细胞支原体污染的pcr检测

细胞支原体污染的 PCR 检测 支原体菌株来源：支原体菌株来源： M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体 M.FermentaneATCC19989 发酵支原体 M.SalivariumATCC23064 唾液支原体 M.HominisATCC23114 人型支原体 M.OraleATCC23714 口腔支原体 M.HyorhinisATCC29052 猪鼻支原体 其共同引物序列来自 16s 和 23s 保守区域 外部引物为1 5-3 1 5-3； 内部引物为2 5-3 2 5-3 反应体系和条件：反应体系和条件： 10缓冲液(10-、500、202、0.01%明胶)、 1、1、2、2 的浓度为 2/、 2.5、 酶、 2、 石蜡油覆盖 反应温度和时间为: 94 /2预变性、94/30变性、55/1退火、72/1延伸 循环 30 次后 72延伸 5 第 1 次反应取模板 10,第 2 次反应以第 1 次扩增产物为模板取 1。 下面是更详细的：下面是更详细的： 污染测试支原体：PCR 方法 原理： 利用具特殊专一性之 primers，经由 PCR 反应来复制 mycoplasma DNA。所用之 primers 来自 mycoplasma 之 conserved 16S-23S rRNA 序列，由于此段 spacer 之序列依 mycoplsma 种类不同而不同， 因此可依所复制之 DNA 大小及其 restriction fragment 大小差异来作侦测与鉴定。 特点：灵敏(e.g. 0.11.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之 mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养 mycoplasma 作为正反应对照组，避免可能之污染。 缺点：PCR 反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。 材料与设备：材料与设备： ATCC mycoplasma detection kit:可作 50100 reactions. 提供 1st stage primer mixture 与 2nd stage primer mixture positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum) PCR reagents : Taq polymerase ( 5 U / ul ) dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each ) 10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2) 25mM MgCl2 sterile ddH2O Machine / Equipment： PCR thermal cycler agarose 电泳设备 DNA 电泳胶体观察设备 无菌 PCR 反应管 无菌 1.5 ml 微量离心管 无菌 2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans 方法：方法： 此 PCR 反应是一种 nested PCR，包括 2 阶段 PCR 反应，1st stage PCR 结束后，取其反应物作 2nd stage PCR，然后取 2nd PCR 产物作 agarose gel electrophoresis，依 DNA band 之有无及片段大小 来分析结果。 结果：结果：使用 UV light 观察，并照相记录。 不过应用较多还是巢式 PCR 方法：方法：此 PCR 反应是一种 nested PCR，包括 2 阶段 PCR 反应，1st stage PCR 结束后，取其反应物作 2nd stage PCR，然后取 2nd PCR 产物作 agarose gel electrophoresis，依 DNA band 之有无及片段大小 来分析结果。 结果：结果：使用 UV light 观察，并照相记录。 方法再详尽点：方法再详尽点：1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：）： 测试样品 ( 2 ul / each ) 直接取样测试细胞之培养液。 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum ) Negative control : ddH2O Reaction mixture ( 23 ul / each ) 10x PCR buffer (含 1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul 1st stage primer mixture 0.5 ul dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul ddH2O 18.4 ul PCR program ( 1st PCR 与 2nd PCR 相同)：使用 PCR thermal cycler step 1 : denaturation: 94 30 sec step 2 : denaturation: 94 30 sec step 3 : annealing: 55 2 min step 4 : extension: 72 2 min 重复 3.1.3.2 至 3.1.3.4 步骤 30 cycles step 5 : final extension 72 5 min 2nd stage PCR reaction（total volume 25 ul） 测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each） 。 Reaction mixture ( 24 ul / each ) 10x PCR buffer (含 1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul nd stage primer mixture 0.5 ul dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul ddH2O 19.4 ul PCR program 同 3.1.3；使用 PCR thermal cycler 胶片电泳分析胶片电泳分析 胶片 (2.0%) 置备: 将 2 g agarose 溶于 100 ml ( 1x ) TAE buffer。 电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer） 选择 100500 bp DNA size Marker：取 100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul ) 取 10 ul 2 nd stage PCR 产物分析，各加入 2 ul ( 6x ) loading dye。 进行电泳分离 100V, 25 min。 胶片染色：ethidium bromide 染色 10 min，H2O 退染 10mim。 （EtBr 为致癌物质，请戴手套并小心操 作） 结果：使用 UV light 观察，并照相记录。 Figure Agarose g