肿瘤发生的分子生物学基础

第五章第五章 肿瘤发生的分子生物学基础肿瘤发生的分子生物学基础 第一节第一节 概概 述述 肿瘤的发生与基因密切相关，基因突变或基因表达失常是肿瘤发生的关键。 从分子上来考察一个肿瘤细胞的产生、发展和形成，则是细胞大分子结构和功能改变及细胞小 分子代谢失常的结果。RNA、蛋白质分子的变异源于 DNA 或基因的改变。细胞小分子代谢失常来自 代谢酶的改变。细胞生长、发育、分裂、分化、衰老、凋亡的改变来自于生长因子、生长抑制因子、 激素、受体、细胞骨架蛋白及各种细胞多肽或蛋白质的变异。但追溯其源，其本质和核心乃是 DNA 分子上的基因结构、功能改变和表达异常所致。肿瘤分子生物学，正是从研究细胞内生物大分子的 结构与功能改变和细胞内各种小分子代谢失常入手来探讨癌变产生的分子机制的。癌基因、抑癌基 因、代谢基因、修复基因、等的改变与肿瘤发生的关系得到了广泛的研究。生长因子、生长抑制因 子、激素、信号传递蛋白质、受体、各种生物活性多肽和蛋白质、细胞周期蛋白、细胞骨架蛋白等 基因产物，在肿瘤发生中的作用也同样得到了众多的研究。这些研究，从不同侧面正在逐步构画出 基因、DNA、RNA、蛋白质的结构和功能改变是如何不断地将一个正常细胞转变为癌细胞的基本轮廓。 第二节第二节 肿瘤产生的分子基础肿瘤产生的分子基础 一、一、DNADNA 的结构、性质和功能改变的结构、性质和功能改变 DNA 是双螺旋结构的分子。当细胞分裂时，双螺旋问的氢键打开成为 2 股单链，每股单链以自 身为模板，通过碱基配对原则复制出完全互补的另一条链，形成 2 个完全相同的 DNA 分子。继而 2 个相同的 DNA 分子随着细胞分裂平均分配于 2 个子细胞中，实现其遗传性状的稳定性。然而，DNA 分子维系的遗传稳定性是相对的，其改变则是不可避免的。DNA 分子结构的改变主要来自 3 方面的 冲击： DNA 分子的自发断裂和碱基的丢失； DNA 自我复制造成的错误； 各种各样的致癌剂 对 DNA 分子的损伤作用。致癌剂对 DNA 分子的损伤作用是 DNA 分子结构改变中最重要的原因。其结 果是造成 DNA 分子结构、性质和生物学功能的改变。 碱基对的改变，是 DNA 分子结构改变中最基本的方式。其主要形式有替代、缺失、插入、颠换 等几种情况(图 5-1)。DNA 分子上碱基对的排列顺序负载着特定物种的遗传密码信息。只要有一对 碱基改变，DNA 分子上的三联体密码的框码就会移动和错排。碱基对改变后的 DNA 分子已经不再是 原来物种的遗传物质，而是变异的遗传物质. 2 DNADNA 加成物的形成是加成物的形成是 DNADNA 分子结构改变的重要方式之一。分子结构改变的重要方式之一。 a.DNA 加成物的形成是 DNA 分子结构改变重要方式（图 5-2） 。 b.X 射线引起 DNA 结构改变。 c.烷化剂，多环芳香烃等致癌物改变 DNA 的结构。 d.紫外线引起 DNA 结构改变。 e.病毒引起 DNA 结构改变：病毒整合到细胞 DNA。 DNA 结构改变易分解为单链，使 DNA 的复制和转录活性增加：DNA 的复制准确性的降低是 DNA 性质改变的另一个重要特征。DNA 复制的准确性，是保持遗传稳定性的关键所在。在致癌物的作用 下，DNA 链上的碱基往往会发生改变。未经致癌物作用的 DNA 与致癌物作用的 DNA 分子的碱基组成 亦不相同。通过核酸单链构象分析(SSCP)，可以方便地测出 DNA 上碱基的改变。DNA 上碱基改变导 致 DNA 结构改变，就会使 DNA 的性质和复制准确性改变，最终可导致细胞的突变。 二、二、RNARNA 和蛋白质的结构、性质和功能改变和蛋白质的结构、性质和功能改变 3 mRNA 分子以 DNA 分子的一条链为模板，在 RNA 聚合酶的作用下转录出的单链核糖核酸分子。 它负载着一条多肽链上氨基酸排列顺序的密码。从分子结构改变的 DNA 上转录出的 mRNA 与从正常 DNA 分子上转录的 mRNA 是不相同的。 DNA 的结构、性质和功能的改变，是 RNA 和蛋白质的结构、性质和功能改变的根源。而蛋白质 的结构、性质和功能的改变则直接影响细胞的增殖、生长控制、分裂速度、功能分化。一个细胞的 增殖失去分化，癌变就会发生。 第三节第三节 DNADNA 损伤损伤 DNADNA 损伤的类型损伤的类型 DNA 分子的结构改变是致癌剂对 DNA 损伤造成的结果。DNA 的损伤往往伴随 DNA 结构的改变。 从 DNA 链的完整性观察，致癌剂对 DNA 的损伤类型有：双链断裂；单链断裂；链交联； 片断丢失等（图 5-3） 从 DNA 分子上碱基的变化看，致癌剂对 DNA 的损伤类型有： 碱基二聚体形成； 碱基加成 物形成； 碱基缺失； 碱基取代和碱基错配等（图 5-4） 。 第四节第四节 癌基因癌基因 4 一、概述一、概述 存在于正常细胞中未被激活的癌基因，称为原癌基因（protooncogene） 。当原癌基因被激活后 才能转变为癌基因。 二、种类二、种类 癌基因种类繁多，按原癌基因产物的功能，则可以把癌基因分为生长因子与生长因子受体类、 蛋白激酶类、G 蛋白功能类和核内蛋白类等四大类（表 6-3） 。 5 三、癌基因产物的作用机制三、癌基因产物的作用机制 鉴于癌基因种类繁多，其编码的癌基因产物更是功能众多，作用机制复杂，但癌基因属于调控 基因，癌基因产物必然与细胞内的信号传递、蛋白质活化、酶的激活、转录的启动和调节、细胞分 裂与分化过程等各个环节相关。目前已经发现了四大类癌基因产物，大都属于此列。 四、癌基因与肿瘤四、癌基因与肿瘤 存在于正常细胞中的癌基因为原癌基因。原癌基因是细胞基因组的正常成分。只有当某些因素 作用后，原癌基因的结构改变和激活才会导致调控失常。激活后的癌基因才具有致癌活性。因此， 原癌基因的激活是导致肿瘤产生的关键因素。原癌基因的激活有多种途径，主要激活方式有点突变、 基因重排、基因扩增等类型。 1 1点突变点突变 在基因的编码顺序上某一核苷酸发生的突变叫点突变，点突变是癌基因激活的重要方式。从膀 胱癌细胞株 T24 中克隆出的转化基因为 c-H-ras 癌基因；与正常的 C-H-ras 原癌基因编码顺序的差 异，仅是第 35 个核苷酸由 G 变成了 T。因此，C-H-ras 编码的 p21 蛋白第 12 位氨基酸由甘氨酸变 成了缬氨酸，细胞因此获得了转化能力。这种改变与多种癌的因果关系已经查出。如乳腺癌、肺癌、 肝癌、结肠癌、急性髓性白血病、神经母细胞瘤等癌瘤细胞中均发现了 ras 原癌基因的点突变。 2 2基因重排基因重排 6 原癌基因中某一部分从一个位置移到另一位置可改变原癌基因的结构，使原癌基因激活，这种 改变称为基因重排。对 trk 癌基因与大肠癌、乳癌、乳头状甲状腺癌的发生关系研究证明即是基因 重排的结果。在大肠癌、甲状腺肿瘤中，可以发现 trk 激酶区的结构未变，而 trk 蛋白的膜外部分 或是易位改变或是发生了替换。基因重排使 trk 原癌基因变成具有转化活性的癌基因。90的人慢 性粒细胞白血病中也发现 Cabl 原癌基因的易位。 3 3基因扩增基因扩增 某些原癌基因复制时可以由一个拷贝而转变为多个拷贝。原癌基因拷贝数的增加会导致基因产 物的增加，从而引起细胞正常功能的紊乱。在神经母细胞瘤、小细胞肺癌、网织细胞瘤中均可见到 N-myc 基因的扩增。 原癌基因的激活，导致细胞的生长调控异常和癌变。在一个癌瘤细胞中，一般不止存在一种原 癌基因的激活。多个原癌基因在肿瘤发生的多个阶段上，相继或同时被激活。目前认为，在癌变过 程中至少有 2 类原癌基因被激活才能完成癌变过程。一类是使细胞产生不死性的癌基因，这类癌基 因通常分布于细胞核中，如 myc 癌基因等；另一类是细胞迅速增殖，细胞表面形态和功能改变的癌 基因，这类癌基因通常分布于细胞质中，如 ras 癌基因，在致癌过程中 myc 和 ras 癌基因互补才能 使细胞恶变。总之，原癌基因的激活引起癌基因的高表达影响细胞的增殖分化。正常细胞将在增殖 速度和功能分化方面发生改变。因此，一个正常细胞就会变成一个转化细胞和癌细胞。 4 4缺失缺失 基因的缺失也是基因失活或激活的一个重要方式。缺失可发生于一二个碱基，也可以发生基因 的一部分缺失。缺失可能是肿瘤产生的原因，也可能是细胞恶性转化后的结果。从染色体 5q、13q、17q、18q 等位点所克隆出的抑癌基因，均有抑制细胞转化和肿瘤发展的功能。但它们的 缺失，往往会导致肿瘤的形成。染色体的缺失，也可能是细胞转化过程中遗传不稳定性的结果。 DNA 在外界因素作用下可以发生突变。如果 DNA 修复功能不佳，细胞就会通过已经突变的基因遗传 给子代，获得突变基因的子代细胞最终形成肿瘤。这种基因缺失也可视为肿瘤产生的结果，缺失在 抑癌基因失活中表现的尤为重要。 第五节第五节 抑癌基因抑癌基因 一、概述一、概述 1983 年，Benedict 等人对散发型和遗传型视网膜细胞瘤的基因突变进行了分析，发现突变发 生在位于 13 号染色体臂 1 区 4 带（13q14）的 Rb 基因上。Rb 基因丢失或失活，就会失去抑制细胞 恶变的能力。 Rb 基因是世界上第一个克隆出的完成全序列测定的抑癌基因。Rb 基因的发现也使肿瘤学进入 到了以抑癌基因为标志的新时代。 二、种类二、种类 从基因克隆、抑癌基因突变、抑癌基因产物的性质和功能，到它们与肿瘤发生的关系等方面的 7 研究，都取得了较大进展。新的抑癌基因不断地发现，使抑癌基因研究成了现代肿瘤学研究的主旋 律。什么是抑癌基因？从概念上讲，凡能产生直接或间接抑制细胞增殖、癌变的肿瘤抑制基因即为 抑癌基因。 按抑癌基因的功能进行分类，据此把抑癌基因分为两大类：抑癌基因产物与癌基因产物直接 作用；抑癌基因对癌基因的表达起负调节作用，包括转录和转录后（表 6-4） 。 三、抑癌基因产物的作用机制三、抑癌基因产物的作用机制 1.Rb 基因产物 Rb 基因编码的 105 ku 的 pRb 蛋白为核内磷酸化蛋白。在细胞周期的不同时相中 pRb 的状态不 同。在 G1 期 pRb 处于低磷酸化状态；当细胞开始向 S 期转化时，pRb 的磷酸化急剧增加并持续到 G2 期和 M 期，之后又回到 G1 期低磷酸化状态。pRb 可以和细胞转录因子 E2F 结合，这种结合可以 参与细胞从 G1 期向 s 期过渡的调节。大 T 抗原和 E1A、E7 蛋白可以与 E2F 竞争性地对 pRb 结合， 从而阻断细胞从 G1 期向 S 期的过渡，因此认为，pRb 对 Go 和 G1 期细胞起负调节作用。 表表 5-4 抑癌基因的分类抑癌基因的分类 抑癌基因 对细胞生长的负调节 抑癌基因产物与癌基因 不可逆地终止增殖 产物直接作用 核内（例如 p53、Rb、erbA） 细胞生长静止 细胞浆（例如 NF-1、K-rer-1） 终止分化 抑癌基因对癌基因的表达起负 衰老 调节，包括转录或转录后 坏死 可逆地终止生长 外来的（可溶性生长抑制剂） 内在的（阻断信息传递或细胞周期） 表表 5-5 主要抑癌基因的性质和功能主要抑癌基因的性质和功能 名称 功能 分子质量或氨基酸 Rb 细胞周期蛋白 105 ku P53 核内转录因子 53 ku WT-1 DNA 结合蛋白 345 aa DCC 受体 190 ku MCC 受体 829 aa erbA 核内激素受体 ？ 8 2p53 基因产物 p53 基因编码的 p53 蛋白是一个 53 ku 的核内转录因子蛋白。过去将 p53 列为癌基因是由于它 可以与 ras 基因共同转化大鼠原代细胞，后来才发现过去用来做实验的 p53 基因是突变型的 p53 基 因。而野生型的 p53 基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。p53 的作用特点是它以四聚体形式与 DNA 结合来调节基因表达，四聚体中任何一个单体突变就不能使四聚体与 DNA 结合。最近的研究表 明，p53 对细胞周期也发生影响。在 2 个 p53 等位基因均受损的细胞接受离子辐射或某些药物时， p53 基因会发生突变。这些 p53 基因突变的细胞会进入 S 期。而含野生型 p53 基因的细胞在接受上 述刺激后，p53 表达升高，细胞周期停止在 G1 期，从而使细胞有足够的时间进行受损 DNA 的修复。 如果受损的 DNA 能够被修复，细胞就进入 S 期。如果受损 DNA 不能被修复，细胞就会进入程序化死 亡。由此可见，野生型 p53 发挥着细胞周期调节的功能。有报告说，野生型 p53 是通过 GADD 基因 对细胞周期调节的。野生型 p53 基因可通过与 DNA 上的早启动因子结合，从而启动下游 CAT 报告基 因的表达。突变型的 p53 不能启动报告基因的表达。在 p53 基因信号传递下游还存在 mdm-2 基因， 这个基因编码一个 p90 蛋白，p90 蛋白与野生型 p53 蛋白结合，可解除 p53 介导的 G1 期细胞停滞。 3.WT-1 基因产物 WT-1 基因编码着一个由 345 个氨基酸组成的 DNA 结合蛋白。WT-1 蛋白与 EGR-1 的 DNA 结合蛋 白相似，它具有同样的 DNA 结合序列。EGR-1 接受血清因子刺激可迅速表达，并激活细胞增殖。若 WT-1 蛋白与特定的 DNA 序列结合后，就阻止了 EGR-1 对 DNA 的结合，从而抑制了 EGR-1 对转录的 激活作用，WT-1 蛋白即是以此对细胞生长进行抑制的。 4.DCC 基因产物 DCC 基因，编码着一个分子质量为 190 ku 的跨膜磷酸化蛋白。DCC 蛋白是一个细胞豫中的信号 传递受体。已经发现多发性息肉结肠癌中存在着 DCC 基因的缺失，这种缺失可能使细胞获得生长优 势。DCC 蛋白与一种细胞粘附分子的结构非常相似，细胞间正常粘附作用的丢失可导致肿瘤细胞的 扩散和转移。DCC 蛋白可能在恢复细胞的黏附作用上破挥作用。 5.MCC 基因产物 MCC 基因编码一个含有 829 个氨基酸的蛋白质，部分序列与 G 蛋白结合的一种受体相似。在散发 型直肠癌中可以检出 MCC 基因的错义突变。MCC 蛋白可能代替 G 蛋白受体与 G 蛋白结合来改变或阻 止信号的传递。 6.erbA 基因产物 从一种禽类成红细胞增多症病毒株 AEV-ES4/R 中，发现了 2 种病毒基因：一种叫 V-erbB；另 一种为 V-erbA。V-erbB 和 V-erbA 有相反的功能。V-erbB 可以促进细胞转化，而 V-erbA 可以阻止 细胞进入终末分化而停留在高度增殖的未成熟状态。有人把 V-erbB 归为癌基因类，把 V-erbA 归为 抑癌基因类。1986 年证实 C-erbA 是一种高亲合性甲状腺受体基因。erbA 蛋白可与 DNA 结合，羧基 端可与激素结合。甲状腺素正是通过与 C-erbA 蛋白结合对转录造成影响进而对体内的糖代谢、脂 代谢以及中枢神经系统发育产生作用，但确切的作用机制尚不清楚。 9 四、抑癌基因与肿瘤四、抑癌基因与肿瘤 细胞癌变是一个复杂的过程。单从癌基因和抑癌基因的大量研究结果看，这个过程应包括癌基 因的激活和抑癌基因的失活。在结肠癌中，可以发现癌基因 K-ras 的点突变、18 号染色体长臂上 抑癌基因 DCC 的丢失、17 号染色体短臂上 p53 基因的突变或丢失。在乳癌中也可以见到 C-erbB-2 和 C-myc 癌基因的扩增和高表达，同时也可看到 p53 基因突变和丢失以及 Rb 基因的丢失。在肺癌 中可以发现 C-myc、N-myc 的扩增和过量表达，同时也有 p53 基因、Rb 基因的改变。在胶质细胞瘤 中也可见到 erbB-1、C-myc、neu/erbB-2、N-myc、ros、sis 等癌基因的激活，也可以看到 p53 基 因的突变。在胃癌中，同样可以看到 H-ras 点突变、C-myc 扩增和 hst 重排，同时也存在 p53 基因 的点突变。这些研究结果都证明了癌基因激活和抑癌基因失活是肿瘤发生的重要原因。 第六节第六节 生长因子与肿瘤生长因子与肿瘤 一、生长因子概念一、生长因子概念 生长因子是一类与细胞受体结合，具有调节细胞生长作用的生物多肽分子。生长因子最初由它 们具有促进细胞增殖的作用而得名，所以在很长时间内，正性促进细胞生长成为生长因子的基本属 性。随着具有抑制细胞增殖的“负性生长因子”的发现，扩展了生长因子的范围。生长因子既包括 促进细胞生长的多肽分子，也包括抑制细胞生长的多肽分子。在细胞生长繁殖过程中，生长因子的 促进和抑制总是成对或配套地发挥作用。生长因对细胞的生长调节作用只有在与细胞膜上的受体结 合后，触发一系列细胞内信号的传导，激活或抑制不同基因的表达，才能影响细胞的增殖或分化。 如果生长因子、受体及信号传导途径发生异常，就可能导致组织发育异常和一系列包括肿瘤在内的 慢性疾病的发生。因此，生长因子与肿瘤发生的关系研究受到了人们的高度重视。 二、生长因子的分泌和种类二、生长因子的分泌和种类 10 三、作用机制三、作用机制 生长因子对细胞增殖的调控作用，主要由以下几个过程来实现：生长因子与受体结合；受 体的酪氨酸激酶(TPK)活性被激活；激活的酪氨酸激酶(TPK)进一步激活其他信号传递体系，如磷 酸酯酶 C、三磷酸肌醇(IP3)、1，2-二乙酰甘油(DG)、G 蛋白、cAMP 和蛋白激酶 C(PKC)等；磷酸 化的蛋白作用于转录因子启动与细胞增殖有关的基因转录；转录出 mRNA 并合成各种细胞生长繁 殖所需要的多肽或蛋白质(图 5-6)。 11 1. 结合 生长因子作用的第一步是它必须与细胞膜上的特异受体结合。 2. 激活 生长因子结合膜上受体后的第一个细胞内反应是受体 TPK 活性的出现。 3. 细胞内信号传递的启动 无论细胞外的信号以何种方式进入细胞内，它们都必须将细胞外信号经细胞内的信号传递系统 加以传递并引起细胞内的多种蛋白质的活性变化才能最终影响到细胞的生长、增殖、分裂、分化。 四、生长因子与肿瘤发生四、生长因子与肿瘤发生 生长因子调控细胞的增殖、分化，维持组织和细胞有序的生长发育。如果这种调控失去功能或 失去平衡，细胞的增生和分化过程就会出现不协调，由此就可能产生肿瘤。生长因子具有潜在的致 癌作用的观念受到了普遍的重视。一般认为，生长因子潜在的致癌作用主要与肿瘤在体内发生和发 展中的一些步骤相联系。第一步往往发生在生长因子对细胞的正常生长和分化控制的异常上；第二 步是在细胞失常增生基础上继续受到刺激，生长因子分泌水平增高，分化的和未分化的细胞和肿瘤 细胞均快速生长；第三步是细胞产生刺激邻近细胞增生的因子，尤其是产生诱导附近血管增生因子， 促使肿瘤组织血管化，使肿瘤能够获得足够的营养生长繁殖，并可方便地使肿瘤细胞随血管向作身 转移。生长因子参与肿瘤的发生、发展，是其功能的体现。近年来，对生长因子调控异常的研究， 发现生长因子对细胞正常生长和分化控制的异常来源于 3 个方面：一是生长因子分泌的异常；二是 正负生长因子的调控异常；三是生长因子及其受体的基因突变。这些研究结果进一步丰富了生长因 子潜在的致癌作用的内涵。 配基 (Lig) 12 第七节第七节 肿瘤的发生是多病因、多基因和多阶段肿瘤的发生是多病因、多基因和多阶段 肿瘤分子生物学研究的大量事实表明，肿瘤是基因疾病。肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基 因共同作用的结果，在前几节中，已介绍了 DNA 损伤与与修复、生长因子、癌基因、抑癌基因参与 肿瘤发生过程不同侧面的状况，但是肿瘤发生的全过程是一个多基因参与的复杂的演变过程。在某 一肿瘤发生的某一阶段，某个基因可能发挥重要作用，但就肿瘤发生的全过程而言，很少由一种基 因的作用就能引起肿瘤。由于肿瘤的发生是众多基因参与的结果，所以有人提出了“肿瘤相关基因” 的观念。与一个正常细胞转变为肿瘤细胞过程相关的基因(简称参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因)， 主要有代谢基因、修复基因、癌基因、抑癌基因等。而从一个肿瘤细胞发展成肿瘤过程的相关基因 (简称参与肿瘤发展的肿瘤相关基因)，主要有肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等，它们在肿瘤的 发生、发展过程中发挥着重要作用。然而肿瘤发生和发展这两个过程并不是完全独立存在的，而仅 仅是作者叙述的方便。 一、参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因一、参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因 13 从一个正常细胞转变为肿瘤细胞的过程，是一个多基因参与的过程。由于不同的致癌因素，如 化学、物理和病毒因素对基因的作用方式不同，参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因亦不尽相同。 1化学因素致癌过程中的肿瘤相关基因 化学因素致癌过程，主要包括代谢活化、基因损伤、加成物形成、修复失败、癌基因激活、抑 癌基因失活、细胞转化、突变细胞产生等阶段。在这些阶段中，有代谢基因、修复基因、癌基因、 抑癌基因等基因的共同参与。化学因素致癌过程和参与化学因素致癌的肿瘤相关基因及作用方式， 列于图 5-9 中。 2. 物理因素致癌过程中的肿瘤相关基因 物理因素致癌的过程与化学致癌过程不同的是物理致癌因素致癌过程不需要经过代谢活化过程。 物理因素可直接损伤 DNA，引起 DNA 断裂、缺失，形成碱基二聚体等。因此，参与物理因素致癌的 肿瘤相关基因与参与化学因素致癌的肿瘤相关基因有所不同。物理因素致癌过程和参与物理因