益生元因可增加肠道益生菌的种群数量

益生元因可增加肠道益生菌的种群数量，并可有效改善机体健康状态而备 受学者的关注。已有大量研究表明非消化性的低聚糖具有良好的益生元作用， 且性质稳定、安全无毒。因此开发新型功能性益生元，是益生元研究和工业化 发展的重要方向。本文拟以人参多糖益生菌菌株为研究对象，对人参多糖的潜 在益生元活性及合生元的功能性进行评价。 利用气相色谱检测了不同菌株发酵液中乳酸和短链脂肪酸的含量，结果表 明不同菌株所产生的主要短链脂肪酸均为醋酸，含量由 0.55 到 1.18mg/mL，且 菌株 C88 总短链脂肪酸产量均高于其它菌株。利用 DPPH 自由基、ABTS 自由 基、超氧阴离子自由基清除实验及铁离子螯合实验评价人参多糖与植物乳杆菌 C88 联合使用的体外抗氧化活性，结果表明人参中性多糖与人参酸性多糖分别 与植物乳杆菌 C88 联合使用均具有明显的抗氧化活性，且酸性多糖活性高于中 性多糖。另外，以自然衰老小鼠作为动物模型，通过体内试验检测人参酸性多 糖联合植物乳杆菌 C88 的体内抗氧化活性，结果表明联合用药可抑制衰老小鼠 血清及肝组织中中丙二醛 (MDA) 的形成，提高超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱 甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)。 研究结果表明人参酸性多糖联合益生菌 C88 可明显增强免疫抑制小鼠吞噬 细胞的吞噬能力及迟发型超敏反应结果，小鼠血清白细胞介素-2（IL-2） 、白细 胞介素-4（IL-4） 、干扰素-（INF-） 、肿瘤坏死因子-（TNF-） ，免疫球蛋白- g（IgG）含量明显升高，白细胞介素-10 含量明显下降，并且均具有一定的剂 量依赖性，同时联合用药组的作用效果要明显强于酸性多糖单独用药组。 称取干燥人参根粉末 200g，按 1:10 比例加入蒸馏水浸泡过夜，100提取 两次，每次 2 小时，合并提取液并过滤（6 层纱布） ，浓缩滤液至 800mL，加入 3 倍量无水乙醇醇沉，过夜（4） 。收集沉淀，加尽量少蒸馏水充分溶解，离 心（20min，3800rpm，4） ，收集上清液，重复 3 次后，硫酸-苯酚法显色检测 基本无多糖，合并上清液，于-80冷冻后干燥，得粗人参多糖(WGP)。 1.2.1.2 人参粗多糖分离纯化 称取上述制备的人参总多糖加水溶解，离心，取上清，重复 3 次，合并上 清液，弃沉淀，利用 DEAE-纤维素离子交换层析柱，分别以蒸馏水和 0.5MNacl 为洗脱剂。上样后，首先以蒸馏水进行洗脱，后以 NaCl 溶液（0.5 M）进行洗脱。洗脱液利用自动部分收集器收集，合并含多糖的洗脱液部分 （检测方法：硫酸-苯酚显色法） ，透析（透析袋分子量 3500Da）2-3 天后于- 80冷冻干燥，分别得中性多糖(WGPN)及酸性多糖(WGPA)，收集备用。 1.2.2 人参多糖益生元活性评价 1.2.2.1 菌株来源及培养基 菌株来源：菌株“C”分离于内蒙古奶豆腐，菌株“S”分离于东北传统发酵酸菜。 上述菌株均已通过 API50 CHL 试剂盒及 16S rDNA 序列分析鉴定为植物乳杆菌。 配制含人参多糖的 SDM 培养基时除添加葡萄糖外，其它均同。分别以葡萄糖、 人参酸性多糖、人参中性多糖为碳源，配制相同浓度（2g/L）的 SDM 培养基。 1.2.2.2 人参多糖对植物乳杆菌益生元活性测定 菌株分别用上述培养基进行培养，初步筛选出生长状况相对良好的菌株并 测定菌株生长曲线。生长曲线测定方法：无菌操作条件下，将已配制的含不同 人参多糖或葡萄糖的 SDM 培养液分装于无菌 10mLEP 管中，每管 3mL，按 3% 接菌量，于 37培养箱培养，于培养 0、4、8、12、16、20 小时时测定 OD600 值。 分别将不同时间段培养液取出后离心（4000rpm，5min，4）得菌泥，加 入等体积的生理盐水（0.85%NaCl，3ml） ，充分混匀后，利用紫外-分光光度计 于 600nm 测定 OD 值，记录不同菌株的生长情况，筛选出菌株生长趋势最为明 显的菌株。 1.2.3 短链脂肪酸分析测定 短链脂肪酸的测定根据 Schneider 等59的描述，利用气相色谱进行测定。分 别用人参酸性多糖 SDM 培养基及人参中性多糖 SDM 培养基培养上述已筛选菌 株，每株 4ml 按 3%接菌量，37厌氧培养 20h 后，取 2mL 培养液至已灭菌的 10mLEP 管中，加入 0.5mL 质量分数为 2%的硫酸铜溶液杀死菌株。取 2mL 上 述含硫酸铜的培养液于 EP 管加入 0.4mL 质量分数 50%的硫酸和 2mL 乙醚混匀， 于摇床 250r/min 振荡摇匀 45min，后离心（3000r/min，5min） ，取上清液于另 一无菌 EP 管中，加入无水氯化钙脱水，取上清液利用气相色谱测定甲酸、乙 酸、丙酸、丁酸、异戊酸及乳酸的质量浓度。 短链脂肪酸测定采用外标法，用乙酸、丙酸、正丁酸、异戊酸和乳酸做标 准曲线，检测器为氢火焰检测器（FID） ；色谱条件为载气 N2，分流比 10:1，流 速 2.0mL/min；用 DB-FFAP 色谱柱（60 米，内径 0.25 mm） ；升温程序：120 维持 5min，以 15/min 升到 250保持 1min，燃烧炉温 280，待测样品体 积为 2uL。 1.3 结果 1.3.1 人参多糖的提取及纯化 根据张旭等的31描述方法，利用水提醇沉法从干燥人参根中提取水溶性多糖， 通过 Sevag 法除蛋白后，得到粗多糖，即为水溶性人参粗多糖，其提取率约为 8.2%（W/W） 。收集得到的人参总多糖利用 DEAE-纤维素离子交换层析住进行 分离纯化，以蒸馏水为洗脱剂得到未吸附多糖部分，即中性多糖，以 0.5M NaCl 为洗脱剂得到吸附多糖部分，即酸性多糖，回收率分别为 50.6% 和 14.3%。 “益生元”是一种不易被消化的食品成分，通过选择性刺激一种或少数种菌 落中的细菌活性与生长而对宿主产生有益的影响，最终改善宿主的健康状态60。 研究报道表明某些低聚糖具有益生元活性，如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木 糖等61-62 。这些复杂的碳水化合物在小肠内不被消化，在结肠可优先促进双歧 杆菌和植物乳杆菌的生长。最为人们所熟知的即为菊糖和低聚果糖，可选择性 的刺激双歧杆菌的生长63-65。因为对于益生元需求的日益增加，所以目前对于发 现新的具有潜在益生元活性的碳水化合物受到极大关注。进一步的研究重点主 要是针对自然资源中所提取的多糖进行益生元活性的探索，如：挪威云杉、金 莲花、平菇、杏鲍菇等自然资源中所提取的多糖。人参多糖作为人参中主要的 活性成分，许多研究致力于人参多糖的提取，分离，纯化，结构分析及活性研 究等，而对其益生元活性的研究报到甚少，本实验主要以人参中提取分离的中 性多糖及酸性多糖为碳源培养并筛选生长状态良好的不同来源的植物乳杆菌菌 株，同时检测了人参多糖对不同菌株短链脂肪酸产量的影响。 本研究对于人参多糖潜在益生元活性的评价是通过植物乳杆菌对多糖的利 用,发酵过程中以其作为主要的碳源进行生长而测定。实验结果表明 10 株植物 乳杆菌在不同的人参多糖中表现出不同的生长特性。这一结果与一些学者所报 道的研究结果相一致66。益生菌对不同多糖的降解或发酵能力在不同种的植物 乳杆菌或同一种群的不同株植物乳杆菌中具有较大差别67。另外，研究表明人 参中性多糖的益生元活性要强于人参酸性多糖。导致这种结果的原因可能是因 为人参多糖的结构特征所导致，如：分子量，单糖组成，分子构象等都可能是 影响多糖益生元活性的重要因素。 样品配制样品配制：分别称取中性人参多糖及酸性人参多糖以蒸馏水为溶剂配制浓度为 0、0.5、1、2、4mg/ml 的多糖溶液；以维生素 C（Vc）或乙二胺四乙酸 （EDTA）作为阳性对照，配制相同浓度的对照溶液；同时培养并制备 1010CFU/ml浓度的 C88 菌液。 实验分组实验分组：1 Vc 阳性对照组；2 人参酸性多糖组；3 人参中性多糖组；4 人参 酸性多糖联合益生菌 C88 组（等体积 C88 菌泥与多糖溶液混匀）； 5 人参中 性多糖联合益生菌 C88 组（等体积 C88 菌泥与多糖溶液混匀） 。 2.2.1.1 DPPH 自由基清除作用 1.5ml 各样品溶液分别加入 1.5ml 0.1mmol/L DPPH 无水乙醇溶液（避光保 存，现配现用） ，混匀，室温避光静置反应 30min 后离心 （4000r/min，10min，4） ，取上清液于 517nm 处测定吸光度值，DPPH 自由 基清除率计算公式如下： 7mmol 的 ABTS 溶液与 2.45mmol 的过硫酸钾溶液等体积充分混匀，室温 避光条件下反应 16h。使用时 ABTS+溶液利用乙醇溶解稀释，使得其在 734nm 处的吸光度值为 0.70.02。分别取不同浓度的样品溶液各 0.5ml 与 2.5ml ABTS+溶液充分混匀，室温下反应 6min 后离心（4000rpm，10min，4） ，在 734nm 处测定吸光度值。去离子水代替样品作对照，乙醇空白，ABTS 清除率 计算方法如下： 5mL 0.05mol Tirs-HCl 缓冲液（PH=8.2）25水浴 20min，再加入 2mL 样 品溶液及 0.4mL25mM 邻苯三酚溶液，相同温度下培养 5min，最后向反应体系 中加入 0.5mL HCl 终止反应，10min 后离心（6000rpm，10min，4）取上清 320nm 条件下测定吸光度，超氧化物阴离子清除率计算公式如下： 1mL 不同浓度的样品溶液分别与 0.05mL 2mM 的 FeCl2溶液充分混匀，静 置 5min 后，分别加入 0.2mL 5mM 的菲咯嗪及 2.75mL 的蒸馏水，充分振荡混 匀，室温下静置反应 10min 后离心（4000rpm，10min，4）取上清。于 562nm 处测定吸光度值。EDTA 作为阳性对照。铁离子螯合能力计算方法如下： 衰老雄性昆明小鼠（20 月龄，35-45g）与青年雄性昆明小鼠（3 月龄，18- 22g）购于长春高新医学动物实验研究中心。22，昼夜循环各 12h 条件下饲养， 适应性喂养 1 周，实验期间自由进食进水。 衰老昆明小鼠随机分为 5 组，每组 8 只，分别为衰老小鼠对照组，人参 多糖联合益生菌 C88 高剂量组（多糖 200mg/kg+菌 1010CFU/mL） 、中剂量组 （多糖 100mg/mL+菌 109CFU/ml） 、低剂量组（多糖 50mg/kg+菌 108CFU/mL） 及 Vc 阳性对照组，实验组灌胃给药，每日一次，连续给药 20 日。青年昆明小 鼠（8 只）作为正常对照组。衰老小鼠对照组及青年小鼠正常对照组灌胃给予 相同体积的生理盐水。最后一次给药 24h 后称取小鼠体重后脱颈处死小鼠，收 集血液样品。解剖分离小鼠脾脏、胸腺及肝脏。称取小鼠脾脏及胸腺湿重，计 算胸腺、脾指数，计算公式如下： 末次给药 24h 后，处死小鼠取血，37放置 1h，4放置 3h，离心 （3000r/min，10min,4）制备血清，-20保存。肝脏制备成 10%的冰的生理 盐水阻止匀浆，离心（3500 r/min，10min,4） ，取上清，-20保存。测定血清 及肝组织中丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、总 抗氧化活力（T-AOC）活力，超氧化物歧化酶（SOD）活力、过氧化氢酶 （CAT）活力，采用比色法测定，按试剂盒说明书操作。 2.1.3.3 数据分析 采用 SPSS17.0 软件利用方差分析完成统计处理。计量数据以表示；sx 计量资料组间差异比较采用 t 检验。差异显著水平为 P0.05，极显著水平为 P0.01。 2.4 体外抗氧化检测结果 2.4.1 DPPH 自由基清除作用 DPPH 是一种稳定且显紫色的自由基，最大吸收波长在 517nm，广泛用于 评价抗氧化剂的自由基清除活性，当 DPPH 与抗氧化剂发生反应时，DPPH 转 变为无自由基形式的 DPPH-H 形式，紫色迅速褪去，与其它方法相比较更方便， 且敏感度高，可检测较低浓度抗氧化剂的抗氧化活性。图 2.1 结果表明以 Vc 作 阳性对照，人参中性多糖及人参酸性多糖均呈现不同程度的抗氧化活性，且酸 性多糖的 DPPH 清除活性高于中性多糖的清除活性，且具有剂量依赖性。当两 者分别与益生菌 C88 联合使用时两者 DPPH 自由基清除作用均明显增强，酸性 多糖的浓度 4mg/ml 与 C88 联合作用清除率达到最高并与阳性对照 Vc 活性相当， 可达 96.7%。 2.4.2 ABTS 自由基清除作用 ABTS 实验常用于评价植物中某单一物质及混合物的总抗氧化能力。本研 究中，多糖样品对 ABTS 自由基的清除能力如图 2.2 所示，结果表明，人参酸 性多糖及人参中性多糖单独存在时均具有较强的 ABTS 自由基清除作用，且酸 性多糖的清除能力强于中性多糖，且作用强度具有剂量依赖性。当两者分别与 益生菌 C88 联合作用时，清除自由基能力均提高，当人参酸性多糖的浓度在 4mg/ml 与益生菌共同作用时，清除自由能力与阳性对照 Vc 相当。 2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力 超氧阴离子是单线态氧和羟基自由基前体的一种形式，虽然它是一种相对 较弱的氧化剂，但其可形成更强的活性氧化物质，诱导脂质、蛋白或 DNA 的 氧化损伤而造成脂质过氧化或细胞损伤，因此超氧阴离子自由基清除作用在抗 氧化过程中具有重要作用。多糖联合益生菌的的超氧阴离子清除作用如图 2.3 所示，结果表明人参酸性多糖及人参中性多糖抗氧化能力不及阳性对照 Vc，自 由基清除能力随浓度增加强度缓慢增强，当两者分别与益生菌 C88 共同作用时， 清除活性有一定程度的提高，当酸性多糖及中性多糖浓度在 4mg/mL 与 C88 联 合作用时，自由基清除率分别为 45.20%、34.10%。 2.4.5 铁离子螯合能力 金属螯合能力可能与抗氧化活性有关，也可能影响与抗氧化活性相关的其 它功能。 2.5.1 脏器指数 如图 2.5 所示人参酸性多糖联合益生菌 C88 对衰老小鼠脏器指数的影响， 结果表明衰老小鼠对照组肝脏指数比正常青年小鼠对照组低，并且有显著性差 异（P0.05） 。 总抗氧化活性（T-AOC）可以反映非酶抗氧化防御系统的能力。如图 2.6 所示与青年正常小鼠相比，衰老组小鼠血清及肝组织中总抗氧化能力明显降低， 差异非常显著（P0.01） ；给药中剂量组与高剂量组小鼠血清及肝组织总抗氧化 能力与衰老组小鼠相比明显增强（P0.05 或 P0.01） ，低剂量组无明显变化。 表 2-1 表明了人参酸性多糖联合益生菌 C88 对小鼠血清及肝组织中抗氧化 酶活性的影响结果。超氧化物歧化酶（SOD）属于细胞内抗氧化活性酶，通过 超氧阴离子抑制氧化反应的开始。结果表明与正常组小鼠相比，衰老组小鼠血 清及肝组织中 SOD 活性均明显降低（P0.01） ，给药中剂量组，高剂量组肝组 织 SOD 有明显增强（P0.05 或 P0.01） ，给药高剂量组小鼠血清 SOD 活性与 衰老组小鼠相比有明显增强。 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测结果表明，与正常组小鼠相比， 衰老组小鼠 GSH-Px 活性明显降低，差异显著（P0.05） ，给药高剂量组小鼠血 清 GSH-Px 活性明显增强与衰老组小鼠相比，差异极显著（P0.01） ，但其影响 作用不及阳性对照 Vc。 衰老小鼠组血清及肝组织中过氧化氢酶（CAT）活性与正常组小鼠相比明 显降低，且差异极显著（P0.01） ；与衰老小鼠相比，给药中剂量组小鼠肝组织， 给药高剂量组小鼠血清及肝组织中 CAT 活性均明显增强，差异极显著 （P0.01） 。 丙二醛（MDA）是判断脂质过氧化的主要指标。本实验丙二醛测定结果如 图 2.7 所示，衰老小鼠血清及肝组织中 MDA 含量与正常青年小鼠相比明显增加， 表明随着年龄的增大丙二醛产量增加，氧化损伤的程度加深，低、中、高剂量 给药组小鼠血清及肝组织中 MDA 含量与衰老组小鼠相比均明显降低（P0.05 或 0.01） 。 通过 DPPH 自由基清除作用，ABTS 自由基清除作用，超氧化物阴离子清 除作用实验进行检测验证。DPPH 自由基因其稳定性已广泛被用于检测抗氧化 剂的自由基清除活性实验，而抗氧化剂对 DPPH 自由基的清除活性又与其本身 的供氢能力有关，结果显示人参酸性多糖联合植物乳杆菌 C88 对 DPPH 自由基 的清除活性比多糖单独作用时明显增强 ，并且具有剂量依赖性。ABTS 自由基 清除实验可用于评价混合物的抗氧化活性，在波长 734nm 处所测定的指标可反 应出有机溶剂或水溶剂所提取的多糖的抗氧化活性能力，结果显示人参酸性多 糖联合植物乳杆菌 C88 对 ABTS 自由基的清除活性明显强于单独的人参酸性多 糖，上述结果表明人参酸性多糖与植物乳杆菌 C88 之间可能存在协同抗氧化的 作用。虽然超氧化物阴离子清除活性及金属离子螯合实验对于检测抗氧化剂的 抗氧化活性也具有重要的作用，然而人参多糖联合植物乳杆菌 C88 对超氧阴离 子的清除活性及铁离子螯合能力的协同作用效果并不明显。虽然协同作用的机 理尚不清楚，但基于抗氧化活性试验所得到的结果，可以说明人参酸性多糖与 植物乳杆菌 C88 的混合物在抗氧化活性中具有重要的作用。 天然抗氧化酶是重要的防御系统，保护细胞免受氧化损伤。如超氧化物歧 化酶（SOD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及过氧化氢酶（GAT）是重要 的自由基清除酶，也是机体抵抗氧化代谢产物的二级防御系统。抗氧化酶被认 为是防止生物大分子免受氧化损伤的一个主要防御机制。SOD、GSH-Px 及 CAT 是三种重要的抗氧化酶，许多研究表明一种或多种抗氧化酶可缓解衰老的 后果。 2.7 小结 上述结果表明人参多糖与植物乳杆菌 C88 联合用药体内及体外均具有明显 的抗氧化活性，体外实验结果表明，联合用药作用效果明显高于多糖单独作用 效果，且酸性多糖联合用药组高于中性多糖联合用药组。体内实验进一步证明 人参酸性多糖联合植物乳杆菌 C88 可明显改善自然衰老小鼠的血清抗氧化指标， 增强抗氧化功能，且具有剂量依赖性。由此表明人参多糖联合益生菌 C88 可作 为抗氧化剂且两者可能存在叠加或协同的抗氧化作用，其具体机理需进一步研 究证明。SPF 级雄性 ICR 小鼠（18-22g） ，购自长春市亿斯实验动物技术有限责 任公司。实验室条件下，20左右，12 小时昼/夜循环，自由进食进水，适应性 喂养一周。小鼠随机分为六组，每组 15 只，分别为正常对照组（Normal），模 型对照组（Model） ，人参酸性多糖组 100mg/kg/d（WGPA）以及人参酸性多糖 100mg/kg/d 结合益生菌 C88 108CFU/mL 低剂量组（WGPA+C88 Low dose） ，人 参酸性多糖 100mg/kg/d 结合益生菌 C88 109CFU/mL 中剂量组（WGPA+C88 Middle dose） ，人参酸性多糖 100mg/kg/d 结合益生菌 C88 1010CFU/mL 高剂量组 （WGPA+C88 High dose） 。除正常对照组外，其余各组实验动物于实验 1-3 天 腹腔注射环磷酰胺（80mg/kg/d） ，制造免疫抑制模型。于实验 4-21 天分别灌胃 给予不同剂量的各样品。最后一次给药 24h 后称重，摘眼球取血，37放置 1h，4放置 1h，离心（2800r/min，10min，4）制备血清，-20保存。取血 后解剖分离胸腺，脾脏，肝脏，肾脏及心脏并称取重量，计算脏器指数。 样品准备：利用优化 MRS 培养基培养 C88 菌株 优化 MRS 培养基配制：果糖 10g，葡萄糖 20g，大豆蛋白胨 26.7g，酵母 浸粉 13.3g，柠檬酸钠 5g，无水乙酸钠 5g，磷酸氢二钾 2g，硫酸镁 0.2g，硫酸 锰 0.05g，吐温 1mL。量取 500mL 蒸馏水，倒入烧杯，充分溶解并混匀，115， 20min 灭菌。 3.2.2 脏器指数测定 末次给药 24h 后，称量小鼠体重，处死后立即摘取心脏、肝脏、脾脏、胸腺 和肾脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后分别称取内脏重量后按下列公式计算脏器 指数： 最后一次给药 24h 后，小鼠称重，尾静脉注射印度墨汁（1:4 稀释） ，按 0.05mL/10g 注射剂量，注射后立即计时，分别于 2min 及 10min 时眼静脉丛取 血 30uL，血液样本与 3mL0.1%Na2CO3混匀，600nm 测定定吸光度，0.1% Na2CO3作空白，取血完毕后立即处死小鼠，分离肝、脾，吞噬指数计算方法如 下： 1% 2,4-二硝基氟苯（DNFB）20mg，将称取药品置于干净小瓶，将预先配 好的丙酮橄榄油溶液（丙酮：橄榄油 V/V=1，各 1mL 倒入小瓶内，盖好并封口,混 匀后即可使用，现配现用。 脱毛剂配制：硫化钡 10g，淀粉 2g，加水至 100mL，混匀后即用。 测定方法：造模后于给药第 13 天用脱毛剂对小鼠腹部进行去毛处理，面积 约 22cm2，次日给小鼠腹部致敏，以 1%DNFB 30uL 涂于小鼠腹部脱毛处，次 日强化，于致敏第 4 日（给药第 18 日）小鼠右耳两侧均匀涂以 DNFB 20uL， 丙酮橄榄油溶剂涂于小鼠左耳两侧，于攻击 24h 后处死小鼠，剪下两耳，称重， 以左右耳质量差作为耳肿胀度。 3.2.5 生化指标检测 获取血液样本制备血清后，利用 ELISA 针对性检测试剂盒测定血清中白细 胞介素-2（IL-2） ，白细胞介素-4（ IL-4） ，白细胞介素-10（IL-10） ，干扰素- （IFN-） ，肿瘤坏死因子-（TNF-） ，免疫球蛋白-g（IgG）的活性。 3.2.5 数据分析 采用 SPSS17.0 软件利用方差分析完成统计处理。计量数据以表示；sx 计量资料组间差异比较采用 t 检验。差异显著水平为 P0.05，极显著水平为 P0.01。 3.3 检测结果 3.3.1 对免疫抑制小鼠脏器指数的影响 胸腺及脾脏属于非常重要的免疫器官，胸腺及脾脏指数可以指明机体的免 疫功能及预后情况。如表 3-1 所示人参酸性多糖联合益生菌 C88 对衰老小鼠脏 器指数的影响，结果表明模型组小鼠各脏器指数与正常对照组相比均有所降低。 人参多糖联合益生菌 C88 低、中、高剂量组小鼠胸腺指数明显增加，且差异显 著，具有一定的剂量依赖性；单独酸性多糖组胸腺指数增加不明显。酸性多糖 给药组及不同剂量的联合用药组小鼠与模型组相比脾脏指数均明显增加。人参 多糖联合益生菌 C88 高量组小鼠肾脏指数明显增加。另外，人参多糖联合益生 菌给药组小鼠胸腺、脾脏、心脏，肝脏指数均高于多糖单独给药组。表明人参 多糖联合益生菌 C88 可明显改善环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫器官指数。 利用碳清除实验检测不同样品对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响， 结果如图 3-1 所示，模型组小鼠吞噬指数 k 与正常对照组相比均明显下降，且 差异显著，表明免疫抑制小鼠造模成功。与模型组相比，人参酸性多糖联合益 生菌 C88 中，高剂量组吞噬指数明显高于模型对照组（P0.05 或 p0.01） ，且 具有剂量依赖性。当高剂量组人参多糖 100mg/kg 与 C88 1010cfu/mL 联合用药时， 小鼠吞噬细胞吞噬指数可恢复到正常小鼠水平。同时有结果可知，人参多糖联 合益生菌共同用药作用结果强于多糖单独用药。因此人参多糖联合益生菌可增 强免疫抑制小鼠的吞噬细胞的吞噬能力，达到增强免疫的效果。 2,4-二硝基氟苯所致小数耳廓迟发型超敏反应属于典型的型变态反应模型， 是由抗原诱导的一种细胞性免疫应答，作为迟发型超敏反应模型广泛用于药物 试验研究中。由图 3-2 结果可知，模型组小鼠耳肿胀度与正常组小时相比明显 下降（p0.01） ，表明环磷酰胺降低小鼠迟发型超敏反应的模型成功。与模型组 小鼠相比，不同给药组小鼠耳肿胀度均明显增加，且人参多糖联合益生菌 C88 不同剂量给药组对小鼠耳肿胀度的影响具有剂量依赖性，联合用药中，高剂量 组小鼠耳肿胀度均高于多糖单独用药。当高剂量组人参多糖 100mg/kg 与 C88 1010cfu/mL 用药时，免疫抑制小鼠迟发型超敏反应结果与正常对照组小鼠相当， 耳肿胀度为 0.035g。 IL-2 是由活化的 T 细胞产生，对不同类型的免疫细胞均具有很强的免疫调节作 用。IL-4 在免疫球蛋白 E（IgE）的合成中扮演重要的角色，通过激活前辅助 T 细胞转化为型辅助细胞（Th2） ，从而触发 B 细胞中相同类型免疫因子的转 化，使免疫球蛋白 M（IgM）或免疫球蛋白 G(IgG)转化为免疫球蛋白 E（IgE） 。 IL-4 也被证明可抑制干扰素 （IFN-）的产生及降低 Th1 细胞的分化。白细 胞介素-10（IL-10） 是重要的免疫调节细胞因子，通过影响肿瘤坏死因子- （TNF-）的产生而参与到炎症反应的调解过程中。IL-10 在感染疾病过程中 也发挥着重要作用，例如，流行性脑脊髓膜炎的不断演变演变便与血清中 IL-10 的浓度有着至关重要关系，如果患者血清中 IL-10 含量过高会导致病情加重或 致命的结果，对于病情轻微或较好预后效果的患者血清 IL-10 含量较低。IFN- 是由活化的 T 细胞及自然杀伤细胞（NK 细胞）产生，是 I 型辅助 T 细胞( Th1 细胞)的重要细胞因子，可激活抗原提呈细胞，通过上调转录因子 T-bet 而促进 Th1 细胞的分化。TNF- 是主要是由活化的单核-巨噬细胞所分泌，其次活化的 NK 细胞，抗原刺激的 T 细胞以及肥大细胞也可产生，能够使肿瘤发生出血坏 死。IgG 是生物体液中重要的免疫球蛋白，在抗感染过程中扮演重要的角色。 如图 3-3 所示模型组小鼠血清 IL-2 和 IL-4 与正常对照组相比含量明显下降， IL-10 含量明显增加，表明环磷酰胺诱导的免疫抑制模型造模成功。结果可知， 人参酸性多糖联合益生菌 C88 中、高剂量组免疫抑制小鼠血清 IL-2 含量与模型 组小鼠相比明显增加，差异显著（p0.05 或 p0.01） 。与模型组相比，人参多 糖联合益生菌 C88 中、高剂量组免疫抑制小鼠血清 IL-4 含量显著增加 （p0.01） ，且与正常组相当，分别可达 43.082pg/mL 和 45.153pg/mL。人参酸 性多糖组及人参酸性多糖联合益生菌 C88 低、中、高剂量免疫抑制小鼠血清 IL-10 含量与模型组小鼠相比含量明显降低，且差异极显著（P0.01） ，当用药 浓度为高剂量，酸性多糖 100mg/kg 联合 C88 1010cfu/mL 时，小鼠血清 IL-10 浓 度可恢复至正常小鼠水平，浓度为 57.989pg/mL。 人参酸性多糖联合益生菌 C88 对免疫抑制小鼠血清 INF-、TNF- 及 IgG 的影响如表 2 所示，由结果可知模型组小鼠血清 INF-、TNF- 及 IgG 含量与 正常组小鼠相比均明显下降，差异极显著（p0.01） 。各用药组免疫抑制小鼠血 清 INF- 含量与模型组相比含量明显增加，酸性多糖单独给药组与联合用药低 剂量给药组小鼠血清含量增加程度相当，分别为 168.180pg/mL 和 177.250pg/mL，中，高剂量组 INF- 含量均高于正常组小鼠，且强于多糖单独 用药组。 与模型组相比，人参酸性多糖组免疫抑制小鼠血清 TNF- 含量明显上升差 异显著（P0.05） 。人参酸性多糖联合益生菌 C88 低、中、高剂量组小鼠血清 TNF- 含量与模型组相比差异极显著（P0.01） ，高剂量组含量恢复值与正常组 相当，含量可达 268.657pg/mL。 环磷酰胺作为一种细胞毒性的化疗药物，在肿瘤治疗过程中发挥重要的作用。 然而环磷酰胺也可导致机体免疫抑制，危及生命84。 脾脏是重要的免疫器官之一，包含 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞以及巨噬细胞， 是体液免疫及细胞免疫的中心，脾淋巴细胞增殖反应与 T、B 淋巴细胞的免疫 增强作用相关86。胸腺属于机体重要的淋巴器官，具有重要的免疫功能。胸腺 脾脏指数是衡量免疫能力的初步指标，其重量的改变能够初步反应受试样品对 机体免疫的调节作用。 机体的免疫反应主要包含特异性免疫及非特异性免疫，单核-巨噬细胞系统 是机体非特异性免疫系统的主要组成部分，巨噬细胞属于单核-巨噬细胞系统的 重要组成部分，其中最重要的一种非特异性免疫反应是由巨噬细胞所产生，称 之为吞噬功能。吞噬作用是免疫防御系统中最后也是最不可或缺的一个步骤， 巨噬细胞是免疫系统中的调节和效应细胞，机体血液及组织中的巨噬细胞在抗 菌防御机制中扮演着重要的角色，因此增强吞噬功能预期可被用于治疗微生物 感染或癌症疾病中87。碳粒廓清实验是一种最常用于检测巨噬细胞吞噬能力的 检测方法，通过测定血液中碳粒的消失速度反映巨噬细胞系统吞噬异物的能力， 从而评价机体的非特异性免疫功能。Zahra 等88人以西伯利亚鲟为实验对象， 将不同益生菌单独或分别与益生元阿拉伯低聚木糖联合用药，检测它们的免疫 增强作用，结果显示联合用药组作用效果强于单独益生菌用药组，并可明显提 高实验动物吞噬细胞的吞噬能力，具有增强机体非特异性免疫功能的作用。本 研究采用碳粒廓清实验检测人参多糖联合植物乳杆菌 C88 对机体单核-巨噬细胞 吞噬能力的影响，结果显示人参多糖联合植物乳杆菌 C88 可显著提高免疫抑制 小鼠的吞噬指数 ，且作用效果明显高于单独人参酸性多糖组，即人参酸性多 糖联合植物乳杆菌 C88 可提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力，从而增强机 体的非特异性免疫功能。 迟发型超敏反应（DTH）由效应 T 细胞所介导，属于细胞免疫。本研究利 用 DNFB 诱导迟发型超敏反应模型，其原理是机体接触到小分子抗原 DNFB 后 会产生特异性致敏淋巴细胞，当有相应的过敏原接触皮肤后致敏淋巴细胞会释 放出多种因子引发以单个核细胞浸润为主的炎症反应。有研究表明多糖可拮抗 环磷酰胺导致的 DTH 的减弱，使小鼠耳肿胀度恢复正常。本研究结果表明人参 酸性多糖联合植物乳杆菌 C88 可明显增强免疫抑制小鼠迟发型超敏反应，并与 正常组小鼠水平相当。因为 DTH 的发生与效应 T 细胞、巨噬细胞及其产生的 细胞因子或细胞毒性介质有关，所以人参酸性多糖联合植物乳杆菌 C88 可能通 过增强 T 细胞向效应细胞转化及增强巨噬细胞的活性来发挥对环磷酰胺诱导的 免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的促进作用。由此证明人参酸性多糖联合植物乳 杆菌 C88 可增强小鼠的细胞免疫作用。另外，联合用药中、高剂量组作用效果 明显高于多糖单独用药组。 细胞因子在免疫系统细胞间沟通中起到重要的作用，可直接或间接的调节 免疫反应。大量研究证明伴随抗原的识别，根据所产生的细胞因子的不同成熟 T 细胞可被诱导分化为三种不同的子集，Th1 细胞可分泌 IL-2、IL-12、IFN- 、TNF- 等，是细胞介导的免疫反应的主体；Th2 细胞则可分泌 IL-4、IL-5、 IL-6、 IL-10 等，主要介导体液免疫反应89-91；另外， Th1 和 Th2 细胞可分 泌的所有细胞因子，Th0 细胞均可分泌，被认为是 Th1 或 Th2 细胞系分化前的 一个阶段，许多研究报道表明植物多糖或乳杆菌可调节细胞因子的产生量92-94。 正常情况下，Th1 和 Th2 细胞的功能处于动态平衡状态，从而维持正常的细胞 免疫及体液免疫功能。研究结果发现联合用药组作用效果明显高于人参酸性多 糖单独用药组，且小鼠血清 IL-2、IL-4、IFN-、TNF- 含量较环磷酰胺免疫抑 制组小鼠明显升高，并具有剂量依赖性。 表明人参多糖联合植物