神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对pc12细胞nf-kappab活性的影响

神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对 PC12PC12 细胞细胞 NF-kappa B 活性的影响活性的影响 （华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室， 武汉 430030） 金小高 罗爱林 王金韬 张广雄 王贤裕 李亚文 摘要摘要 目的：目的：研究神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶亚型的 表达变化，检测相应亚型对 NF-kappa B 转录活性，探讨神经型一氧化氮合酶各 亚型的表达变化在致痛机制中的意义。方法：方法：雌性 SD 大鼠 20 只，体重 150200g，随机分为 2 组（n=10） ，对照组和 SNI 组。 SNI 组于左肢制备坐骨 神经保留性神经损伤模型（SNI） ，对照组实施假手术。手术前后测定大鼠对机 械刺激产生缩腿反应的次数。术后 11d 痛觉测定后，每组取 3 只大鼠用于灌注， 应用免疫组织化学方法检测脊髓 nNOS 的表达。7 只大鼠断头处死后分离 L4-6脊 髓，提取其中 3 只大鼠脊髓的蛋白质，应用抗 nNOS 羧基端抗体和 Western Blot 方法检测 nNOS 的表达，提取其中 4 只大鼠脊髓的 RNA，1 只大鼠脊髓 RNA 进行 RACE-PCR 和 Southern Blot 实验检测 nNOS 不同的 mRNA；余下 3 只大鼠脊 髓的 RNA 用于检测 nNOS 的 mRNA 变化。将携带 nNOS 或 nNOS 基因的 pcDNA3.0 表达质粒通过脂质体转染 PC12 细胞后，提取经筛选 PC12 细胞的核蛋白，采用 EMSA 凝胶电泳阻滞实验检测细胞核 NF-kappa B 转录活性。结果：结果：SNI 组术后 3d 机械刺激术侧后爪引起缩腿反应的次数高于对照组（P0.05） 。 RACE-PCR 和 Southern Blot 实验证实有三种 nNOS（nNOS、 和 ）的 mRNA 表 达。PCR 结果显示存在 nNOS、nNOS 的 mRNA。PC12 细胞转染 nNOS 后增加 NF-kappa B 转录活性（P0.05） ，对照组手术前后各时点比较 差异无统计学意义（P0.05） ，见图 1，2。 与对照组比较，*P0.05） 。 图 4 对照组和 SNI 组脊髓表达 nNOS 的 Western Blot 结果 2.42.4 RACE-PCRRACE-PCR 和和 SouthernSouthern BlotBlot 结果结果 针对 nNOS 氨基端的 RACE-PCR 结果电泳 条带不清楚；电泳条带的 Southern Blot 结果显示对照组和 SNI 组脊髓中均有 三种不同分子量的 DNA 条带，分别大约为 300、750 和 1250bp(图 5)。 图 5 对照组和 SNI 组脊髓中 nNOS 的 RACE-PCR 和 Southern Blot 结果 （A 为 RACE-PCR，B 为 Southern Blot 结果） 2.52.5 PCRPCR 结果结果 对照组和 SNI 组脊髓中 -actin 的 PCR 结果显示 -actin 片 段位于大约 600bp 处；针对 nNOS-a 的 PCR 结果显示于 450bp 和 1500bp 处各有 一种片段，分别定为 nNOS-a 和其剪结体 nNOS；关于 nNOS-b 的 PCR 结果显 示 nNOS 片段大约位于 150bp 处（图 6） 。 图 6 对照组和 SNI 组脊髓中针对-actin、nNOS-a 和 nNOS-b PCR 产物电泳结果 （A 为-actin，B 为 nNOS-a，C 为 nNOS-b） 2.6 Western Blot 结果结果 未转染、转染 nNOS 和 nNOS 基因的 PC12 细胞有三 种不同分子量的 nNOS 表达，分子量分别为 155000、135000 和 120000；PC12 细胞未转染、转染 nNOS 和 nNOS 基因后分子量为 155000 的 nNOS 相对表 达量（nNOS 与 -actin 表达灰度的比值）分别为 0.580.06、1.500.23 和 0.910.08, 细胞转染 nNOS 后分子量为 155000 的 nNOS 相对表达量高于未转 染和转染 nNOS 基因（P0.05） 。见图 7。 图 7 PC12 细胞未转染、转染 nNOS 或 nNOS 基因后 nNOS 表达的 Western Blot 结果 （1、2 和 3 分别为未转染、转染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12 细胞） 2.7 凝胶电泳阻滞实验（凝胶电泳阻滞实验（EMSA）结果）结果 EMSA 获得放射性自显影影像的灰度表 示细胞核内 NF-kappa B 的量，间接显示 NF-kappa B 的转录活性，具体见图 8。 未转染、转染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12 核内 NF-kappa B 的 EMSA 灰度 分别为 18.301.4、26.45.0 和 8.90.7（104INT） ，转染 nNOS 基因的 PC12 细 胞 NF-kappa B 的转录活性高于未转染基因的 PC12 细胞（P0.05） ，而转染 nNOS 基因的 PC12 细胞 NF-kappa B 的转录活性低于未转染基因的 PC12 细胞 （P0.05） 。 图 8 PC12 细胞未转染、转染 nNOS、nNOS 基因后检测细胞核 NF-kappa B 的 EMSA 结果 （1、2 和 3 分别为未转染、转染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12 细胞） 3 3 讨论讨论 神经损伤所导致的痛觉异常或痛觉过敏称为神经病理性疼痛，神经病理性 疼痛的机制尚不清楚。研究神经病理性疼痛的机制有多种模型供选择，本研究 之所以选择坐骨神经保留性神经损伤模型（SNI） ，是因为该模型相对于 CCI 或 SNL 模型操作简单、产生疼痛需要的时间短、疼痛程度的个体差异性小。 本研究 SNI 模型大鼠术后 3d 就可以在术侧后爪产生明显的痛觉异常和痛觉 过敏，术后 5d 痛觉的改变趋于稳定；在 11d 取材，大鼠痛觉稳定，脊髓中基因 转录、蛋白表达产生明显而稳定的变化，便于比较它们的变化。 制作 SNI 模型是在暴露大鼠左后肢坐骨神经主干及其分支（胫神经、腓肠 神经、腓总神经）后，结扎并切断胫神经、腓总神经，保留腓肠神经；坐骨神 经在脊髓对应的节段为 L46，所以本研究取材选择 L46段脊髓，能够反应外周 神经损伤导致痛觉过敏后脊髓中 nNOS 表达变化。 衡量机械刺激诱导大鼠疼痛反应程度最常用的方法是测定 50缩爪阈值， 但测定 50缩爪阈值的过程复杂、计算繁琐，不能直观地反应疼痛的变化。本 研究采用 12g 和 2g 力度的接触刺激分别代表痛觉过敏和痛觉异常，每个力度共 刺激大鼠术侧后爪足底外侧 30 次，计算总的缩腿反应次数，该方法操作简单， 不需要计算，容易理解。 免疫组织化学结果显示 nNOS 主要分布于脊髓背角，神经病理性疼痛时脊髓 背角的 nNOS 升高，在神经元中 nNOS 位于细胞膜和细胞浆。免疫组织化学可以 清楚地显示 nNOS 表达的位置变化，但反应 nNOS 表达的数量变化不如 Western Blot。Western Blot 结果发现有三种不同分子量的 nNOS 的表达，其分子量分 别为 155、130 和 125KD 左右。其中最有意义的就是 155 和 130KD 的 nNOS，它 们在神经病理性疼痛中不仅发生了显著变化，而且它们的变化方向恰恰相反。 这三种分子量的 nNOS 与文献报道的 nNOS、 和 的分子量大致相同，单单 从 Western Blot 不能推断它们是否一一对应。 为了进一步验证是由不同 mRNA 翻译而来还是由同一种蛋白降解而来，本研 究在 Western Blot 实验之后进行了关于 nNOS 的 5RACE-PCR 实验。5RACE- PCR 结果发现 SNI 组和对照组大鼠均有数种不同的 mRNA 表达，但条带不甚清楚。 为了准确显示 mRNA 表达的不同，本研究在 5RACE-PCR 结果的基础上，应用 P32标记的 nNOS 特异性 DNA 序列与 5RACE-PCR 电泳产物杂交，放射性自显 影成像后清晰显示有三种不同的条带，分别处于 300、750 和 1250bp 的位置上。 这三种不同的 mRNA 能否均翻译成三种不同的蛋白质，并与 Western Blot 结果 中的三种不同分子量的 nNOS 相对应，至此尚不能确定。因为文献报道 nNOS 有 多种不同的 mRNA，能够翻译为的 nNOS 有三种 mRNA，分别为 nNOS-a、nNOS- b 和 nNOS-c，它们的第一个外显子 exon1 不同，分别为 exon1a、exon1b 和 exon1c，但这三种 mRNA 只翻译为一种蛋白质 nNOS,但可能对翻译的效率有影 响4。本研究显示 RACE-PCR 的三条带可能分别为 nNOS-a、nNOS-b 和 nNOS 三种 mRNA。 为了确定脊髓的中有无 nNOSa、nNOSb 和 nNOS 三种 mRNA，本研究根据 nNOS-a、nNOS-b 和 nNOS 设计了相应引物进行 PCR 实验，见图 7。结合 Western Blot 结果，本研究可以推断脊髓中至少有三种不同 mRNA 的 nNOS 转录， 按核苷酸数目大小依次为 nNOSa、nNOSb 和 nNOS，nNOSa、nNOSb 翻译后对应 Western Blot 条带 155KD 的 nNOS，nNOS 翻译后对应 Western Blot 结果 135KD 的 nNOS。而 Western Blot 结果 125KD 在本研究中没有发现相对应的 mRNA，这有两种可能，其一：5RACE-PCR 实验中设计的 nNOS 引物过于靠近 5 mRNA 端，没有扩增到较短的 nNOS；其二：125KD 的 nNOS 或 nNOS 由 nNOS 或 nNOS 降解得到。所幸的是，125KD 的 nNOS 在神经病理性疼痛时变化 不大，而最有意义是 nNOS 和 nNOS 在转录和翻译水平均发生了相反的变化。 nNOS 是 nNOS-b 转录后通过剪切拼结而来。相对于 nNOS，nNOS 缺少 exon2, exon2 编码 nNOS 氨基端的 PDZ 结构域2，nNOS、细胞骨架蛋白 PSD95、NMDA 受体的 PDZ 结构域通过相互作用在结构上联合在一起9，nNOS 与 NMDA 受体进而在功能上具有相互调节作用2-7。通过 PSD95，NMDA 受体可以促 进 nNOS 合成 NO 的功能，nNOS 反过来可以调节 NMDA 受体活性；而 nNOS 由于缺失 PDZ 结构域对 NMDA 受体依存性和调节功能减低。研究显示，NMDA 受 体与 nNOS 在脊髓中可以相互促进神经病理性疼痛的产生；本研究也显示与 NMDA 受体联系紧密的 nNOS 表达升高；所以，nNOS 可能在神经病理性疼 痛大鼠脊髓起到促进疼痛的作用。而 nNOS 没有 PDZ 结构域，不能在细胞膜上 与 NMDA 受体相联系，处于细胞浆的 nNOS 表达减少，这种变化是促进还是抑制 疼痛的产生尚不得而知。 本研究为了探讨脊髓 nNOS 和 nNOS 在表达变化相反、分子结构不同上对 神经病理性疼痛的影响，选择从功能上研究它们的差异性，NF-kappa B 成为最 合适的研究对象。为证明 nNOS 对 PC12 细胞 NF-kappa B 转录活性的影响，本 研究提取了细胞核内的蛋白用于 NF-kappa B 的 EMSA 检测，因为只有细胞核 内的 NF-kappa B 才能够与 DNA 特异系列结合，发挥转录活性。EMSA 测定 NF-kappa B 转录活性的原理是利用 NF-kappa B 与 DNA 特异系列结合后，分子 量增加，在凝胶上电泳速度减慢，通过P32标记的 DNA 特异系列得到放射性自 显影。本研究结果显示 nNOS 促进 NF-kappa B 转录活性，而 nNOS 降低 NF- kappa B 转录活性。 nNOS 可能利用通过 NMDA 受体内流的钙离子迅速激活，弥散致突触前 促进谷氨酸释放，进一步激活 nNOS，大量内流的钙离子进而得以激活 NF- kappa B 向核内转移，增加其转录活性。而位于细胞浆12中的 nNOS 则可以与 NF-kappa B 接近，合成的 NO 得以作用于 NF-kappa B。有研究表明 NO 可以亚 硝基化 NF-kappa B 的巯基，改变其构像，降低 NF-kappa B 的转录活性。本研 究 nNOS 降低 NF-kappa B 转录活性可能与此有关。 神经病理性疼痛脊髓中 NF-kappa B 转录活性加强，增加 nNOS 和 COX-2 的表达，提高了痛觉传递神经元的兴奋性，促进疼痛产生。本研究显示，神经 病理性疼痛大鼠脊髓中 nNOS 表达升高，nNOS 表达减少； nNOS 促进 NF- kappa B 转录活性，而 nNOS 由于结构缺失而降低 NF-kappa B 转录活性；所以， 初步推测神经病理性疼痛大鼠脊髓中 nNOS 亚型 nNOS 和 nNOS 的表达变化可 能促进了疼痛的产生。 综上所述，神经病理性疼痛时大鼠脊髓 nNOS 表达升高，nNOS 表达减少； nNOS 是全长的 nNOS，位于细胞膜，而 nNOS 由于缺乏 PDZ 结构域不能和 NMDA 受体衔接，处于细胞浆；由于结构不同，nNOS 促进 NF-kappa B 转录 活性，而 nNOS 降低其活性；介于 NF-kappa B 在神经病理性疼痛中发挥的重 要作用，因此，可以推断 nNOS 表达升高、而 nNOS 降低是神经病理性疼痛 的机制之一。nNOS 与 nNOS 都属于 nNOS，但由于结构差异导致功能截然相 反，研究针对它们的药物来治疗神经病理性疼痛是一个值得探讨的方向。 参考文献参考文献 1.Kawamata T, Omote K. 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