细胞衰老检查的实验技术及原理(一)

细胞衰老检查的实验技术及原理（一）细胞衰老检查的实验技术及原理（一） 关键词：细胞 色素 成纤维细胞 酶 磷酸 试剂 标准物质 北京标准物质网 衰老细胞的形态变化主要表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、 染色质固缩、胞内溶酶体变多等。衰老细胞中细胞器数量尤其是线粒体数量减 少，胞质内有色素堆积和空泡形成，最终导致细胞死亡。总体来说衰老细胞的 各种结构呈退行性变化。根据其特征，目前常用于检测衰老的方法如下： 一、-半乳糖苷酶活性 1995 年，Dimiri 等发现体外培养二倍体成纤维细胞在培养基 pH 值为 6 时， 其 -半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而逐渐上调，他们把这种中性 -半 乳糖苷酶定义为 SA-gal，即衰老相关的 -半乳糖苷酶。衰老细胞或组织产 生的 -半乳糖苷酶可以催化底物 XGal，生成深蓝色产物，从而在光学显微 镜下很容易观察到(图 5-5-1)。在人体表皮角质层细胞中，也可以发现 SA- gal 随年龄的增加而增加。并且，SA-gal 不依赖于 DNA 复制，可以区分衰老 细胞与静止期的细胞。 SA-gal 是一种体内体外都适用的检测衰老的生物标记物。由于检测 SA- -gal 的方法简单易行，其在检测衰老细胞方面有很广泛的应用，目前已经有 2400 多篇论文应用了这种方法。 二、端粒长度的检查 端粒是位于真核细胞染色体末端顶部的核蛋白结构，由高度保守的 TTAGGG 重复序列组成，其存在可以保护染色体末端，是维持染色体稳定的重要因素。 鉴于端粒的特殊结构，端粒的长度会随着每次细胞的分裂而缩短，因此，端粒 长度是衰老的一个重要生物标志。这里我们主要讨论端粒限制性片段(TRF)分析 及荧光原位杂交(FISH)法。 端粒限制性片段分析：TRF 分析也称作端粒的 Southern 印迹法，是应用针 对端粒重复序列的探针来检测限制性酶切后所保留的端粒的方法。限制性酶会 将基因组 DNA 消化为短的片段，留下大量完好的端粒，即所谓的端粒限制性片 段。以凝胶电泳分离基因组片段，通过放射性探针(CCCTAA)。杂交“TTAGGG” 重复序列的方式可以检测到端粒的存在。鉴于细胞的异质性，TRFs 的大小不一， 反映出细胞中端粒长度的不同。TRF 分析对试剂和仪器无特殊要求，因此这种 方法目前有着较为广泛的应用，但它存在一些缺陷，TRF 分析测量的是整个样 品端粒长度的平均值，由于不同端粒的长度相差很大，这种方法既不能分辨单 个端粒也不能分辨单个细胞内端粒的平均长度。鉴于短端粒在电泳迁移中不集 中且杂交信号弱，这种方法很难检测到在衰老研究中尤为重要的短端粒。另外， 这种方法还存在操作复杂，所需样品量大等缺陷。相比之下，FISH 技术样品用 量小、直观、敏感，可以检测染色体问端粒长度的变化。 荧光原位杂交：FISH 端粒长度分析基于荧光肽核酸探针(PNA)的特异性标 记。PNA 探针是 DNA 同源的合成肽链，其中 DNA 带负电的磷酸戊糖骨架被不带 电的 N-2 胺乙基甘氨酸骨架所取代。这样的修饰产牛了非常稳定高效的针对靶 DNA 的特异性杂交。PNA 探针发出的荧光信号与所杂交的端粒长度直接相关，因 此这