硕士论文：姬松茸菌液体发酵及其多糖活性研究.pdf

内容提要内容提要 姬松茸是一种药食兼用真菌，其多糖具有多种生物活性。本论文以菌丝体干重产量为 考察指标，通过单因素试验、plackett-burman 试验，最陡爬坡试验和响应面法优化最佳培 养基配方。并且以菌丝体干重和多糖产量为指标，优化了初始 ph、种龄、接种量、装液 量、转速、温度、时间等摇瓶培养条件。在单因素试验基础上，利用响应面法优化了多糖 热水提取和超声提取条件。最后，研究了姬松茸菌多糖体外抗肿瘤及抗氧化活性。 关键词：姬松茸菌；液体发酵；多糖提取；生物活性关键词：姬松茸菌；液体发酵；多糖提取；生物活性 英文缩略语英文缩略语 缩写缩写 中文名称中文名称 rsm 响应面分析法 ccd 中心组合试验设计 pb plackettburman 设计法 mtt 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 dmso 二甲基亚砜 hepes 羟乙基呱嗪乙硫磺酸 hela 人宫颈癌细胞 cne 人咽癌细胞 hep g2 人肝癌细胞 目 录 目 录 第一章前言 . 1 1.1 引言 1 1.2 姬松茸的研究现状 1 1.3 姬松茸的药理活性 3 1.4 真菌多糖研究进展 . 4 1.5 立题依据 . 6 1.6 本文的主要研究内容 . 6 第二章 姬松茸摇瓶发酵条件的研究 8 2.1 引言 8 2.2 实验材料与仪器 . 8 2.3 实验方法 10 2.4 结果与讨论 13 2.5 本章小结 32 第三章姬松茸菌菌丝体多糖提取工艺的研究 33 3.1 引言 33 3.2 实验材料与仪器 33 3.3 实验方法 34 3.4 实验结果与讨论 35 3.5 本章小结 48 第四章 姬松茸菌多糖体外生物活性的研究 . 49 4.1 引言 49 4.2 实验材料与仪器 49 4.3 实验方法 51 4.4 实验结果与讨论 55 4.5 本章小结 63 第五章 总结与展望 . 64 5.1 全文总结 64 5.2 工作展望 65 参考文献 66 致 谢 75 中文摘要 76 abstract . 78 1 第一章 前言第一章 前言 1.1 引言 引言 姬松茸（agaricus blazei murlil，abm）是一种重要的药食两用真菌 1,2。近 年来，姬松茸多糖作为抗肿瘤、调节免疫力、抗菌药物的来源引起全世界研究 学者的关注 3-5。姬松茸液体发酵培养具有产量大、周期短的优点，因此成为大 规模生产姬松茸菌丝体、制备多糖的有效方法 6,7。目前国内外对姬松茸液体发 酵培养及菌丝体多糖的研究报道并不多见，在提取方法、分离纯化、结构鉴定 等方面缺乏深入、系统的研究。本试验将从姬松茸液体发酵培养基优化、菌丝 体多糖提取、多糖生物活性三个方面进行研究。 1.2 姬松茸的研究现状姬松茸的研究现状 姬松茸(agaricus blazei murlil，abm)，又名巴西蘑菇、小松菇、柏式蘑菇， 原产于巴西南部圣保罗山区、秘鲁及美国加利福利亚南部、佛罗里达海边草地 上的一种美味食药用菌 8-11。从真菌分类地位上，姬松茸属于担子菌亚门，层菌 纲 (hymenomycetes) ， 无 隔 担 子 菌 亚 纲 (holobasidiomycetidae) ， 伞 菌 目 (agaricales)，伞菌科(agaricaceae)，伞菌属(agaricus) 12,13。 1.2.1 姬松茸的生物学特征 姬松茸子实体粗壮，菌盖直径 5-11cm，初为半球形，逐渐成馒头形最后为 平展，顶部中央平坦，表面被覆淡褐色至栗褐色的纤维状鳞片，盖缘有菌幕的 碎片。菌褶离生，密集，宽 8-10 毫米，从白色转肉色，后变为黑褐色。菌柄圆 柱状，中实，长 4-14 厘米，直径 1-3 厘米，上下等粗或基部膨大，表面近白色。 菌盖中心的菌肉厚达 11 毫米，边缘的菌肉薄，菌肉白色，受伤后变橙黄色。菌 环以上最初有粉状至绵屑状小鳞片，后脱落成平滑，中空。孢子阔椭圆形至卵 形，没有芽孔。菌丝无锁状联合 14-17。菌环大，上位，膜质，初白色，后微褐 色，膜下有带褐色绵屑状的附属物。 2 姬松茸是一种夏秋生长的草腐好气性真菌，喜湿，属中温偏高菌类。菌丝 发育的温度范围 10-30，适温 22-26，子实体发生的温度范围 20-33，适 温 22-25，空气相对湿度，菌丝体 65-75%，子实体 85-95%； ；子实体发生时 需要大量的新鲜空气 18,19。 1.2.2 姬松茸的液体发酵培养 姬松茸的培养主要有固体栽培及液体发酵培养两种方式，由于子实体栽培 具有周期长，产量低，受季节及气候影响大，劳动强度大等缺点，限制了姬松 茸的工业化大规模生产，难以满足日益扩大的市场需求 20-22。而液体深层发酵 则可以克服以上缺点。姬松茸的子实体和菌丝体中的多糖组分均具有抗肿瘤活 性 23-25，均具有较高的食用及药用价值26。国内外学者研究证明姬松茸液态深 层发酵是一种开发其活性多糖的有效手段。而利用液体发酵生产的姬松茸菌丝 体替代子实体应用于食品和医药领域，已成为一个新的具有广阔前景的发展方 向。影响姬松茸液体发酵的主要因素主要有培养基成分、初始 ph、发酵温度、 溶氧量等 27-29。 1.2.3 姬松茸的营养价值与保健价值 姬松茸具有浓郁的杏仁香味，味道鲜美，滑嫩爽口，含有丰富的蛋白质和 多糖，具有极高的营养价值。姬松茸菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香， 食用价值很高。 新鲜子实体含水分 85%-87%； 每 100 克干品中含粗蛋白 40 -45g、 可溶性糖类 38- 45g、粗纤维 6 -8g、脂肪 3- 4g、灰分 5-7g；已测定的 17 种氨基 酸总量为干重的 19.22%，其中 50.18%为人体必需氨基酸，高于其它食用菌， 还含有多种维生素和麦角幽醇 30,31。 据报道经常食用姬松茸，具有抗肿瘤、提高免疫功能、抗凝血、降血脂、 降低胆固醇、安神的功效 32。姬松茸的抗肿瘤成分主要有多糖、甾醇、外源凝 集素、脂肪酸和核酸等 33。另外姬松茸多糖对痔疮、神经痛也具有一定疗效34。 因此姬松茸是一种药食兼用的食用菌。 3 1.3 姬松茸的药理活性 姬松茸的药理活性 1.3.1 抗氧化、延缓衰老 研究表明，姬松茸具有很强的清除过氧化脂质和自由基的功能，并具有延 缓器官和机体衰老的功能 35。姬松茸能消除血液中的乳酸并降低血清尿素氮水 平，使小鼠负重游泳的耐力增强，使血清总胆固醇和血清甘油三酯浓度明显降 低 36,37。姬松茸具有清除自由基的功能，并能拮抗组织匀浆中产生额过氧化脂 质。通过正丁烷吸入模型，使机体产生氧自由基的损伤，姬松茸对活性氧自由 基也有很强的拮抗作用 38,39。同时，姬松茸能抑制脂质在血液中和血管壁上的 沉积，能保护心肌。因此，姬松茸可作为一种滋补强身，延年益寿，缓解疲劳 的药品、食品。 1.3.2 广谱抗菌作用 据报道，姬松茸菌丝体及发酵液都具有广谱抗菌的作用。体外实验发现姬 松茸菌丝体自溶物加入培养基，并接种啤酒酵母、曲霉、金黄色葡萄球菌，均 未生长任何菌落 40,41。目前研究发现起抗菌作用的主要成分为多糖42。实验表 明姬松茸菌丝提取物及发酵液对芽饱菌和非芽抱菌、对放线菌种的链霉菌、革 兰氏阴性及阳性菌均有不同程度的拮抗性 43。多糖对念珠菌、类腐败梭菌和产 气荚膜梭菌都有良好的抑制作用 44。对多种病原微生物如：猪出血性败血症杆 菌、须疮癣菌、羊毛状小芽袍菌、石膏样小花胞菌、絮状表皮癣菌、链球菌、 肺炎球菌、鼻疽杆菌等有不同程度的抑制效果 45。姬松茸中多糖作为新型生物 抑菌剂，在食品保鲜工业中也有着很好的应用前景。 1.3.3 抗炎 姬松茸多糖有持续显著的抗炎作用 46。姬松茸多糖具有对由二甲苯诱发的 小鼠耳部发炎肿胀及毛细血管通透性增高有抑制作用，并且对于由脚叉菜胶诱 发的大鼠脚趾炎症，有明显的抗炎效果。研究表明，姬松茸多糖具有抗炎功能， 主要由于姬松茸多糖对小鼠生成溶血素有抑制作用 47-49。 4 1.3.4 对免疫系统作用 姬松茸在免疫器官、免疫细胞和免疫分子等方面均能发挥作用，使机体的 免疫功能增强。目前认为蛹虫草多糖是姬松茸调节免疫功能的主要活性物质。 姬松茸多糖对于小鼠的非特异性免疫、特异性细胞免疫、特异性体液免疫以及 红细胞免疫均能显著增强 50-52。 1.3.5 抗肿瘤作用 上世纪七、八十年代，有报道证实，姬松茸具有抗肿瘤作用，腹腔注射多 糖具有使艾氏腹水瘤小鼠的存活时间延长的效果 53。姬松茸对肿瘤的抑制作用 是通过直接抑制肿瘤细胞分裂和增强机体的特异性免疫功能，从而增强细胞因 子的免疫能力及吞噬细胞的吞噬能力，提高机体整体的免疫性而达到抗肿瘤的 效果的 54,55。 姬松茸的抗癌机理一直是科研工作者感兴趣的问题，通常认为，姬松茸通 过增强机体免疫力，抑制癌细胞中核糖核酸的合成，诱导肿瘤细胞凋亡，调节 细胞信号传导的通路，强抗氧化性，抗突变性，以及使引起肿瘤的病毒的复制 受到干扰，使核酸甲基化，并且通过抑制血管的形成，抑制肿瘤的转移。很多 报道认为，姬松茸中多糖等活性物质，抗肿瘤的作用是通过提高细胞非特异性 免疫和体液免疫等方式，充分调动机体免疫系统，对肿瘤细胞进行攻击和破坏 的 56-59。 1.4 真菌多糖研究进展真菌多糖研究进展 1.4.1 真菌多糖的定义 多糖又称多聚糖（polysaccharide），由单糖聚合而成，分子量从数万到数 百万。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的一类活性多糖及 其衍生物 60,具有控制真菌细胞分裂分化，调节细胞生长的作用61。真菌多糖对 癌细胞有很强的抑制力，具有很强烈的抗肿瘤活性 62。当前，对真菌多糖的研 究主要从真菌多糖的提取纯化及结构分析和生物活性研究两方面。 真菌多糖存在于真菌的菌丝体和子实体中，菌丝体在发酵过程中，有的留 5 在细胞内，形成胞内多糖；有的将多糖分泌到细胞外，形成胞外多糖。将真菌 多糖有效成分提取分离、浓缩和纯化，才能更好地达到保健治疗作用 63。 1.4.2 真菌多糖的提取和分离纯化 真菌多糖分为胞外多糖和胞内多糖两种。多糖是极性大分子化合物，一般采 用热水、稀碱溶液或稀酸溶液提取 64。水可溶性多糖可采用热水浸提，水不溶性 多糖一般用酸或碱提取，常用的提取溶剂有氢氧化钠、稀盐酸、三氯乙酸、草酸 铵等。用不同提取溶剂提取同一真菌菌丝体所得的多糖成分是不相同的 65,66。各 种提取方法及其优缺点的比较见表1.1。 表1.1 不同提取方法的比较 67,68 提取方法 提取剂 提取效果 热水提取法 去离子水 常用方法，简单方便，不会引起多糖 降解；只能提取胞外多糖 稀酸提取法 三氯乙酸法等 可提取酸溶性多糖；可引起部分多糖 降解 稀碱提取法 氢氧化钠等 可提取碱溶性多糖，热碱提取物中杂 质较高，多糖可能降解 稀盐提取法 氯化锌等 可提取盐溶性多糖 加酶提取法 纤维素酶，果胶酶，木 瓜蛋白酶等 酶解细胞壁，可提取胞内多糖 大部分的多糖在有机溶剂或高浓度盐溶液中的溶解度较小，因此可以用高 浓度的有机溶剂或盐溶液来沉淀多糖。有机溶剂常用乙醇、丙酮、甲醇及异丙 醇。乙醇、丙酮是药品食品监督管理局认可的适用于食品级多糖的最佳沉淀剂 69,70。盐析通常使用的是硫酸铵71。这些溶剂能降低多糖的溶解度而得到多糖 沉淀。一般来说，低分子醇类可以满足大多数多糖的沉淀，在 ph=7.0 左右，反 复溶解与醇沉，即可得到粗多糖 72。 用各种沉淀法得到的粗多糖，常含有较多的色素、蛋白质等杂质。而研究 表明，多数情况下，多糖除去蛋白质后具有更强的活性 73，因此应将多糖上蛋 白除去。除去蛋白质常用的方法有 sevage 法 74,75、三氟三氯乙酸法76、三氯乙 6 酸法 77等。各种方法各有利弊，sevage 法较温和，高浓度的三氯乙酸易使糖苷 键断裂，但需反复多次才能将蛋白质除尽。如果除蛋白时加入蛋白水解酶 78,79 （胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等）使蛋白质大分子得到一定程度的降解， 再用 sevage 去除蛋白，效果较好。 1.5 立题依据立题依据 由于化学合成药物具有毒副作用的特点，并且在生产过程中对环境具有较 高的污染，因此，具有活性的天然药物及保健品逐渐受到大众的青睐。在回归 大自然的潮流下，欧美、日本等国加强了对天然活性产物的研究。而我国具有 丰富的动植物、真菌资源，对中草药的应用有几千年的历史。利用现代科学技 术对天然产物的活性成分进行分离、纯化、结构测定、功能等研究，具有广阔 的前景，尤其是对具有生物活性的多糖的研究 80。 姬松茸多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒和降血糖等活性，尤其是其 抗癌作用位居抗癌真菌首位，且具有用量少、抗癌作用强的特点，已得到学术 界的广泛公认 81,82。但是由于姬松茸子实体种植具有周期性长、产量低等特点， 限制了姬松茸产品的大规模工业化生产， 而液体发酵培养则没有以上所述缺点。 肿瘤是常见疾病，恶性肿瘤已成为目前威胁人类健康、导致死亡的主要病 因 83。大量的临床研究表明，许多化学合成的抗癌药物毒副作用较大，治疗时 往往产生耐药性，使得抗癌药物研究开发者的目光转向天然产物，从中获取具 有治疗保健作用的有效成分。真菌多糖由于其安全可靠、具有显著的抗癌活性 及免疫活性增强作用，近几年国内外都在努力开发真菌多糖类生物药物。多糖 可在不损害宿主的情况下，刺激宿主，提高其潜在的免疫功能，抑制肿瘤的生 长，并与化疗药物具有协同效应，抵抗化疗药物对骨髓的抑制等毒副作用 84。 1.6 本文的主要研究内容本文的主要研究内容 本文主要的研究内容分为以下 5 个方面： 1、对姬松茸的培养基组成和配比进行优化，首先采用单因素试验筛选了最佳的 氮源、碳源及金属离子，再采用 plackett-burman 试验设计法、最陡爬坡试验以 及相应面优化法等对培养基进行优化。 7 2、在优化培养基成分的基础上，分别对初始 ph、种龄、接种量、装液量、培 养温度、转速及发酵时间等培养条件进行优化，以得到最大的菌丝体及多糖产 量。 3、在单因素试验基础上，采用中心组合试验法对水和超声提取姬松茸多糖条件 进行优化。 4、采用 mtt 法，通过细胞培养方法，对姬松茸多糖对人肝癌细胞 hepg-2、 人宫颈癌细胞 hela、人咽癌细胞 cne 体外增殖抑制作用进行了研究。 5、对姬松茸多糖的抗氧化活性进行了研究。分别测定了其还原能力、清除 o2-、 清除oh、清除 dpph的能力。 8 第二章第二章 姬松茸摇瓶发酵条件的研究姬松茸摇瓶发酵条件的研究 2.1 引言引言 对药用真菌的驯化和培养，及深层发酵，已经成为药用真菌工业化生产的 主要方式。大型药用真菌的子实体难以在人工条件下培养，生长周期长、产量 低，而液体发酵培养的条件易于控制，发酵周期短，工艺规范，其产品质量稳 定，产量高。深层发酵得到的菌丝体中，很多有效成分均高于子实体。培养基 为微生物生长、繁殖、代谢及合成提供营养物质和原料，还提供所需的环境。 本章实验将应用 plackett-burman 实验设计、爬坡实验以及中心组合设计法 等实验方法对姬松茸的培养基及发酵条件进行优化，以提高姬松茸的胞内多糖 产量。 2.2 实验材料与仪器实验材料与仪器 2.2.1 实验菌株 姬松茸菌：由吉林大学生命科学学院提供。 2.2.2 培养基 斜面培养基：葡萄糖 2 %，酵母浸粉 1 %，蛋白胨 1 %，硫酸镁 0.05 %，磷 酸二氢钾 0.05 %，琼脂粉 1.5 %； 种子培养基： 配制方法与斜面培养基相同， 不加琼脂。 培养基装液量 100ml。 2.2.3 实验试剂 葡萄糖 北京化工厂 蔗糖 北京化工厂 乳糖 天津化学试剂厂 硫酸镁 北京化工厂 甘露醇 中国新兴化工研究所 9 麦芽糖 北京奥博星生物技术公司 蛋白胨 北京奥博星生物技术公司 酵母浸粉 北京奥博星生物技术公司 酵母膏 北京奥博星生物技术公司 多价蛋白胨 北京奥博星生物技术公司 牛肉膏 北京奥博星 尿素 北京化工厂 磷酸二氢钾 北京化工厂 硝酸钾 北京化工厂 氯化钠 北京化工厂 氯化铵 北京化工厂 氯化锌 北京化工厂 氯化钙 北京化工厂 氯化铁 北京化工厂 氯化铜 北京化工厂 硫酸 北京化工厂 氯化锰 北京化工厂 蒽酮 国药集团化学试剂有限公司 维生素 b1 中国惠世生化试剂有限公司 2.2.4 实验仪器 hzs-h 型水浴恒温振荡器 哈尔滨东联电子技术公司 fw100 高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司 skpc-01 电热恒温鼓风干燥箱 新乡市康达新机械有限公司 bp221s 电子天平 德国赛多利斯 可调式微量取液器 德国 eppendorf 5810r 型冷冻离心机 德国 sigma phs-3c 型精密 ph 计 上海雷磁仪器厂 752 型分光光度计 上海仪器有限公司 10 way 型数显恒温水浴锅 金坛富华仪器有限公司 2.3 实验方法实验方法 2.3.1 种子培养方法 将姬松茸菌接入斜面培养基， 在 25恒温培养箱中活化培养 5d。 斜面菌株 活化后，接入种子培养基，在 25恒温振荡器中，150 r/min 培养 5 - 7d。 2.3.2 摇瓶发酵方法 种子培养基接种 5%种子液至液体发酵培养基，于 25恒温振荡器中， 150r/min 培养。 2.3.3 菌丝体干重的测定方法 将姬松茸菌菌丝体抽滤，用去离子水洗涤 4-5 次，真空冻干，并称重。 2.3.4 姬松茸菌多糖的提取 将冻干后的姬松茸菌丝体用粉碎机粉碎后过筛。 取菌粉加入去离子水， 水 料比为 20：1，于水浴锅中 80提取 1h，8000r/min 离心并收集上清液测定多 糖含量。 2.3.5 姬松茸菌多糖含量的测定 糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛化合物与蒽酮缩合产生颜色反应，溶液呈蓝绿 色，在 620 nm 处有最大吸收峰，吸光度与糖含量呈线性关系。 2.3.5.1 试剂配制 蒽酮试剂：称取0.2g蒽酮溶于浓硫酸中，用浓硫酸定容至100 ml。 葡萄糖溶液：精密称取葡萄糖 0.01 g，用去离子水溶解并定容至 100 ml。 2.3.5.2 制作标准曲线 取 100 g/ml 葡萄糖溶液 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 ml， 11 用去离子水补到 1.00 ml 后；分别加入 4.00 ml 蒽酮试剂，立即浸于冰水浴中 冷却。 各管加完蒽酮试剂后置于沸水浴中加热。 煮沸 10 分钟后取出， 用水冷却， 并于室温下放置 10 分钟，用分光光度计于 620nm 处比色。将去离子水用同样 方法处理，作为空白，在 620 处比色。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐 标，做标准曲线。 2.3.5.3 样品含量测定 取多糖浓度 40 g/ml 左右的样品溶液 1.00 ml，加入蒽酮-硫酸试剂，与制 作标准曲线方法相同，620nm 比色测定。根据样品浓度和标准曲线计算多糖含 量。 g 100% g 粗多糖含量（ ） 粗多糖得率 = 原料重量（ ） 2.3.6 试验设计 2.3.6.1 plackett-burman 试验 pb 设计法是一种经济有效的两水平实验设计方法， 它可以利用最少的实验 次数，从众多的考察因素中快速而有效地筛选出主要的影响因子，故而广泛地 用于因子主效应的估计中。与目前常用的随机实验和部分因素实验相比较，该 方法筛选重要因素最为准确、高效。 本实验分别考察了乳糖(1)、酵母浸粉(2)、硫酸镁(3)、磷酸二氢钾( 5)、氯化钠(6)、氯化钙(8)、硝酸钾(9)、维生素 b1(11)八个因素对姬松 茸菌丝体干重产量的影响，每个因素选用-1，1 两个水平。采用 n=12 的实验设 计，实验设计如表 2.1 所示，响应值为菌丝体菌丝体干重，各参数所代表因素及 其水平见表 2.2。 12 表 2.1 plackett-burman 实验设计矩阵 参数/水平 实验 号 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10 x11 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 表 2.2 plackett-burman 实验设计因素水平及编码 编码水平 因素 非编码 编码 -1 1 乳糖 g/l 1 x1 15 30 酵母浸粉 g/l 2 x2 15 30 硫酸镁 g/l 3 x3 0.3 0.6 伪变量 1 4 x4 硫酸二氢钾 g/l 5 x5 0.3 0.6 氯化钠 mmol/l 6 x6 0.005 0.01 伪变量 2 7 x7 氯化钙 mmol/l 8 x8 0.005 0.01 硝酸钾 g/l 9 x9 0.5 1.0 伪变量 3 10 x10 维生素 b1 g/l 11 x11 0.05 0.1 13 2.3.6.2 最陡爬坡实验 最陡爬坡实验是寻找一种快速有效地找到最优点区域的方法。通过 pb 实 验设计，排除了培养基成分中的非关键因素，但由于所用数学模型从本质上是 多元线性方程，只能指出各关键因素的调整方向，难以确定关键因素最佳浓度 区域。因此，要寻找一种快速有效接近最佳浓度区域的方法。最陡爬坡实验根 据各因素的大小确定步长，以相应值变化的梯度方向为爬坡方向，能快速地逼 近最大响应区域。 2.3.6.3 中心组合实验 近年来，随着计算机的普及和统计学软件的发展，利用统计学方法辅助实 验优化越来越受到国内外学者的关注。为了以最经济的方式准确、高效地得到 优化结论。响应面分析法(response surface methodology，rsm) 是一种综合统 计学、数学建模、计算机科学的优化方法，用于优化工艺条件的有效方法。响 应面设计法可以利用最少的实验次数，获得最多的实验信息，这是响应面最大 的优点。该实验设计方法用多元二次回归最为估计工具，考察各因素间相互作 用，及对响应值的作用，可以准确考察因素和响应值之间的关系。 2.3.6.4 模型拟合和验证 通过设计实验所得到的实验数据与模型拟合，可以得到模型方程中的各个 系数。对该函数进行分析可确定出极值点和取得极值的相应的自变量的值。再 按照计算所得到的参数进行实验，用来验证模型的可靠性和确定最后的优化结 果。 2.4 结果与讨论结果与讨论 2.4.1 蒽酮-硫酸法测定多糖标准曲线 多糖含量的标准曲线如图 2.1 所示，得到回归方程： y = 0.00793 x0.0061，r0.9965 式中：x多糖浓度 g/ml； y吸光度值 a620 nm。 14 020406080 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 a620 多糖含量(g) 图 2.1 多糖含量标准曲线 2.4.2 氮源对姬松茸菌发酵的影响 在微生物发酵过程中，氮源是合成真菌氨基酸、蛋白质、细胞质和核酸的 主要成分。由于真菌生理特性、代谢产物合成途径不同，有机氮源对不同真菌 代谢产物合成及生长的影响是不同的。本试验筛选酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏、 多价胨、蛋白胨五种氮源，浓度均为 20 g/l，发酵时间 5 天，考察氮源种类对 姬松茸菌丝体干重及多糖产量的影响，结果见图 2.2 和 2.3。 酵母浸粉酵母膏 牛肉膏 多价胨 蛋 白胨 0 1 2 3 4 5 6 菌丝体干重（g/l） 氮源种类 图 2.2 氮源种类对菌丝体干重的影响 15 如图 2.2 所示， 酵母浸粉对姬松茸菌的生长最有利， 在 25、 转速 150 r/min 的条件下培养 5 天后，菌丝体干重为 5.84g/l。多价胨培养条件下菌丝体干重达 到 4.84g/l，产量仅次于酵母浸粉，但与酵母浸粉相比差距较大。在所用的 5 种 氮源中，牛肉膏作为氮源的培养基中菌丝体中生长最差。因此，选择酵母浸粉 作为姬松茸菌生长的最佳氮源。 图 2.3 为氮源种类对姬松茸菌菌丝体多糖产量的影响。如图所示，当氮源 为酵母浸粉时多糖产量最高，为 0.36 g/l。多价胨次之，牛肉膏最不利于姬松 茸菌多糖的合成。 酵母浸粉 酵母膏牛肉膏多价胨蛋 白胨 0.00 0.08 0.16 0.24 0.32 0.40 多糖产量（g/l） 氮源种类 图 2.3 氮源种类对姬松茸菌多糖的影响 综上所述，姬松茸菌菌丝体生长和多糖合成的最佳氮源为酵母浸粉，因此 在以后的实验中均选择酵母浸粉作为氮源。 2.4.3 碳源种类对姬松茸菌发酵的影响 微生物发酵培养常用的碳源主要有糖类、脂肪和有机酸等，碳源是微生物 发酵过程中培养基主要成分之一。在液体发酵培养中，碳源不但是真菌细胞骨 架的主要成分，也是真菌生长和代谢过程中主要的营养成分。碳源主要用于供 给细胞生命活动所需要的能量。 本实验分别利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、果糖作为碳源， 初始碳源浓度为 30 g/l，摇瓶发酵 5 天，考察不同碳源种类对姬松茸菌菌丝体 16 干重和多糖产量的影响。 从图 2.4 可以看出，不同碳源对姬松茸菌菌体生长的影响是不完全相同的， 当乳糖作为碳源时姬松茸菌丝体干重最大，为可达 9.03 g/l。其次是甘露醇， 菌丝体的干重为 8.95 g/l。当蔗糖作为培养基碳源时菌丝体干重最低，仅为乳 糖的四分之一。 葡 萄 糖 麦 芽 糖乳 糖甘 露 醇蔗 糖果 糖 0 2 4 6 8 10 菌丝体干重(g/l) 碳 源 种 类 图 2.4 碳源种类对菌丝体干重的影响 葡萄糖麦芽糖 乳糖 甘露醇 蔗糖果糖 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 多糖产量（g/l） 碳源种类 图 2.5 碳源对姬松茸菌多糖的影响 不同碳源对姬松茸菌多糖合成影响如图 2.5 所示，培养基中不同碳源对多 糖的合成影响较大。如图 2.5 所示，当乳糖作为碳源时，其菌丝体多糖的产量 为 1.44 g/l，高于其它碳源，比甘露醇作为碳源时高 2 倍。而蔗糖作为碳源时 多糖产量最低。 17 因此，乳糖不仅最适于姬松茸菌丝体生长，而且对多糖的合成也有促进作 用。因此，在以后的实验中选用乳糖作为姬松茸菌发酵培养基的碳源。 2.4.4 金属离子对姬松茸菌发酵的影响 金属离子是生物有机体新陈代谢所必需的物质，是真菌细胞生长的重要因 子。本实验分别研究 na+、ca2+、mn2+、fe3+、zn2+五种金属离子对姬松茸菌菌 丝体干重的影响。加入金属阳离子各自的氯盐，设高、中、低 3 个浓度梯度， 分别为 0.01 mmol/l、0.1 mmol/l 及 0.5 mmol/l，摇瓶发酵时间为 5 天。 从下图可以看出，ca2+和 na 可以促进姬松茸菌菌丝体干重产量。对照组 的菌丝体干重产量为 8.24 g/l，当加入 0.1 mmol/l 或 0.5 mmol/l 的 ca2+菌丝体 干重分别为 8.36 g/l 和 9.03 g/l； 不同浓度的 na 也可以促进姬松茸菌菌丝体的 生长。而金属离子 mn2 、fe2、zn2+不能促进菌丝体的发酵生长，因此在以后 的实验中只加入 na 和 ca2+。 0 2 4 6 8 1 0 f ez nm nc an a 菌丝体干重(g/l) 0 .0 1 m m o l/l 0 .1 m m o l/l 0 .5 m m o l/l 对 照 金 属 离 子种 类 图 2.6 金属离子对姬松茸菌菌丝体干重的影响 2.4.5 plackett-burman 实验设计 表 2.3 plackett-burman 实验设计结果 试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 菌丝体干重 （g/l） 8.53 6.77 6.61 9.016.848.086.456.457.418.23 8.45 7.87 18 通过统计学分析， 各因素及之间的效应、 t 值、 显著性水平等如表 2-4 所示， 通过姬松茸菌菌丝体干重计算得到。按照对姬松茸菌菌丝体干重影响的程度对 各个因素进行排列：酵母浸粉（2）硫酸镁（3）乳糖（1）11 6958。 当p小于0.05时可以认为因素对系统的响应影响显著， 由表 2.4 看出，培养基成分中的酵母浸粉、硫酸镁、乳糖这三个因素对菌丝体 干重的影响较为显著，因此在随后实验中采用重心组合实验设计法对这三个因 素进行进一步的优化。其它的因素的响应系数为正，说明对系统是正效应，因 此调整到高水平浓度，相应系数为负则调整到低水平。调整后各成分浓度分别 为磷酸二氢钾 0.3 g/l，氯化钠 0.6 mg/l，氯化钙 0.9 mg/l，硝酸钾 0.5 g/l，维 生素 b1 0.1 g/l。 表 2.4 plackett-burman 实验中影响菌丝体干重各因素的效应分析 变量 回归系数 t 值 p 值 1 0.177 2.674 0.075 2 -0.805 -12.183 0.001 3 0.183 2.77 0.069 4 - - - 5 -0.022 -0.328 0.764 6 0.113 1.715 0.184 7 - - - 8 0.123 1.87 0.158 9 -0.115 -1.740 0.180 10 - - - 11 0.027 0.404 0.713 2.4.6 最陡爬坡实验 根据 plackett-burman 的实验结果，三个对菌丝体干重产量影响显著的因素 分别为：酵母浸粉、乳糖、硫酸镁，其中硫酸镁和乳糖对菌丝体干重的影响为 正效应，浓度向高水平调整，而酵母浸粉对菌丝体干重影响为负效应，需向低 水平调整浓度。 在最陡爬坡实验中对姬松茸菌生长影响显著的三个因素的变化方向及步长 19 做了相应的设计，具体方案见表 2.5。 表 2.5 最陡爬坡实验设计方案 1 乳糖（g/l） 2 酵母浸粉（g/l） 3 硫酸镁（g/l） 0 22.5 22.5 0.45 0+1 25.0 20.0 0.50 0+2 27.5 17.5 0.55 0+3 30.0 15.0 0.60 0+4 32.5 12.5 0.65 0+5 35.0 10.0 0.70 0+6 37.5 7.5 0.75 如图 2.8 所示， 姬松茸菌丝体的干重从 0 到 0+2增加显著， 从 0+2到 0+6 开始逐渐减少，因此姬松茸菌最佳培养基浓度在 0+2时，即乳糖 27.50 g/l、 酵母浸粉 17.50 g/l、硫酸镁 0.55 g/l 附近。因此选取 0+2作为中心点进行下 一步的中心组合优化实验。 00+1?0+2?0+3?0+4?0+5?0+6? 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 菌丝体干重（g/l） 浓度 (g/l) 图 2.8 最陡爬坡实验结果 2.4.7 培养基的响应面分析法 通过plackett-burman实验结果的分析， 在最陡爬坡实验确定的浓度范围内， 以酵母浸粉、乳糖、硫酸镁为三个变量因素，以姬松茸菌菌丝体干重为响应值， 20 利用中心组合设计方法进行三因素三水平优化， 实验因素水平及编码值如表 2.6 所示，实验结果见表 2.7。 表 2.6 中心组合设计实验因素水平及编码 水 平 编码值 -1 0 1 乳糖（1) x1 20.0 27.5 35.0 酵母浸粉（2） x2 10.0 17.5 25.0 硫酸镁（3） x3 0.40 0.55 0.70 表 2.7 中心组合设计方案及实验结果 试验号 x1 x2 x3 菌丝体干重（g/l） 1 -1 -1 0 7.67 2 -1 1 0 7.05 3 1 -1 0 7.76 4 1 1 0 8.00 5 0 -1 -1 8.18 6 0 -1 1 8.30 7 0 1 -1 7.69 8 0 1 1 7.76 9 -1 0 -1 8.34 10 1 0 -1 8.85 11 -1 0 1 8.90 12 1 0 1 9.38 13 0 0 0 9.39 14 0 0 0 9.51 15 0 0 0 9.45 21 对表中数据进行回归分析，获得二次多项回归方程如下： y9.4760.252 x10.178 x20.158 x30.483 x120.212 x1x20.007 x1x3 1.365 x220.010 x2x30.125 x32 回归方程中各变量对响应值菌丝体干重的影响显著性由f检验来判断。如 果p值越小， 则变量的显著程度就越高。 如表2.8所示， 本实验模型p值为0.0009， 说明模型显著可靠。方程中x1对菌丝体产量的影响呈显著的正相关(p0.05)。 x12、x22对响应值呈显著的负相关。x1x2、x1x3以及x2x3对响应值的影响均不显 著。结果可以看出，本实验中，乳糖和酵母浸粉对菌丝体产量起着显著的作用。 表 2.8 回归分析结果 自由 度 平方和 均方 f 值 方差来源 df ss ms f prf x1 1 0.5100 0.5100 15.0375 0.0116 x2 1 0.2556 0.2556 7.5361 0.0405 x3 1 0.2016 0.2016 5.9440 0.0587 x1 x1 1 0.8625 0.8625 25.4306 0.0039 x1 x2 1 0.1806 0.1806 5.3252 0.0691 x1 x3 1 0.0002 0.0002 0.0066 0.9382 x2 x2 1 6.8880 6.8880 203.0761 0.0001 x2 x3 1 0.0004 0.0004 0.0117 0.9177 x3 x3 1 0.0584 0.0584 1.7236 0.2462 回归 9 8.5681 0.9520 28.0678 0.0009 线性 3 0.9672 0.3224 9.5059 0.0165 平方 3 7.4196 2.4732 72.9164 0.0001 交互 3 0.1812 0.0604 1.7812 0.2669 参差 5 0.1695 0.0339 失拟项 3 0.1565 0.0521 7.9859 0.1133 纯误差 2 0.0130 0.0065 总离差 14 8.7377 22 方程的拟合程度可以通过r2校正值来验证，从表 2.8 可以看出，本实验中 r2校正值为 0.9457，表明在姬松茸菌丝体发酵过程中，约有 94.5%的变异分布 在 3 个所研究的因素中。方程相关系数r为 0.9903，说明菌丝体干重的实际值 与预测值之间有很好的拟合性。根据回归分析结果做出相应的响应曲面图及其 等高线图，以确认乳糖、酵母浸粉、硫酸镁对姬松茸菌丝体干重的影响，结果 见图 2.9 至 2.11。 1 0.5 0 0.5 1 1 0.5 0 0.5 1 6 7 8 9 10 x2 x1 y 图 2.9 12 (,)yf xx=的响应面图和等高线图 1 0.5 0 0.5 11 0.5 0 0.5 1 8 8.5 9 9.5 10 x3 x1 y 图 2.10 13 (,)yf xx=的响应面图和等高线图 23 1 0.5 0 0.5 1 1 0.5 0 0.5 1 7.5 8 8.5 9 9.5 10 x3 x2 y 图 2.11 23 (,)yf xx=的响应面图和等高线图 从以上三个图看出，三个响应面均开口向下，说明菌丝体产量存在极高值。 等高线中心在-11 间，培养基最佳浓度在设计的水平范围之内。三个因素对响 应值的影响及各因素间的交互作用与回归分析结果（表 2.8）吻合。 通过对回归方程分析，sas 工具箱给出了能够得到最大响应值（y）的x1、 x2、x3对应的编码值：x1=0.24，x2=-0.048，x3=0.62，即在培养基中乳糖 29.34 g/l， 酵母浸粉 17.13 g/l， 硫酸镁 0.64 g/l， 此时菌丝体干重预测值为为 9.56 g/l。 2.4.8 验证实验验证实验 在最佳培养基浓度下培养姬松茸菌，以验证模型预测的准确性，实验重复 三次。三次平行实验的结果分别为 9.71 g/l、9.74 g/l、9.61 g/l，平均干重为 9.68 g/l，与预测值 9.56 g/l 误差为 1.34。因此，该模型能较好地预测姬松茸 菌丝体产量。 2.4.9 初始初始ph值对姬松茸菌发酵的影响值对姬松茸菌发酵的影响 ph 值会影响真菌细胞膜和线粒体膜两侧的电位，从而影响物质运输、离子 通透、还原力的生成、能量代谢、线粒体中的氧传递76，最终影响菌丝体的生 长和代谢产物合成。本实验考察初始 ph 对菌体生长的影响。因此将培养基的 24 初始 ph 分别调至 4.08.0，考察其对姬松茸菌菌丝体生长及多糖合成的影响， 实验结果如图 2.12、2.13。 45678 6 7 8 9 10 11 12 菌丝体干重（g/l） 起始ph值 图 2.12 初始 ph 值对菌丝体干重的影响 ph 值对姬松茸菌菌丝体干重的影响如图 2.12 所示，从上图可以看出，当 初始 ph 值为 5.0 时，菌丝体产量最大。 45678 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 多糖产量（g/l） 初始ph值 图 2.13 初始 ph 值对多糖的影响 如图 2.13 所示，初始 ph 值对多糖产量的影响与菌丝体干重的影响基本相 同，当起始 ph 值为 5.0 时得到的多糖产量最高。 综上所述，为了得到最大姬松茸菌丝体干重和多糖产量，将培养基的初始 ph 值设为 5.0。 25 2.4.10 种龄对姬松茸菌发酵的影响种龄对姬松茸菌发酵的影响 真菌发酵种龄如果过于年轻则生长缓慢，过老则引起生产能力下降。因此 要选用菌丝种龄处于对数生长期的菌种。种龄对姬松茸摇瓶培养的影响如图 2.14 和 2.15 所示。 从图 2.14 看出，种龄小于 5 天时，菌丝体干重随着种龄增加而增加；当种 龄大于 6 天时，菌丝体干重随着种龄的增加而降低，可能由于菌丝开始自溶。 12345678910 3.0 4.5 6.0 7.5 9.0 10.5 菌丝体干重（g/l） 种龄（天） 图 2.14 种龄对菌丝体干重的影响 种龄对多糖的影响如图 2.15 所示，从图看出，当种龄为 5 天时，多糖产量 最高。随着种龄的增加，菌丝体中多糖的含量逐渐降低。 12345678910 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 多糖产量（g/l） 种龄（ 天） 图 2.15 种龄对多糖的影响 26 综上所述，当种龄为 5 天时，菌丝体干重和多糖产量最优。因此选择种子 液种龄为 5 天。 2.4.11 接种量对姬松茸菌发酵的影响接种量对姬松茸菌发酵的影响 在真菌发酵过程中，较大的接种量可缩短菌体生长周期，增加产量，但是 接种量过大会影响菌体的生长和代谢产物的合成。 接种量过小会增加染菌概率， 延长发酵时间。 因此， 选择最佳接种量可以保证发酵正常进行。 本实验采用 1%、 3%、5%、7%、9%和 11%的接种量进行发酵试验，实验结果如图 2.16 和图 2.17 所示。 结果如图 2.16 所示，接种量对菌丝体产量的影响较为显著，随着接种量的 增加，菌丝体产量随着增加；当接种量增加到 7%时，菌丝体干重不再增加，继 续增加接种量菌丝体产量降低。因此选择姬松茸菌最佳接种量 7%。 1%3%5%7%9% 6 7 8 9 10 11 菌丝体干重(g/l) 接种量(v/v) 图 2.16 接种量对菌丝体干重的影响 从 2.17 看出，随着接种量的增加，姬松茸多糖产量也随之增加，当接种量 大于 7%后多糖产量逐渐降低，在接种量为 7%时得到的胞内多糖产量最高。综 上所述，选择最优接种量为 7%，可以得到最大的菌丝体及多糖产量。 27 1%3%5%7%9% 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 多糖产量（g/l） 接种量（v/v） 图 2.17 接种量对多糖产量的影响 2.4.12 装液量对姬松茸菌发酵的影响装液量对姬松茸菌发酵的影响 氧是需氧微生物能量代谢的重要物质，微生物物质代谢与能量代谢同时进 行。摇瓶培养时，培养基越少，转速越大，则溶氧越多。反之，则溶氧越少。 本实验研究培养基装液量对菌丝体干重和多糖产量的影响，结果见图 2.18 及 2.19 所示。 5060708090100110 6 9 12 15 18 菌丝体干重（g/l） 装液量（ml/250ml） 图 2.18 装液量对菌丝体干重的影响 28 从图 2.18 看出， 当装液量为 60 ml 时， 菌丝体干重达到最大， 为 13.69 g/l。 随着装液量的增加， 菌丝体产量降低， 当装液量为 110 ml 时， 菌丝体干重最低， 仅为 8.49 g/l。说明姬松茸菌发酵时需氧量较大。 5060708090100110 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 多糖产量（g/l） 装液量（ ml/250ml） 图 2.19 装液量对多糖产量的影响 图 2.19 为装液量对多糖产量的影响。如图所示，当装液量为 60 ml 时，多 糖的产量最大。当菌丝体产量高时，多糖产量也高，反之多糖产量低。因此， 我们采用最佳装液量为 60 ml。因此我们优化的最佳装液量为 60ml/250ml。 2.4.13 温度对姬松茸菌发酵的影响温度对姬松茸菌发酵的影响 温度对真菌的生长和代谢产物的合成十分重要的77。温度升高，酶的活性 增加，但温度过高则酶失活，而不同真菌的最适生长温度也不同。本实验研究 了温度对姬松茸菌丝体和多糖产量的影响，结果见图 2.20 和 2.21。 如图 2.20 所示，温度对姬松茸菌的生长影响显著。当温度为 22时，菌体 生长较为缓慢，菌丝体干重仅为 3.15 g/l；当培养温度达到 26时，菌体干重 达到 13.83 g/l。 29 2224262830 0 3 6 9 12 15 菌丝体干重（g/l） 培养温度（ ） 图 2.20 培养温度对菌丝体干重的影响 图 2.21 为培养温度对多糖产量的影响，当培养温度为 26时多糖产量最 高；当温度大于 26时，多糖产量显著降低，说明高温条件不利于姬松茸菌生 长及合成多糖。综上所述，我们在以后实验中选择姬松茸菌的最佳培养温度为 26。 2224262830 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 多糖产量（g/l） 培养