皮肤中转运蛋白的作用研究进展

皮肤中转运蛋白的作用研究进展皮肤中转运蛋白的作用研究进展张泉龙，胡晋红，朱全刚（第二军医大学长海医院药学部，上海200433）Progress of Research on the Roles of Transporters in SkinZHANG Quan-long, HU Jin-hong, ZHU Quan-gang(Department of pharmacy, Changhai hospital, Second Military Medical University, Shanghai 20043, China)摘要：摘要：本文综述了目前在皮肤中发现的转运蛋白的种类，及其在透皮给药、皮肤免疫系统、内源性化合物代谢和皮肤病等方面的作用。关键词：关键词：透皮给药；转运蛋白；皮肤屏障Abstract: this paper reviewed the types of transporters found in skin and their roles in cutaneous penetration, skin immune system, endogenous compound metabolism and skin diseases. Key words: cutaneous penetration; transporter; skin barrier 作者简介：张泉龙（1982） ，男，药师，主要从事皮肤药理学，电话: (021)25070674E-mail: zhangquanlong 胡晋红（1949） ，女，主任药师，主要从事皮肤药理学和临床药理学，通讯作者，电话: (021)25070668，E-mail: hujh 正常人体的肠道、肝胆、睾丸、肾脏以及血脑屏障中都存在着各种类型的转运蛋白，并且对药物的吸收、分布、代谢和排泄及药物之间的相互作用有重要影响。近年来，关于转运蛋白在皮肤中的表达、调节及功能研究日渐增多。皮肤是人体最大的器官，也是人体与外界接触的最大屏障，具有保护、感觉、体温调节、分泌、排泄、吸收、代谢和参与免疫反应等功能。皮肤中存在一系列的转运相关蛋白和解毒蛋白酶，参与细胞摄取，转运和抗转运各种内源和外源性化合物的功能。了解转运蛋白在皮肤中的分布特征、生理功能及在外源性化合物经皮吸收和经皮代谢中起的作用，将有助于皮肤病的治疗和药物透皮给药制剂的研制开发。2本文主要介绍目前皮肤中发现的转运蛋白及其在皮肤屏障中所起的作用，对透皮给药和皮肤生理功能的影响。1.皮肤中的转运蛋白皮肤中的转运蛋白随着分子生物学技术的不断发展，利用 RT-PCR、Northern Blot、免疫荧光、组织杂交印迹等技术，人们发现皮肤中存在着一系列的转运蛋白，并且与其他组织相比，存在表达亚型的差异1。根据底物跨膜转运方向，转运蛋白可分为外排性转运蛋白(eflux transporter)和摄取性转运蛋白(uptake transporter)。皮肤中外排性转运蛋白主要包括 ATP 结合盒式(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白家族成员。摄取性转运蛋白主要包括：有机阴离子转运蛋白(organic anion transporting polypeptides，OATPs)、脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport proteins，FATPs)、有机阳离子转运蛋白(organic cation transporters，OCTN)、单羧化物转运蛋白(monocarboxylic acid transporters，MCTs)、阳离子氨基酸转运蛋白（cationic amino acid transporters, CAT）等。一些转运蛋白在皮肤中的表达随供体年龄的不同而存在差异1。皮肤中的转运蛋白参与药物的透皮吸收、转运及分泌过程，皮肤免疫以及内源性化合物的代谢，并且参与一些皮肤病的发生发展。2.转运蛋白与透皮给药转运蛋白与透皮给药透皮给药有许多优越性，透皮给药治疗全身系统性疾病能产生持久地药物治疗浓度，药效持久，并降低药物浓度的波动性，降低不良反应发生率。但角质形成细胞分化形成的角质层是药物透皮吸收的最大屏障。另外，表皮和真皮层中存在着一系列的代谢酶，能将经皮吸收的药物代谢成有活性或无活性的化合物。在皮肤中，一些转运蛋白和细胞代谢酶起到药物生物转化和反向转运及药物生物利用屏障的协同作用2, 3。有机阴离子转运蛋白 B (OATP-B)对 pH 值敏感，且能介导类固醇硫化物的转运，但不能介导葡萄糖结合物的膜转运4。OATP-D 则在一些细胞和组织中介导前列腺素的摄取5。OATP-E 在皮肤组织和一些肿瘤细胞中表达却不在肝脏和血液细胞中表达6，此差异有助于设计转运蛋白介导的抗皮肤肿瘤药物给药系统，可以减少药物在血液细胞的积蓄从而降低不良反应的发生。雌二醇-17-葡萄糖醛酸结合物是 OATP-E 的底物，而牛胆酸能抑制 OATP-E 介导的膜转运。在牛胆酸存在条件下，角质形成细胞对雌二醇-17-葡萄糖醛酸结合物的摄取下降近 50%，对雌酮硫化物的摄取也下降约 33%3。因此 OATP 能介导皮肤角质形成细胞对内3源型化合物的摄取，并且对局部或系统给药的药物都有转运作用。而 OATP 的竞争性结合剂能抑制 OATP 对其特异性底物的摄取。皮肤能表达一系列代谢活性酶和多药耐药相关转运蛋白（MRP1、3、4、5、6） ，但不表达 MRP22。MRPs 具有外排转运谷胱苷肽-S-结合产物的功能7。MRP1 在皮肤中高表达，并且在紫外照射治疗的银屑病患者皮肤中随着谷胱苷肽-S-转运酶(GSTP1)的表达增加而增加8。最近研究显示9，MRP1 参与健康人皮肤对格雷沙星的外排功能。静注给药后，皮肤 Mrp1 基因敲除小鼠（FVB/Mrp1(-/-)）中格雷沙星的皮肤组织/血浆浓度比显著高于正常小鼠（FVB/Mrp1(+/+)） 。共聚焦显微镜成像方法比较显示在皮肤中 Mrp1 参与其非特异性荧光底物(fluo3)的外排。MRP1 的表达调节及单核苷酸多态性很可能影响角质形成细胞中外源性化合物外排和对不同化合物的敏感性10。因此 MRP1 将是提高透皮效率的新靶点。转运蛋白还能影响药物的透皮速率。实验1采用扩散池实验测定理化性质相近的非甾体抗炎药3H氟比洛芬和14C吲哚美辛的经皮渗透速率，在吸收方向3H氟比洛芬的渗透速率显著大于14C吲哚美辛的渗透速率，但在经单独角质层渗透时两者的速率接近，说明除了角质层物理屏障的被动扩散机制外，皮肤中还存在其他机制影响药物的经皮渗透。表皮侧 pH5.0 时3H氟比洛芬和14C吲哚美辛在吸收方向的渗透速率较 pH7.4 时分别增加 50 和 22 倍，分析是低 pH 值时受试药物以非解离形式存在，更易分配于角质层，增加了药物由角质层到皮下组织的浓度梯度。用 HEK001 细胞株测定转运机理，认为3H氟比洛芬的摄取是由高亲和力的、能量依赖的、可饱和的转运载体系统介导，14C吲哚美辛的透皮是由相对低亲和力的转运体介导。而且这种对 pH 敏感的转运作用受其他非甾体抗炎药（NSAIDs）抑制，不受有机阴离子或阳离子的影响，因此推测具有对 pH 敏感和转运有机弱酸离子功能的单羧酸转运蛋白 MCTs 可能参与 NSAIDs 的透皮渗透过程。3.转运蛋白与皮肤免疫转运蛋白与皮肤免疫由 MDR 基因编码的外向转运载体 P-糖蛋白（P-gp）在肾脏，胰腺，肝脏和胃肠道中都有表达。但 Baron JM 等2实验显示人体皮肤角质形成细胞不表达MDR1 和 MDR2。而 Sleeman MA 等11用免疫荧光染色显示新生小鼠表皮外毛根鞘角质形成细胞表达 P-gp。但 MDR-1 存在于人体表皮树突状细胞和 T 细胞中，4并且在皮肤免疫功能中扮演着一定角色12。MDR-1 能保护表皮树突状细胞（DC）和相关 T 细胞迁移至淋巴管从而完成免疫应答反应。而拮抗 MDR-1 后表皮树突状细胞只停留在表皮层。我们可以利用 MDR-1 拮抗剂对 DC 迁移抑制机制，增强治疗基因透皮给药的持久性和表达水平。目前研究显示，MRPs 不仅具有外排转运有机阴离子和谷胱甘肽-S-结合物的功能，而且还能转运内源性化合物如白三烯和前列腺素，从而参与皮肤炎症反应的调节13, 14。MRPs 基因敲除小鼠存在炎症反应缺陷表现15。在正常人皮肤中，MRP 表达低，但在扁平苔藓和银屑病人皮肤中 MRPs 的转录和蛋白表达增强8，并且细胞因子 IL-6 和抑瘤素 M(oncostatin M，OSM)能上调正常人皮肤角质形成细胞和真皮成纤维细胞中 MRPs 的表达16。磷脂酰肌醇-3 激酶通路参与 OSM 上调 MRP4 的表达。并且在 IL-6 和 sIL-6R 存在下，角质形成细胞对全反式维甲酸的外排增加。表皮角质形成细胞分泌 IL-1 促进成纤维细胞表达 IL-6，IL-6 则能增强角质形成细胞膜上 MRPs 表达，进而促进炎症因子白三烯和前列腺素的分泌，从而调节皮肤免疫反应。4.转运蛋白与脂类代谢转运蛋白与脂类代谢表皮脂质是构成皮肤角质层的重要物质，对维持皮肤屏障功能起到重要的作用。表皮脂质主要包括神经酰胺，胆固醇和脂肪酸三大类，在基底层细胞向角质层分化过程中，这些脂质含量逐渐增高，到达角质层时被排出至细胞间隙，形成防止水分丢失的屏障。胆固醇是表皮形成板层小体的重要成分，也是角质形成细胞分化、增殖的重要调节分子。目前发现17 ATP 结合盒转运子 A1(ABCA1)能促进胆固醇外排，参与高密度脂蛋白的合成，调节细胞内胆固醇的稳定。人皮肤角质形成细胞和鼠表皮都存在 ABCA1 的表达。角质形成细胞膜上的 ABCA1 在维持胞内胆固醇的稳态和保护皮肤渗透屏障功能中起到非常重要的作用。急性渗透屏障破坏，ABCA1 表达会降低，从而降低细胞内胆固醇外排，使更多的胆固醇用于修复。激活细胞核激素受体（LXR），过氧化物酶体增生物激活受体（PPAR）以及增加细胞内胆固醇水平都能增加 ABCA1 表达17。最近研究显示18，一些膜蛋白如清道夫受体脂肪酸转运酶（CD36）, 线粒体天(门)冬氨酸转氨酶（FABPpm）以及脂肪酸转运蛋白（FATPs/SLC27）能够增加细胞对长链脂肪酸的摄取。FATPs 是一种跨膜蛋白，具有 6 个亚型。在人体的各种需要利用脂肪酸的组织中均有不同类型的 FATPs 表达并参与脂肪酸的摄取。人5体和大鼠皮肤中均表达 FATP1、3、4、6。在成人皮肤中19，FATP-1 和 FATP-3表达于角质形成细胞，FATP4 在皮脂腺中高表达，FATP6 则定位于毛囊。FATPs 在维持表皮磷脂组成的稳态和磷脂代谢中起到重要作用。它能介导角质形成细胞摄取长链脂肪酸，从而为角质形成细胞合成磷脂提供原料。CD36、长链脂肪酸酰基辅酶 A 合成酶（LACS）能协同 FATPs 参与长链脂肪酸的细胞摄取20。FATP4 外显子 3 缺失小鼠皮肤出现过度角化，表皮屏障功能破坏等表型，并且胚胎致死率高21, 22。营养素，激素及细胞因子均能调节 FATPs 的表达，且在发育过程中 FATPs 在皮肤中定位会发生动态变化19。大鼠表皮角质层持续破坏后，表皮 FATP6，真皮 FATP1 及 CD36 表达增加，参与修复渗透屏障。进一步了解 FATP 在皮肤病理状态下的改变有助于发现 FATP 是否可以作为皮肤病诊断和治疗的新靶点。5.转运蛋白与皮肤病转运蛋白与皮肤病人们利用基因缺失小鼠来研究转运蛋白的功能，而一些先天皮肤病正是由转运蛋白的基因突变引起的。目前研究发现弹性假黄瘤与 MRP6 基因突变有关23, 24。至少有 80%的病人发现 MRP6 基因突变。细胞实验显示25，MRP6 缺乏影响皮肤成纤维细胞新陈代谢和弹性假黄瘤结缔组织细胞的代谢改变。ABCA1 基因突变与丹吉尔病（Tangier 病）有关。ABCA1 缺失小鼠体内组织中出现胆固醇酯蓄积，临床表现出黄扁桃体和高密度脂蛋白水平降低26。尽管我们对银屑病的发病机理尚未完全了解，但通过 Real-Time PCR 和基因芯片等方法检测到一些代谢酶和转运蛋白如 MRP1 的表达上调8。最近研究发现27，阳离子氨基酸转运蛋白 CAT-1 参与银屑病表皮增生的病理调节。在银屑病皮肤中精氨酸酶过表达导致 CAT-1 表达上调，从而降低细胞内精氨酸水平，抑制NO 合成。与健康皮肤相比，CAT-1 的 mRNA 表达在银屑病皮肤中升高，CAT-2A 和 CAT-2B 则没有改变。体外实验显示 HaCaT 细胞中精氨酸酶过表达或 L-精氨酸减少均能使 CAT-1mRNA 表达增加，并且 NO 合成也降低。L-精氨酸是诱导一氧化氮合酶（iNOS）合成和精氨酸酶活性所必须的。此两种酶对维持皮肤内环境稳定非常重要。CATs 能调节细胞外 L-精氨酸摄取并且精氨酸酶的活性依赖于 CATs 的表达和活性。竞争性抑制 CAT 能降低 iNOS 的合成及精氨酸酶的活性，从而明显减少角质形成细胞增生。66.展望展望皮肤中存在的各种转运蛋白参与了皮肤内源和外源性化合物的代谢调节，从而维持皮肤的内在稳定性。细胞因子以及内源性化合物等会影响皮肤中转运蛋白的表达。转运蛋白的异常更是涉及一些皮肤病发生。因此，皮肤中的转运蛋白与皮肤疾病的发生发展、药物经皮吸收过程中的转运和代谢、皮肤内环境的稳定等病理生理过程存在着密不可分的关系。目前我们需要从皮肤整体角度出发，结合实时灵敏的检测方法来考察转运蛋白在药物透皮吸收，代谢中所起的作用，从而为透皮给药提供新靶点。深入了解转运蛋白在皮肤中的表达调控机理，有助于了解其在皮肤生理病理状态下所起的角色，为设计一些皮肤病治疗药物提供新思路。Rererences1Li Q, Tsuji H, Kato Y, et al. 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