n s i s ；p h y c o b i l i p r o t e i m ；h y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n g ； h y d r o l y s i s ；a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y 4 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 引起机体衰老的主要原因是体内自由基含量的过剩导致机体氧化平衡机制 的破坏。首先，自由基直接对蛋白质氧化破坏并引起其交联变性。其次是对核酸 的氧化和交联，使d n a 发生断裂，突变以及对热的稳定性发生改变等，从而严 重影响了蛋白质遗传信息的正常转录、翻译过程，使蛋白质表达量降低甚至消失， 甚至产生突变。而蛋白质合成量的减少是老年性记忆力减退，智力障碍以及肌肉 萎缩等表现的重要原因之一。随着年龄的增长，人体内自由基水平呈增长趋势， 同时自由基清除机制却呈退化趋势，结果造成体内自由基大量积聚，所以自由基 对机体健康的危害作用渐趋严重，引发了机体多种生理功能障碍，诱发了多种老 年性疾病( 如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脑神经细胞变性、糖尿病以及肿瘤 等) 的发生、发展，导致机体的衰老，直至死亡。目前，已有研究表明，服用过 多的合成抗衰老药物，易对人体产生毒副作用，因此寻找新的天然抗氧化剂、新 的抗衰老药物对人类健康具有重要的意义。 近年来，随着海洋生物研究的深入开发和研究技术的提高，已不断从海洋 生物中发现一些具有抗氧化活性的物质。海洋生物抗氧化剂可通过各种途径清除 内源性和外源性自由基，具有抗氧化作用强、种类多、结构复杂、副作用低等 优点。从海洋生物中寻找新的天然抗氧化剂已成为海洋药物研究的重要目标之 一。研究表明，螺旋藻和藻胆蛋白具有抗氧化活性，能够抑制机体内自由基的大 量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效，从而能在一定程度上消除机体内 多种生理功能障碍，延缓机体的衰老，抑制肿瘤的发生，并且有明显的降血压活 性，因此，合理有效的开发与利用螺旋藻及藻蓝蛋白，提高其应用价值，具有极 其重要的意义和广阔的发展前景。 1 螺旋藻简介 螺旋藻( 印护“，加是一类低等植物，属于蓝藻门( c y a n o p l l y 诅) 、颤藻科 ( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 的一个属。它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以 又称蓝细菌。螺旋藻通常为多细胞构成的丝状体、圆柱状，呈疏松或紧密而规则 山东大学硕士学位论文 的螺旋状弯曲，但形状往往受生长环境的影响而发生改变，有的甚至产生稳定的 直线形变异。螺旋藻性喜高温( 2 5 - - 3 6 ) 、高碱( p n8 1 2 ) ，营光合自养，但也 能利用环境中的一些有机物作兼养生长，行无性繁殖，通常依靠藻丝体中横隔的 产生或藻丝体中伪空胞的产生而形成藻殖段。 螺旋藻含有大量蛋白质、极其丰富均衡的营养成分和多种生物活性物质，其 细胞壁几乎不含纤维素，因此极易被人体消化吸收，研究表明螺旋藻的消化吸收 率在9 4 以上，其蛋白消化率达7 5 ，是一种优良的纯天然食品，被联合国粮农 组织推荐为“全球人类最理想的食品”。 螺旋藻蛋白质含量高达5 0 _ - 7 0 ，由1 8 种氨基酸组成，其中人体与动物所必 须的8 种氨基酸的含量接近或超过了f a o 推荐的标准，是自然界中具有重大开发 价值的食用和饵料蛋白资源，具有一定的医疗保健作用。 螺旋藻还含有七种维生素，其中维生素e 是一种天然抗氧化剂，p 胡萝卜素 是活性最高的维生素a 源，维生素a 是一种自由基清除剂，对肿瘤( 尤其是上皮 组织癌变) 的防治有明显效果。 螺旋藻多糖和藻胆蛋白更有着显著的生理活性和多方面的药用价值，如防治 肿瘤和溃疡、提高机体免疫功能、调节血压、促进动物血细胞再生等。综上所述， 螺旋藻及其活性成分在功能性食品研究与开发方面有着广阔的应用前景。 2 藻胆蛋白的组成及分类 藻胆蛋白是存在于红藻、蓝绿藻和隐藻中的捕光天线色素复合物，在红藻和 蓝绿藻内藻胆蛋白按一定的结构组装成藻胆体而附着在类囊体膜上。藻胆蛋白具 有强烈的荧光性，发橙红色荧光，而其本身则呈红色、紫色或蓝色等，故称其为 有色多肽。根据藻胆蛋白的吸收光谱可以将它们分为藻红蛋白( p e 和p e c ) 、藻 蓝蛋白( p c ) 和异藻蓝蛋白( a p c ) 。p e 根据其组成和光谱特性可分为r - p e 、 c p e 、b p e 和b p e 四种，p c 有c p c 和r - p c 两种。最初r - 、c - 和b 分别代 表藻胆蛋白来源于红藻门( r h o d o p h y t a ) 、蓝藻门( c y a n o p h y m ) 和红藻中的红 毛菜纲( b a n g i p h y c e a e ) ，但随后的研究表明同一种类型的藻胆蛋白既可以从红 藻中又可以从蓝藻中分离到，因此，现在这些前缀只表示光谱特性不表示来源 ( g l a z e r ，a n1 9 8 1 ；周百成和曾呈奎，1 9 9 0 ) 。 6 山东大学硕士学位论文 藻胆蛋白是一类水溶性的寡聚蛋白，大都由两个同源性较高的肽链即0 t 和1 3 亚基组成，d 、1 3 亚基的分子量在1 5 k d 2 0 k d 之间，这两种亚基以1 ：l 的比例 构成单体( a d ) ，它们是藻胆蛋白的基本的结构单位( m a c c o l l ，1 9 9 8 ) 。每种亚基由 脱辅基蛋白( a p o p r o t e i n ) 和开链的四吡咯环发色团藻胆素组成，藻胆素通 过硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基共价连接。藻胆蛋白的( n d ) 单体倾向于 形成较高的聚集体( a 院，常见的聚集体的形式y g ( a d 3 或 p ) 6 。纯化的藻胆蛋白a 和p 亚基的聚集体的形式往往与藻胆蛋白的种类、蛋白浓度、溶液的p h 值和离 子强度等因素有关，依条件的不同，在各聚集体之存在着一定的动态平衡关系 0 3 e r n s 结合hochest染色和细胞膜磷脂酰丝氨酸荧光显示方 法,我们初步认为藻蓝蛋白和多糖是通过促进肿瘤细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的生长.我们成功建立了icr小鼠的黑色素瘤模型以验证体外细胞实验的结果,并 进行了样品对小鼠免疫活性的研究.在小鼠肿瘤模型实验中,我们发现给粗藻蓝蛋白和粗多糖组2周后肿瘤有明显的减小甚至消失,单纯的螺旋藻对肿瘤的抑制 不明显.两组免疫实验表明粗藻蓝蛋白和粗多糖及c-pc、sp对小鼠免疫系统没有显著促进作用. 4.期刊论文 徐长波.王巍杰.xu chang-bo.wang wei-jie 螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化研究进展 -山东化工2009,38(1) 藻蓝蛋白在医药、食品及化妆品等领域有着广泛应用,螺旋藻中藻蓝蛋白的含量丰富.本文介绍了藻蓝蛋白的结构和生理活性,综述了国内外螺旋藻中藻 蓝蛋白的提取和纯化技术的研究进展,列举了几个影响藻蓝蛋白稳定性的因素. 5.期刊论文 范敏.王雪青.段开红.庞广昌.fan min.wang xue-qing.duan kai-hong.pang guang-chang 螺旋藻藻蓝蛋 白光敏作用的研究进展 -生命科学2008,20(2) 螺旋藻是一种广泛养殖的丝状体蓝藻.从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白具有抗肿瘤和增强免疫等多种生物学功能,作为光敏剂,藻蓝蛋白可应用于肿瘤治疗.本 文阐述了藻蓝蛋白的结构、光动力疗法的原理和藻蓝蛋白光敏作用的研究进展,并介绍了藻蓝蛋白在光动力疗法中的应用现状与前景. 6.学位论文 李乐农 富硒螺旋藻中含硒藻蓝蛋白的纯化及晶体学研究 1999 论文探讨了钝顶螺旋藻(spirulina platensis)对硒(selenium)的富集、含硒藻蓝蛋白的纯化、结晶及其x射线衍射研究,主要结论如下:1、采用正交组 合设计,对富硒螺旋藻培养过程中的三种主要因素亚硒酸钠浓度、加样次数、藻密度的研究结果表明:此三种因素对藻体硒含量有显著影响;经相关与回归分 析研究发现,藻体硒含量与蛋白质含量呈显著正相关,相关系数为r=0.6020(r=0.5050)藻体硒含量的一般趋势是随蛋白质含量的增加而增加.2、以富 硒螺旋藻为材料,经细胞破碎,硫酸铵沈淀,再通过凝胶色谱(sephadexg-100)和离子交换色谱(deae纤维素-52,fplc(monoq)纯化,含硒藻蓝蛋白的纯度 a/a比等于5.24,最大吸收峰在620nm处.经sds-page电泳,测得藻蓝蛋白两个亚基的分子量为=19000,=21500.经等电聚焦分析,测得藻蓝蛋白 的等电点为4.65.纯化后的藻蓝蛋白经dan荧光分析,测得藻蓝蛋白的se含量为96.8ug/g蛋白.3、在含硒藻蓝蛋白的纯化过程中,应用两性树脂脱盐的结果表明 :2012为基体的两性树脂特别适全于硫酸铵沉淀步骤中的脱盐,脱盐能力强,分辨率高,脱盐效率高达93以上.4、纯化后的含硒藻蓝蛋白,通过应用悬滴气 相扩散法,采用(nh)so和peg4000作沉淀剂,获得了该蛋白质晶体的两种晶型.5、晶型i晶体的衍射数据,以取自fremylla diplosiphon的1.66a分辨率 的藻蓝蛋白的晶体结构作为模型,进行分子置换法.结果表明:一个晶胞内有4个()六聚体,其中2个()六聚体之间沿oa,ob轴方向“边靠边“紧 密缔合,两两“边靠边“缔合的()六聚体沿oc轴方向交错重叠即以体对角线方向紧密堆积.这种堆积方式在藻类藻胆蛋白中还是首次报道. 7.期刊论文 张以芳.刘旭川.李琦华.zhang yi-fang.liu xu-chuan.li qi-hua 螺旋藻藻蓝蛋白提取及稳定性试验 - 云南大学学报（自然科学版）1999,21(3) 藻蓝蛋白可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记.本研究用氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎螺旋藻细胞壁,盐析,提取藻蓝蛋白,并对其理化特性 进行了测定.表明酶法破壁适应于大量藻蓝蛋白制备,冻融法只适应于小量制备.提取率为13%左右,提取藻蓝蛋白在40以下及ph4.08.5之间表现稳定 ,45以上有变色现象,荧光性减弱,糖溶液可提高藻蓝蛋白对热的稳定性,光照对藻蓝蛋白影响较小. 8.期刊论文 白凤霞.王飞.bai feng-xia.wang fei 螺旋藻直线型突变株(sp-dz)藻蓝蛋白的分离纯化及生物活性的研 究 -现代化工2008,28(z2) 螺旋藻直线型突变株(sp-dz)是一种新型的藻种,它具有蛋白含量高,生长速度快,上浮性好的优点.以其为藻种进行培养,对其蛋白提取物采用deae- sepharose fast flow柱纯化后得到藻蓝蛋白,同时采用了sds-page、紫外可见光谱、红外光谱对藻蓝蛋白产品进行表征,并测定了其抗肿瘤、抗氧化活性.研 究结果表明:藻蓝蛋白的亚基分子质量为35.9 kdr,最大吸收光谱在620 nm处,二级结构中主要以-螺旋结构为主.生物活性结果显示:藻蓝蛋白的抗氧化活性