硕士学位论文-Maillard反应型可可香料制备研究.pdf

i 摘摘 要要 美拉德反应(maillard reactin) 是食品热加工过程中各种风味的重要来源，化学反应机理相对复 杂。 本文主要研究利用 maillard 反应制备可可香料的方法和应用，探讨了可能存在的机理。本论文 主要内容和实验结果如下： 1、论文中采用了 plackett-burman 试验设计，筛选对可可风味有主要贡献的氨基酸和还原糖。 最终确定反应原料为 2g 亮氨酸、1.5g 苯丙氨酸、1g 精氨酸、1g 甘氨酸、1g 谷氨酸、0.5g 丝氨酸和 两种还原糖（即 3g 葡萄糖、9g 果糖） 。 2、通过均匀试验设计确定最佳反应条件：温度 124，时间 20min，水分含量为 7.39%。统计 分析结果表明，水分含量对反应体系的影响最大。 3、在原有反应型可可香料的基础上，对其进行调香修饰制备出可可香精，应用于饼干、硬糖和 冰淇淋。感官评价结果表明，与市售复配可可香精相比，具有良好的热稳定性。在烟草中的应用试 验发现，反应 16min 的可可香料加香效果最为显著，随后进行的在烟草中的裂解 gc-ms 分析证明 了这一点。 4、通过对反应型可可香料的 maillard 反应体系的研究，确定反应型可可香料在水分含量为 1020%时更易形成致香成分。此外，果糖有利于产生更多的吡嗪类物质（如烷基吡嗪） ，而葡萄糖 则有助于醛类物质的形成。同时，确定反应前 5 分钟为 maillard 反应的最初阶段，此时氨基酸和还 原糖大量降低。本文还确定了两种可可醛的生成机理。 5、探讨了微波法制备反应型可可香料，在与油浴法相同的原料情况下，其最佳的反应条件为反 应时间为 6.8min，水量:二醇量 ml 为 32.5:17.5。比较油浴法和微波法制备反应型可可香料中的致香 成分和含量，表明微波法能够取代油浴法用来制备反应型可可香料。 关键词关键词：maillard 反应,反应型可可香料,plackett-burman 试验设计,葡萄糖,果糖,氨基酸,gc/ms 法,油 浴,微波 ii abstract the maillard reaction actually includes a series of complex chemical reactions, leading to the formation of flavors considered important in heated food processing. the main study of this paper was the method of preparing cocoa reaction flavor though maillard reaction and its application. at the same time, we discuss possibly existent mechanism.the main content and results are as follow: 1. the main amino acids and reducing sugar were obtained through the plackett-burman experiment design adopting for the first time. the materials of cocoa reaction flavor were leucine (2g), phenylalanine (1.5), glycine (1g), arginine (1g), glutamic acid (1g), serine (0.5g) and reducing sugars (3g glucose and 9g fructose). 2. the best conditions were obtained through uniform design. the temperature and the moisture content of this system were respectively 124 for 20min and 7.39%. at the same time, we found that the moisture content was the best important significant factor in this system. 3. the cocoa essence was produced by modification of cocoa reaction flavor to apply in biscuit, hard candy and ice cream. it showed thermal stability advantage compared with selling compound cocoa essence in market. the product of 16min markedly improved tobacco smoking . the analysis of gc-ms pyrolysis also certified above point. 4. the maillard reaction system of cocoa reaction flavor was studied. we found that moisture content in range of 1020% and acidic condition favored to the formation of the some main aromatic compounds. in addition, fructose was beneficial to the formation of pyrazines, while more aldehydes produced in the reaction of glucose. it was the primary stage of maillard reaction before 5min, in this time amino acids and reducing sugars were a great lot of reducing. the formation process of two cocoa aldehyde ( 5-methyl-2-isopropyl-2-hexenal and 5-methyl-2-phenyl-2-hexenal ) was made clear. 5. we use microwave oven instead of oil bath to product cocoa reaction flavor. the beat conditions were obtained. the time of reaction was 6.8min and the ratio of moisture/ glycol propylene (g/g) was 32.5:17.5 as the same material and amount as oil bath method. the cocoa reaction flavors prepared by the two methods were compared. the result was showed that the microwave methods could replace the oil bath methods to produce cocoa reaction flavor. key words: maillard reaction; cocoa reaction flavor; plackett-burman test design; glucose; fructose; amino acids; gas chromatography/mass spectrometry; oil bath; microwave i 目目 录录 第一章 绪 论.1 1.1可可资源概况 .1 1.2 maillard反应制备可可香料的研究概况.1 1.3 立题背景和意义.3 1.4本论文的主要研究内容.4 第二章 maillard反应型可可香料的研制.5 2.1 引言.5 2.2 材料和仪器.5 2.2.1原料与试剂.5 2.2.2主要仪器.6 2.3实验方法.6 2.3.1 天然可可粉的制备6 2.3.2 天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的提取.6 2.3.3 游离氨基酸分析的条件.6 2.3.4 用于plackett-burman(pb)试验设计分析的maillard反应产物制备7 2.3.5 maillard反应产物的风味物质提取.7 2.3.6 maillard反应产物的gc-ms分析条件.8 2.3.7均匀试验设计进行优化反应参数.8 2.3.8 friedman 排序检验法评价均匀试验设计的反应产物.8 2.3.9反应型可可香料的感官分析9 2.3.10对最终确定的反应型可可香料其致香成分和含量进行gc-ms分析9 2.4 结果与讨论.9 2.4.1焙烤前后天然可可粉中游离氨基酸含量的变化9 2.4.2 pb试验的结果分析10 2.4.3 friedman 排序检验法评价均匀试验设计的反应产物的结果.12 2.4.4 均匀设计优化试验的结果分析.12 2.4.5感官分析结果13 2.4.6 反应型可可香料的挥发性致香成分和相对含量 14 2.5本章小结.16 第三章 反应型可可香料在食品和烟草中的应用研究 .17 3.1 引言.17 3.2实验方法.17 3.2.1调配可可香精17 3.2.2调配型可可香精在饼干中的应用18 3.2.3 调配型可可香精在硬糖中的应用.18 3.2.4 调配型可可香精在冰淇淋中的应用18 3.2.5 反应型可可香料在烟草中的应用.18 3.2.6 16min 的反应型可可香料在烟草中的裂解反应19 3.3 结果与讨论.19 3.3.1调配型可可香精在饼干中的感官情况分析19 3.3.2调配型可可香精在硬糖中的感官情况分析20 ii 3.3.3反应型可可香料在冰淇淋中的感官情况分析20 3.3.4反应型可可香料在烟草中应用的感官情况分析20 3.3.5反应型可可香料在烟草中应用的裂解gc-ms分析21 3.4 本章小结.24 第四章 maillard反应型可可香料的反应动力学研究.26 4.1 引言.26 4.2 材料和仪器.26 4.2.1原料与试剂26 4.2.2主要仪器26 4.3实验方法.27 4.3.1 水分含量对 maillard 反应的影响27 4.3.2 葡萄糖和果糖对 maillard 反应产生风味的影响27 4.3.3 maillard反应体系的动力学研究.27 4.4 结果与讨论.27 4.4.1水分含量对maillard反应的影响分析.27 4.4.2 葡萄糖和果糖对 maillard 反应产生风味的影响分析28 4.4.3maillard反应体系的动力学研究结果分析30 4.5本章小结.34 第五章 微波法制备反应型可可香料.35 5.1 引言.35 5.2 材料和仪器.35 5.2.1原料与试剂35 5.2.2主要仪器36 5.3实验方法.36 5.3.1微波法制备反应型可可香料36 5.3.2微波法制备的反应型可可香料的gc-ms分析36 5.4结果与讨论.36 5.4.1单纯形优化法介绍36 5.4.2单纯形优化法制备反应型可可香料的结果36 5.4.3微波法制备的反应型可可香料的gc-ms分析37 5.5本章小结.39 主要结论.40 致 谢.41 参考文献.42 附录 friedman秩和检验临界值表.46 攻读硕士学位期间发表论文情况.47 1 第一章第一章 绪绪 论论 1.1 可可资源概况可可资源概况 可可是世界上重要的热带经济作物，由于其具有浓郁芬芳的独特风味及重要的营养价值，成为 当今世界上三大嗜好性饮料之一（茶、咖啡） ，经久不衰。可可更是巧克力的重要原料，也是各种甜 点、焙烤、小吃食品和饮料的香料成分。近几十年来，全球可可豆的消耗一直都呈稳定发展的态势。 上世纪 90 年代中期以来， 随着食品结构和消费习惯的变化以及对外贸易的拓展， 可可及可可制品 （可 可脂、可可粉、可可浆）应用范围的日趋扩大，我国可可加工行业发展迅猛。我国年平均可可豆进 口量是世界总产量的 1%左右，约 3.4 万 t 左右，在世界 82 个可可豆进口国中进口量排名世界第 16 位。可见，我国对可可产品的需求量日益增大1。 由于自然条件的限制， 可可只能在适宜的自然环境中种植生长即在南北纬 20以内， 年平均气温 在 2428，年降雨量为 1300mm，土地肥沃，排水通畅的湿谷地或沿海平原，也就是分布在非洲、 拉丁美洲和亚洲三大洲。一棵可可树 5 年树龄后所生产的可可豆才能加以利用，15 年树龄后可可树 的产量才会达到最高峰，并维持到 30 年树龄左右，40 年树龄以上就不再产生效益。因此，可可树 不是一种高产植物。全世界的可可豆的产量正常年份约为 300350 万 t 左右，其中 2/3 在非洲，特 别集中在西非洲，而该洲中的加纳和尼日利亚是世界上提供可可资源最重要的地区；其次是拉丁美 洲，产量占总量的 1/3 以下。而亚洲产量少，占总产量的 1%。近些年亚洲增长速度较快，产量逐年 上升约占 16%。而我国在 20 世纪 50 年代先后引种多批载种于海南西部和西双版纳成功，表明该地 区气候条件能适宜可可的生长24。 可可豆是一种期货商品。其生产国的政治形势、种植面积和产量以及世界可可豆期货市场各种 因素变化，都对可可豆的价格产生直接影响5。 1.2 maillard 反应制备可可香料的研究概况反应制备可可香料的研究概况 食品在蒸煮、焙烤及煎炸中产生的食品香料，即食物经加热而分解、氧化、重排或降解，形成 香味前体，进而生成具有特殊风味的食品香料，一般称之为热加工食品香料，亦叫反应食品香料， 这类香气物质形成的化学机理就是 maillard 反应。 maillard 反应发生在还原糖和氨基酸或者是肽、 蛋 白质之间，氨基酸来源的选择对反应的香气和味道有较大的影响。一种或几种氨基酸与还原糖系统 经过加热反应可生成逼真的各种香味。 maillard 反应一般可以分成三个反应阶段，如图 1-1 所示，足见 maillard 反应的复杂性： 1、初级反应阶段 还原糖的碳基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去 1 分子水转变为希夫碱(shiffbase)，再经环 化形成相应的 n-取代的醛基胺，经 amadori 重排转成有反应活性的 1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。初级 maillard 反应不引起褐色变，也不产生香味，但其产物是产生极重要的不挥发性香味物质的前驱物。 2、高级反应阶段 在氨基酮糖和氨基醛糖等重要的不挥发性香味前驱物形成之后，mailard 反应变得更为复杂，反 应后产生还原酮、糠醛和不饱和 c 基化合物等，这些不同的化合物依次反应，开始形成无氮及含氮 褐色可溶性化合物。此反应阶段主要包括 3 条反应路线。第 1 条路线还原酮路线。由 maillard 重排反应产物 1-氨基-1-脱氧-2-酮糖在 2-3 位置不可逆地烯醇化， 从 c1消去胺基生成甲基二碳基中间 体，其进一步反应产物如 c-甲基醛类、酮醛类、二碳基化合物和还原酮等裂解产物； 第 2 条路线osulose 和 hmf 路线。 amadori 产物在 1,2 位置上烯醇化， 并消去 c3上的经基， 2 加水分解并失去其含氮部分而生成 3-脱氧 osulose，进而生成 3,4-二脱氧 osulose，最后又脱水生成 糠醛类风味成分； 第 3 条路线-strecker 降解。在 strecker 降解中，各种不同的特殊醛（亦称 strecker 醛类）是造成 食品不同香气的因素之一，而氨基酮经异构为烯醇胺，再经环化形成吡嗪类化合物。食品焙烤时产 生的浓郁香味，多为吡嗪产生。 3、最终反应阶段 高级 maillard 反应阶段形成的众多活性中间体，如葡萄糖酮醛、3-脱氧 osulose(3-dg)、3,4 -二 脱氧 osulose(3,4-二 dg)、hmf、还原酮类、不饱和醛亚胺等，又可继续与氨基酸反应，最终都生成 类黑精色素-褐色含氮色素。此过程包括醇醛缩合、醛氨聚合、环化合反应等。加热食品所具有的烤 香、焙烘香、炒香大都是与环化合反应有关，因其生成了诸如吡嗪、吡啶、吡咯等氮杂环化合物6。 还原糖-氨基酸类 n-葡基胺或 n-果糖基胺 1-氨基-1-脱氧-2-酮醣（amadori 中间体）或 2-氨基-2-脱氧-1-醛醣（heyns 中间体） 还原酮和脱氢还原酮 h2s 逆醇醛化 氨基酸 nh3 strecker 降解 3-呋喃酮类 4-吡喃酮类 羟甲基丙酮 乙二醛 醛类-氨基酮类 吡咯类 二羟基丙酮 丙酮醛 (+乙硫磷醛,来自甲硫氨酸) 噻吩类 羟基乙酰 乙醇醛 (+h2s 和 nh3,来自半胱氨酸) 甘油醛 杂环化 吡啶类 噻唑类 吡嗪类 吡咯类 恶唑类 咪唑类 图图 1-1 maillard 反应途径示意图反应途径示意图 天然可可风味的产生主要是通过发酵、干燥和焙烤三个过程。发酵是产生可可特异性香味的前 体条件（游离氨基酸、短肽和还原糖） 。同时，发酵能大大降低可可碱和单宁的含量，改善涩味和苦 味。而后的干燥过程能使水分含量大大降低，大约到 8%左右，酸含量降低、ph 升高。在焙烤过程 中，发酵产生的风味前体发生 maillard 反应，最终产生可可的特异性风味。maillard 反应制备可可香 料的主要原理是基于对可可物质在加热过程中产生风味物质的反应的模拟79。 而国内多见的是肉类 maillard 反应香料的制备研究报道，对于可可味并未见报道。出于技术和 商业保密，国外多见的是专利文献。目前，maillard 反应产生可可风味的方法大致有三种：其一， 酶水解植物蛋白。可可中产生风味前体的酶是天门冬氨酸内源蛋白酶10和羧肽酶11，它们可以通过 基因重组制备，也可以用其它酶替代。us-a-2,887,388 和 us-a-2,835,592 揭示出用玉米、小麦、大 麻、大豆、黑麦、燕麦、花生、大麦，动物和鱼蛋白的蛋白水解液和氨基酸反应人工制备可可/巧克 力风味。 wo02063974 是通过在 ph25 酸化未发酵的完全或部分脱脂的可可液， 用基于可可干重的 0.1%5%的蛋白酶（风味酶 1000l 等）在 4060下水解 148 小时，进行焙烤能产生强烈的可 可风味12。通过生物技术手段制备可可风味前体亲水性短肽13，在和氨基酸混合物、还原糖反应， 同样能生产浓郁的可可风味；其二，将一些可可提取物补充到反应体系中，达到更逼真的效果。国 外有以果糖、几种氨基酸、少量可可提取物、水和丙二醇混合物制备巧克力味的热反应型香精的实 例14；其三，仅用氨基酸和还原糖达到最逼真的可可风味。 us-a-5, 676,993 揭示出增强可可风味 3 是通过焙烤氨基酸混合物和还原糖在脂肪基质中，如磨碎可可豆（湿透的） 、可可液或可可脂15。目 前，国外市场上出售有以 maillard 反应产物制备的巧克力香精16。 1.3 立题背景和意义立题背景和意义 天然可可粉风味较弱，应用于食品或烟草中时，其用量较大，易增加食品的成本。而且，在风 味饮料中应用时，由于颗粒较大，容易发生下沉，从而影响了饮料的感观品质。另外，可可的种植 需要独特的地理环境，而且其产量受制于气候、战争等多种因素，因此价格极不稳定。为了克服天 然可可粉紧张的供应局面，增强食品的可可风味，降低原料成本，同时满足人们对可可风味的需求， 可可的这种商业重要性刺激了人们对其风味性质的进行研究。而天然提取的可可酊或可可浸膏对技 术的要求很高，制备方法繁锁，价格昂贵，产量少，状态不易添加到食品中。经单体调配的香精是 目前生产香精、香料的常用方法，价格低廉，但风味不足，不够逼真，稳定性差，同时安全性值得 考虑。 人民生活水平提高，对食品的色、香、味提出了更高的要求。回归自然已是一种时尚，利用 maillard 反应产生各种天然风味是食品风味研究的潮流。maillard 反应技术在香精领域中的应用打破 了传统的香精调配和生产工艺的范畴，是一全新的香精香料生产应用技术，产品不仅有良好的耐热 性，而且能在加热时产生平常难以得到的香气，产生更自然、更诱人、更逼真的香味效果，具有调 配技术无法比拟的作用。但有时香味强度还是不够，需要进一步调配。利用 maillard 反应生成的香 料在国际上认为是属于天然香料范畴17,18，被美国食品药品管理局（fda）认定为是一般公认安全 的产品(gras)12。同时，maillard 反应香料具有许多的生理功能，如对矿物质的吸收和排泄的影响、 具有类似于食物纤维的作用、抗氧化作用、对亚硝胺生成的抑制作用、对过剩氧的消去作用、对免 疫系统的生理作用和抗突变作用1921。 1.4 本论文的主要研究内容本论文的主要研究内容 在以上介绍的 maillard 反应制备可可风味的三种方法中，第一种方法，用酶法水解产生风味前 体，其中重要的酶羧肽酶价格相当昂贵，虽有专利报道可用其它酶代替，但经本人试验，并没产 生应有的效果；第二种方法，添加天然的可可提起物，虽能达到很好的效果，但经济上不合算，也 未揭示产生风味的本质。因此，本人从最基本、最重要的氨基酸和还原糖发生的 maillard 反应入手， 制备反应型可可风味。主要内容如下： 1、在比较焙烤前后天然可可粉中游离氨基酸含量变化的基础上，通过 plackett-burman 试验设 计筛选对可可风味具有主要贡献的氨基酸和还原糖； 2、采用油浴加热方法，应用均匀试验设计，考察反应体系的温度、时间、水分含量三个重要参 数对 maillard 反应产物可可风味的影响， 并对 maillard 反应产物中致香成分进行 gc/ms 分析和感官 评价。探讨微波加热方法制备 maillard 反应型可可香料的可能性； 3、在均匀试验设计中，基于水分含量严重影响 maillard 反应的现象，研究不同水分含量对 maillard 反应的影响、果糖和葡萄糖分别对可可风味物质生成的影响，以及反应时间与体系中氨基 酸、还原糖的残留量和致香成分生成量的关系； 4、研究 maillard 反应型可可香料在食品和烟草中的应用情况。 4 第二章第二章 maillard 反应型可可香料的研制反应型可可香料的研制 2.1 引言引言 如绪论所述，由于可可风味物质的前体是短肽、游离氨基酸和还原糖（葡萄糖和果糖） ，国外有 报道用酶（天门冬氨酸内源蛋白酶和羧肽酶）水解植物蛋白或基因重组技术合成前体短肽，这两种 方法所用费用相当高，不利于工业化生产。本人在初步研究的基础上发现，用风味酶水解植物蛋白 时，由于此酶作用广泛生成的副产品较多，不利于可可风味的形成，而添加可可提取物成本也较高。 rohan 和 stewart 用缬氨酸和亮氨酸与葡萄糖加热反应生产类似巧克力香味22。 herbert foster 证 明苏氨酸或缬氨酸与葡萄糖一起加热可产生类似巧克力的香味23。lane 和 nursten 则采用丝氨酸或 酪氨酸与葡萄糖一起加热产生类似巧克力的香味24。但是这些前人所反应出的产品仅表现出可可的 某一特征风味，气味单一、不够浓厚，不能作为可可香料用于实际生产。本人期望通过研究选出能 够制备出可可香料的几种主要氨基酸和还原糖。 在 us-a-5, 676,993 专利中报道，以可可脂为基质混合氨基酸与还原糖反应可产生可可风味15， 但通过实验发现此法并不可行，反应物在其中不能均匀分散。经过摸索，采用丙二醇作为反应介质。 在提取致香成分的方法选择上，由于 sde 需在较高温度下进行，采用此法会使 maillard 产物继续反 应，得到的结果不可靠。而由于可可风味本身香气较弱、柔和，spme 对其风味的提取极为有限， 所以采用室温下溶剂提取的方法，目的是能更真实地反映产品特性又能最大限度地提取其中的致香 成分。 本章在确定制备反应型可可香料的原料基础上，采用均匀试验设计，进一步优化 maillard 反应 参数。再由专业食品调香师对所制备的产品进行感官评价，又对其中的主要致香成分进行 gc-ms 分析。 2.2 材料和仪器材料和仪器 2.2.1 原料与试剂原料与试剂 干燥过的可可豆(品种为福拉斯蒂罗) 无锡上可食品有限公司 葡萄糖（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 l-氨基酸（生化级） 上海康捷生物科技发展有限公司 果糖（生化级） 国药集团化学试剂有限公司 正戊烷 （色谱纯 99%） lancaster 公司 无水乙醚（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 无水硫酸钠（化学纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司 柠檬酸三钠（分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司 2.2.2 主要仪器主要仪器 agilent 6890-5973 气相色谱-质谱联用仪 美国 agilent 公司 agilent 1100 液相色谱仪 美国 agilent 公司 zx98 型旋转蒸发器 上海有机化学研究所 5 dj02 粉碎机 上海淀久中药机械制造有限公司 beckman-coulter22r 离心机 美国 beckman-coulter 公司 油浴 he-4 德国 julabo 公司 天平 arrv70/c 奥豪斯仪器（上海）有限公司 nxs600w 数控超声波清洗机 鑫能信超声设备（集团）有限公司 2.3 实验方法实验方法 2.3.1 天然可可粉的制备天然可可粉的制备 去除外种皮的可可豆粉碎并过 80 目筛，在 120下焙烤 20min。 2.3.2 天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的提取天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的提取 称取 3g（精确到 0.001g）焙烤前后脱脂可可粉（索氏提取 10h 左右） ，用 20ml 20g/l 柠檬酸钠 溶液 （ph2.2） ， 超声波提取 3h， 4100g 离心获得的上清液经过滤后， 用 20g/l 柠檬酸钠溶液 （ph2.2） 定容 25ml，微孔滤膜过滤，进样。 2.3.3 游离氨基酸分析的条件游离氨基酸分析的条件 色谱柱：4.0250mm c18 柱温：40 流速：1.0ml/min 波长：338nm，262nm（pro） 流动相：a：20mmol 醋酸钠溶液 b：20mmol 醋酸钠溶液：甲醇:乙腈1:2:2（v/v） 进样量：1l 2.3.4 用于用于 plackett-burman(pb)试验设计分析的试验设计分析的 maillard 反应产物制备反应产物制备 plackett-burman(pb)试验设计是一种经济而有效的二水平试验设计方法。 11 个二水平变量的 pb 设计仅需要 12 次试验（如表 2-1 所示） ，就可达到良好的效果且因子的交互作用仅部分的与主因子 发生混淆25。 pb 试验的 maillard 反应条件：根据表 2-2 中氨基酸和还原糖的种类和用量，按表 2-1 中的 pb 试验顺序进行 12 次反应，以 80g 丙二醇为溶剂，加入 20ml 水，在冷凝回流条件下油浴快速升温到 124反应 20min，搅拌，搅拌速率为 300r/min。反应结束循环水冷却至室温 25左右，反应产物保 存在-20冰箱内。 6 表表 2-1 11 个因素的个因素的 plackett-burman 试验设计表试验设计表 实 验 因 素 试验 序号 x1 x2 x3 x4x5x6x7x8x9x10 x11 1 +1 +1 +1 +1+1+1+1+1+1+1+1 2 -1 +1 -1 +1+1+1-1-1-1+1-1 3 -1 -1 +1 -1+1+1+1-1-1-1 +1 4 +1 -1 -1 +1-1+1+1+1-1-1 -1 5 -1 +1 -1 -1+1-1+1+1+1-1 -1 6 -1 -1 +1 -1-1+1-1+1+1+1-1 7 -1 -1 -1 +1-1-1+1-1+1+1+1 8 +1 -1 -1 -1+1-1-1+1-1+1+1 9 +1 +1 -1 -1-1+1-1-1+1-1 +1 10 +1 +1 +1 -1-1-1+1-1-1+1-1 11 -1 +1 +1 +1-1-1-1+1-1-1 +1 12 +1 -1 +1 +1+1-1-1-1+1-1 -1 表表 2-2 plackett-burman 设计因子水平范围设计因子水平范围 因 素 x1 缬氨酸 /g x2 甘氨酸 /g x3 苯丙氨 酸/g x4 亮氨酸 /g x5 酪氨酸 /g x6 苏氨酸 /g x7 丝氨酸 /g x8 谷氨酸 /g x9 精氨酸 /g x10 葡萄糖 /g x11 果糖 /g +1 1.2 1.2 0.8 0.8 0.8 0.5 0.5 0.5 0.2 5 10 水 平 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 5 2.3.5 maillard 反应产物的风味物质提取反应产物的风味物质提取 500ml 三角瓶中称取 50g（精确到 0.001g）2.3.4 中制备的 maillard 反应产物，加入 60 ml 正戊 烷-乙醚混合液（2:1）室温下磁力搅拌提取 4h，用分液漏斗分离得到的有机相中加入无水 na2so4 过夜，过滤后滤液倒入具刻度的浓缩瓶中，样品在 39下旋转蒸发浓缩到 1ml，供 gc-ms 分析。 2.3.6 maillard 反应产物的反应产物的 gc-ms 分析条件分析条件 色谱柱：hp-innowax（60m0.25m0.25mm） 载气：he 流量：1ml/min 进样口温度：250 分流比：50:1 进样量：1l 程序升温：60 /min2 180 min/10 220/40min 离子源：ei 源 离子源温度：230 扫描范围：10450amu 进样条件：自动进样 采用计算机和人工解析 gc-ms 图谱，每个峰同时用 nist library 和 wiley library 进行匹配检 索定性，确认其化学成分。 7 2.3.7 均匀试验设计进行优化反应参数均匀试验设计进行优化反应参数 将pb试验设计筛选出的氨基酸和还原糖以及确定的反应量， 以保持丙二醇与水的总重量为100g 的基础上，按表 2-3 中条件所示进行均匀试验反应，其它条件同 2.3.4。本实验期优化反应参数，更 好地应用于生产实践。 表表 2-3 u53 均匀试验设计因素水平表均匀试验设计因素水平表 样品编号 温度 x1/ 时间 x2/min 水:丙二醇量(g/g)x3 （x3 对应水分含量%） 1 94 15 20:80 16.81 2 104 25 0:100 0 3 114 10 30:70 25.21 4 124 20 10:90 8.40 5 134 30 40:60 33.61 2.3.8 friedman 排序检验法评价均匀试验设计的反应产物排序检验法评价均匀试验设计的反应产物 由 7 名专业的评香师对五种样品按嗜好程度进行排序。秩次由大到小，代表样品由优到劣。排 序的结果采用 friedman 检验对样品之间是否存在显著差异作出判定，公式如下： ) 1(3)( ) 1( 12 22 3 2 2 2 1 + + =pjrrrr pjp f p 式中：j评香师数； p样品数； r1、r2、r3rpj 个评香师对 p 中样品评价的秩和。 2.3.9 反应型可可香料的感官分析反应型可可香料的感官分析 要求 8 名专业评香师在光线充足、柔和适宜，温度为 25，空气新鲜，无香气及邪杂气味，安 静、无噪音的品评室中用闻香纸品评。每位评香师先讨论产品的单一风味特性，然后汇总 8 名评香 师的分析结果，根据平均值画出风味剖面图，并对产物的综合印象分进行两两 t 检验(=0.01)，确定 其中每两种产品的差异性。根据表 2-4 中的内容进行打分。 表表 2-4 感官分析问答表感官分析问答表 评价员姓名： 日期： 产品名称 自制天然可可粉 市售复配可可香精 反应型可可香料 感官特性描述 （按顺序） 强度 （数字评估 110） 强度 （数字评估 110） 强度 （数字评估 110） 1、坚果味 2、麦芽甜味 3、苦味 4、青味 5、果味 6、花味 7、焦味 8、酸味 综合印象（110 分） ： 8 2.3.10 对最终确定的反应型可可香料其致香成分和含量进行对最终确定的反应型可可香料其致香成分和含量进行 gc-ms 分析分析 将 pb 试验设计筛选出的氨基酸和还原糖以及确定的相应反应量作为制备反应型可可香料的原 料，反应条件采用均匀试验得到的最优结果，其它反应操作和风味物质的提取同 2.3.4 和 2.3.5，加 入 100l 的正十七烷做为内标。 2.4 结果与讨论结果与讨论 2.4.1 焙烤前后天然可可粉中游离氨基酸含量的变化焙烤前后天然可可粉中游离氨基酸含量的变化 如表 2-5 所示，焙烤前后天然可可粉中氨基酸损失量从大到小依次是 phe、leu、arg、tyr、glu、 val、gly、ser、thr、ala、lys、pro、ile、met、his。edy 和 nelson 的研究26中前 9 种损失量最大 的氨基酸与本实验结果一致，差别是这 9 种氨基酸损失量大小的排序不同。某种氨基酸在焙烤过程 中损失量越大，可能更说明该种氨基酸对 maillard 反应的贡献越大。为此，氨基酸的选择为 phe、 leu、arg、tyr、glu、val、ser、thr、gly 这 9 种，还原糖的选择为天然可可豆中仅含有的葡萄糖 和果糖两种还原糖进行后续的 pb 试验分析。表 2-5 中，除半胱氨酸(cys)外，各种氨基酸含量测定 的相对标准偏差都在允许范围(5%)内。由于半胱氨酸是含硫氨基酸，不会应用在可可香料的制备中。 表表 2-5 天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的变化天然可可粉焙烤前后游离氨基酸的变化 氨基酸 焙烤前(ppm) rsd 焙烤后(ppm) rsd 变化* asp glu pro his ala lys val arg tyr cys-s gly met phe ile leu ser thr 47.83971 106.92886 42.50726 15.10194 18.43252 48.47529 112.21875 87.55041 89.02302 4.11128 90.06742 13.96533 135.29244 58.61289 163.84666 59.38135 62.26317 0.284% 0.314% 0.731% 0.017% 0.049% 0.007% 0.541% 0.625% 0.311% 107.833% 0.431% 0.568% 0.468% 0.341% 0.435% 0.719% 1.384% 50.82495 87.75750 35.56002 14.07342 16.42878 41.55414 96.85087 67.34508 69.62991 9.23515 78.14585 9.87584 98.15862 54.15254 129.39685 45.99769 53.19128 0.793% 0.508% 0.543% 1.154% 1.254% 0.408% 0.920% 1.004% 0.918% 2.363% 0.868% 1.602% 0.980% 1.047% 1.054% 2.741% 3.418% -2.98525 19.17136 6.94724 1.02852 2.00375 6.92115 15.36788 20.20534 19.39312 -5.12388 11.92158 4.08949 37.13382 4.46035 34.44981 13.38367 9.07188 注： “*”焙烤前减去焙烤后 ； “-”说明在焙烤后含量有增加 2.4.2 pb 试验的结果分析试验的结果分析 结合文献报道27，确定 3-甲基-正丁醛、苯甲醛、苯乙醛、5-甲基-2-异丙基-2-己烯醛、甲基吡 嗪、二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、4-甲基戊酸、1,3-二氧戊环类作为可可风味关键致香成分。andrew 用稀释分析法分析可可香气，认为具有麦芽香气的 3-甲基丁醛的风味稀释指数最高 28。苯甲醛是氨 基酸的斯特雷克尔反应生成，具有令人愉快的杏仁香、坚果香和水果香27。5-甲基-2-异丙基-2-己烯 醛和 5-甲基-2-苯基-2-己烯醛均称为可可醛，具有草香、木香、果香，巧克力香气，花香、苦的、巧 9 克力味道，是重要的可可特征风味。烷基吡嗪（甲基、二甲基、三甲基）均具有浓郁的坚果香、可 可粉的气味28。4-甲基戊酸稀释后具有干酪香、奶香、果香29,30。1,3-二氧戊环（乙二醇缩甲醛）衍 生物，其是相应的醛与溶剂丙二醇的反应产物，具有令人愉快的清甜香、青香、蔬菜香、杏仁香气 等。食用香料评审权威机构美国 fema 认定 1,3-二氧戊环为可食用合成香料31 33。此 pb 试验设计 的结果是以峰面积作为标准进行分析， 采用 sas v8 软件的 reg 程序对 12 个试验样品中选出的 11 种 主要致香成分的峰面积分别进行逐步线性回归分析，找出对每种致香成分有主要贡献的氨基酸和还 原糖。 表 2-6 的统计分析结果表明，苯丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸分别对选 出的几种重要致香成分具有最显著的影响，并呈正相关性。而两种还原糖中葡萄糖对醛类表现出显 著影响，果糖对吡嗪类致香成分有显著影响。故通过 pb 试验筛选出以上 6 种氨基酸和 2 种还原糖 作为 maillard 反应制备可可香料的原料。每种氨基酸用量是根据其之间的重要性， （如亮氨酸对 8 种 致香成分有贡献，3 种致香成分有最主要的贡献） ，还原糖中葡萄糖和果糖的比例以及氨基酸与还原 糖总量之间的比例均参照天然可可粉中的比例，氨基酸的总量以反应后产品中没有可见沉淀为宜。 因此，最终确定 6 种氨基酸（即 2g 亮氨酸、1.5g 苯丙氨酸、1g 精氨酸、1g 甘氨酸、1g 谷氨酸、 0.5g 丝氨酸）和 2 种还原糖（即 3g 葡萄糖、9g 果糖）作为制备反应型可可香料的原料。 10 表表 2-6 pb 试验统计结果（每种氨基酸对致香成分的显著性分析）试验统计结果（每种氨基酸对致香成分的显著性分析） 可可主要致香成分 苯丙氨酸 p亮氨