真核生物dna的复制

第八节第八节 真核生物的真核生物的 DNADNA 复制复制 在上一节中,已经从解决线形 DNA 复制终止问题的角度讲解了一种真核生物病毒一一腺病毒 的 DNA 复制。本节将要讲解真核生物的复制原点,复制元和复制元族;真核生物的 DNA 聚合酶和 引发酶;作为真核生物 DNA 复制模型的 SV40 的复制原点和大 T 抗原以及复制过程;真核生物染色 体末端的 DNA 的复制 F 真核生物复制过程中的核小体结构。 一、真核生物的复制原点一、真核生物的复制原点, ,复制元和复制元族复制元和复制元族 在 E.coli 中,DNA 复制速度大约是 105bp/分, 而真核细胞的 DNA 聚合酶活性要低得多,复制速度 大约为 500bp/分500Obp/分。这样,如果按典型 的哺乳动物染色体 DNA(比 E.coliDNA 大 50 倍)来 计算,则真核 DNA 的复制时间就会是 E.Coli 的 1000 倍即约一个月的时间。事实上,真核生物 DNA 复制时间一般为几个小时。这是通过从许多复制许多复制 原点同时开始并双向复制原点同时开始并双向复制而实现的。用放射自显 影方法在哺乳动物染色体上看到许多复制泡,每个 复制泡都有固定的起点(复制原点),然后双向伸展, 与相邻的复制泡会合。这样一段段的 DNA 就称为复制单元复制单元, ,简称复制元简称复制元（replion)。复制元的大 小是不均一的,从 1.3 万 bp90 万 bp 不等。不同生物的复制元大小当然不会相同；就是同一种 生物在不同的生长条件下,复制元的大小也不同。生长快的时候,复制元就小。例如果蝇大约有 5000 个复制原点,每个复制元平均大小约 3 万 bpz 而在卵受精后,复制起点增加到大约 5 万个, 仅需 3 分钟就可以将整个基因组复制完毕。其调节机制目前毫无所知。几个邻近的复制元可组 成复制元族,每个复制元族少至两个复制元,多至 250 个复制元。不同的复制元族在复制起始的 时间上有先有后,而同一复制元族内各复制元基本上是同步的。真核生物的复制原点的 DNA 序列 并无固定的模式,但大多包含一个富含 AT 的序列,可能还有一个特异性蛋白质的结合位点。 二、真核生物的二、真核生物的 DNADNA 聚合酶和引发酶聚合酶和引发酶 与真核细胞中多起点复制相应的特点是细胞中 DNA 的聚合酶分子数目多。在 E.Coli 中,只有 pol 10 个 20 个分子,而一个典型的动物细胞含有 DNA 聚合酶 2000 个60000 个分子。DNA 聚合酶 可能是真核生 物的主要的 DNA 聚合酶,此外还有 DNA 聚合酶 和 。 现将四种四种 DNADNA 聚合酶聚合酶的性质总结于下表。大多数真核生 物 DNA 聚合酶都只有聚合活性,而不像细菌 DNA 聚合酶那 样除了聚合活性外还有外切酶活性。而新近发现的 DNA 聚合酶 不但有聚合酶活性,而且还有 35外切酶活 性。DNA 聚合酶 与 DNA 引发酶结合得相当紧密,甚至 在用 DNA 聚合酶 的抗体进行亲和层析时,这个紧密的复合物也一同被吸附;但 DNA 引发酶可以 被 50%乙二醇(ethylene glycol)所洗脱。因此前几年人们认为 DNA 聚合酶 兼具引发酶的活 性是不恰当的。实验表明,DNA 聚合酶 和 DNA 引发酶的复合物是复制体系所必需的。DNA 聚合 酶 和 在体外都可以被一种霉菌的抗菌素 aphidicolin 所抑制,在体内该抗菌素则抑制细胞 DNA 的复制。实验表明,在细胞 DNA 合成期(S 期),DNA 聚合酶 的含量急剧增加。而对于 DNA 聚合酶 ,控制细胞周期的蛋白质 cyclin 则是它不可缺少的辅助成分(亚基?)。据此,人们推测, 真核生物的 DNA 复制是由 DNA 聚合酶 和 协同进行的。DNA 聚合酶。在细胞周期中含量变 化不大,可能与损伤 DNA 的修复有关。DNA 聚合酶 的功能主要是负责线粒体 DNA 的复制，而 它在核内的功能还不清楚。 四种四种 DNADNA 聚合酶的性质聚合酶的性质 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 位置核内核内线粒体及核内核内 活性比例 80%10%-15%2%-15% 未计算 分子量 KDa 110-1204560 ？ aphidicolin 抑制反应 +-+ BUPdGTP 抑制反应 +- DNA 引发酶活性 +- 35外切核酸酶活性 -+ 亚基数多亚基单亚基单亚基多亚基 前面,我们介绍了真核生物的 DNA 聚合酶。现在,我们还必须 了解真核生物真核生物 DNADNA 引发酶引发酶的性质。引发酶分子量大约 5OKDa- 6OKD。首先,正如上面所说,引发酶能够与引发酶能够与 DNADNA 聚合酶聚合酶 形成紧密形成紧密 的复合物的复合物。这种复合物不但是复制所必需的,而且与结合于复制原 点的特异性蛋白质构成了复制体.系的种族特异性。例如,来自人 类 HeLa 细胞的复制体系,如果用 DNA 聚合酶 抗体去除体系中的 DNA 聚合酶 和引发酶的复合物,则复制体系的其余组分不能支 持 SV40 复制原点在体外的复制(在大 T 抗原存在时)。如果加人人 类 HeLa 细胞中的这种复合物或猴子 COS 细胞中的复合物,均能恢 复复制能力。而加入小鼠或牛的复合物以及 E.coli DNA 聚合酶 I 或聚合酶全酶均不能奏效。这可能是该复合物与大 T 抗原之间的蛋白质-蛋白质的特异性作用 有关。其次,真核生物的真核生物的 DNADNA 引发酶的引物合成方式较为特别引发酶的引物合成方式较为特别。它的作用是阵发式的,每次作用 能拷贝 6 个-15 个核苷酸。当 DNA 聚合酶 缺少时,首次阵发性合成产物可以被下几次阵发性 合成所延长成为很长的多聚核苷酸。但是在有活性的 DNA 聚合酶 和足够的 dNTP 存在时,引物 仅是第一次阵发性合成产物。最后,DNADNA 引发酶不但能利用引发酶不但能利用 rNTPrNTP 为合成前体为合成前体, ,而且还利用而且还利用 dNTPdNTP 为合成前体为合成前体。在一次阵发性合成的引物中,第一个核苷酸总是 rA；而以后的核苷酸要么都是核 糖核苷酸,要么都是脱氧核糖核苷酸,而不能是二者都有。由于引发酶能够合成少量的脱氧核糖 核苷酸,因此精确确定 DNA 聚合酶 何时接替引发酶是很困难的。然而,引物一般只有 6 个-15 个核苷酸,对于 SV40 体外 DNA 复制情况的分析,发现它的引物仍然主要为 6 个-9 个核苷酸的 RNA。 三、真核生物染色体未端三、真核生物染色体未端 DNADNA 的复制的复制 真核生物同样面临着线形 DNA 复制结束时所产生的 5末端 隐缩的问题。这一问题的解决有赖于端粒的结构和能够识别或结 合端粒的蛋白质和酶。关于端粒蛋白质的研究正在进展之中,已发 现的几种端粒蛋白质（见前述）。Blackburn 等人首先发现四膜 虫端粒中存在一种端粒酶端粒酶(telomerase),这种酶能够将四膜虫端粒 结构中单链尾巴 5TTGGGG3延长,延长的部分仍然是 5TTGGGG3 了。事实上,各种端粒中这一富含 G 的序列总是突出 12 个16 个核昔酸。后来又发现原生动 物游仆虫euplotes和尖毛虫的端粒酶也能延长其富含 G 序列 5TTTTGGGG3。这种酶是一 种核糖核蛋白,由 RNA 和蛋白质构成。1990 年,Blackburn 等人又证明了端粒酶中的 RNA 是富含 G 序列的模板。例如游仆虫的端粒酶 RNA 含有 5CAAAACCCCAAAACC3这样的序列,对于拷贝出富 含 G 序列所必需的部分为 5CAAAACCCCAAAA3了。这样,端粒酶实际上是一种逆转录酶端粒酶实际上是一种逆转录酶,与还原与还原 病毒逆转录酶的差异只在于这个模板是在酶分子内病毒逆转录酶的差异只在于这个模板是在酶分子内。端粒酶中的 RNA 可能还有别的作用。这一 富含 G 的单链尾巴的长度是如何控制的以及这一单链尾巴在复制中的功能都还不清楚。这种单 链尾巴可能弯转过来作为引物复制 5末端。另一种可能性是某种端粒结合蛋白有可能像腺病 毒 pTP 那样结合于最末端的单链重复序列,并作为蛋白质引物复制 DNA 的 5末端（右图）。 四、真核生物复制过程中的核小体结构四、真核生物复制过程中的核小体结构 真核生物细胞核的体积是很小的,而复制过程完全局限于核内进行,因此 DNA 必然是处于高 度压缩状态下进行复制的。而复制时必然涉及到核小体的转移与分配,因为 DNA 是半保留复制。 由于空间狭小,复制可能是分区进行的,这就是各复制元族不同步的原因。现在人们已经用溴尿 嘧啶脱氧核苷酸代替胸腺嘧啶核苷酸渗入到 DNA,再用溴尿嘧啶脱氧核苷酸的抗体进行免疫杂 交而证实了染色体的分区复制。 组蛋白八聚体是以全保守的方式传给子代分子的组蛋白八聚体是以全保守的方式传给子代分子的,这一结论的 实验过程是：组蛋白的合成是在细胞核中与 DNA 复制同步进行 的,因而细胞并不含有明显多余的组蛋白分子。其精联的机制 目前还不清楚。这个事实对于我们证明组蛋白八聚体的解离与 否却有很大的帮助。老的八聚体是否解离以及如果解离又如何 与新合成的组蛋白重组? 将细胞置于轻培养基(12C,14N,lH)中生长很长时间。然后将 细胞转移到重培养基(14C, 15N,3H)中生长约 1 小时,分离组蛋白八聚体,在甲酸饱和的密度梯度 中进行平衡离心。如果是全保留装配的话,则得到一个高密度的放射性带 p 如果是随机的话,则 得到一个高密度到低密度的弥散的放射性带;如果是半保留的话,则在中等密度处得一个单一的 放射性带;结果表明,组蛋白八聚体的装配是全保守的。这些老的八聚体和新的八聚体在两条子 代 DNA 分子上是如何排列的呢? 用上述密度梯度平衡离心的办法分析交联的相邻八聚体(16 单体聚合物)同样可以证明半 保留分布是正确的。 用蛋白质合成的抑制剂放线菌酮(cycloheximide可以得到同样的结论。将这种抑制剂加 到正在生长的细胞中,在此之前开始的一轮 DNA 复制将继续下去。组蛋白是现用现造,在加人蛋 白质合成的抑制剂后,就没有新生的组蛋白八聚体了。这样在两个复制叉的两边,有