脑缺血模型的建立及预算

脑缺血模型实验的建立脑缺血模型实验的建立 1.1.小鼠急性脑缺血模型的建立小鼠急性脑缺血模型的建立1,2 1.1 方法：昆明小鼠，60 只，雌雄各半，分成 6 组每组 10 只。分别为模型组,假手术组,阳 性对照组，受试药高、中、低剂量组。阳性对照组每天腹腔注射舒血宁注射液 52mlkg， 假手术组及模型组腹腔注射等剂量的生理盐水，受试药高、中、低剂量组分别腹腔注射等量的 相应药物，连续给药 5d。于末次给药 30min 后各组小鼠用乙醚麻醉，暴露双侧颈总动脉及 迷走神经，并用细手术线结扎该动脉及神经缝合皮肤假手术组除不结扎血管神经外均同于 受试药组。小鼠结扎 10min 后立即断头取脑（保留大脑及间脑） ，称重。用 4生理盐水冲 洗并用 4生理盐水制成 10的脑组织匀浆（约取 0.1 或 0.3g） 。此匀浆液 43000rmin 离心 10min，取其上清液。 1.2 观察指标：（脑指数=脑湿重/体重 100%） 、小鼠脑组织匀浆中 LDH、SOD、MDA 活性和 Ca2=-ATPase、Na=-K=- ATPase 的含量。 2 2线栓法建立线栓法建立 MCAOMCAO 脑缺血模型的建立脑缺血模型的建立3,4 3,4 2.1 方法：SD 大鼠 120 只，雄性，分成 6 组每组 20 只。分别为模型组,假手术组,阳性对照 组，受试药高、中、低剂量组。阳性药物组及受试药物组每天腹腔注射(ip)给药 1 次连续给 药 3d，术后持续给药 3d 后处死。假手术组及模型组术前 3d 及术后 3d 给予腹腔注射生理盐水。 MCAO 脑缺血模型制备：各组大鼠用 10%水合氯醛（0.4-0.5ml/100g）腹腔注射麻醉，大鼠固定 于手术台上，颈部正中作 2cm 长切口，逐层暴露左侧颈总动脉（CCA） 、颈内动脉（ICA） 、颈外 动脉（ECA） 。在 ECA 深面穿二条细线，近心端打一活结，并推向 ECA 根部，远心端结扎 ECA 及 其分支，分离 ICA 主干至翼腭动脉（PPA） ，并在其根部小心结扎 PPA，同时夹闭 CCA，在 ECA 残端剪 0.2mm 小口，然后将用浓度为 2.4106/L 肝素钠溶液浸泡好的栓线（4-0 尼龙线）插 入，轻推尼龙线尾端经 CCA 分叉部沿 ICA 入颅，至大脑前动脉（ACA） （约 1920mm） ，再往回 拉约 2mm 即至大脑中动脉口，以阻断大脑中动脉（MCA）及颅内反流来源的血流。尼龙线插入 深度由分叉部计 18.50.5mm，固定栓线，松开动脉夹，扎紧切口处之备线，缝合。假下术组 除不插入栓线外均与受拭药组相同。 2.2 指标： 2.2.1 神经症状行为学检测 待动物清醒 24 小时后，根据 Zea Longa 评分方法评定大鼠行为，满分为 5 分，分数越高， 动物行为障碍越严重。0 分-活动正常，1 分-不能完全伸展对侧前肢，2 分-向对侧行走，3 分-向对侧转圈或追尾状，4 分-不能自主行走，意识丧失。1-3 分间认为造模成功。 2.2.2 大鼠脑 TTC 染色及脑梗死面积的测定 于末次给药后，将大鼠立即断头取脑，去除小脑和低位脑干，在前联合处将脑组织行冠 状切片，间隔 4 mm，共 5 片，放入 2TTC 磷酸盐缓冲液(pH74)37水浴 10 min。正常 脑组织呈深红色，梗死脑组织呈白色。将每片组织照相，选择每一切面的尾侧面，应用 BI2000 软件处理系统计算各部分面积，以各片非染色区面积之和与各片脑组织面积之和的 百分比计算脑梗死范围。 2.2.3 大鼠脑缺血生化指标的检测 于末次给药后，麻醉后，腹主动脉取血 6-8ml,43000rrain 离心 10min，取其上清液,按 照说明书操作，测定大鼠血清中的 LDH、CK、S0D、MDA、NO 的含量。 2.2.4 脑含水量的测定 每组另取 10 只大鼠，于末次给药后，将大鼠立即断头取脑，称重，后放入烘箱将其烘干并 再次称重。计算大鼠脑含水量：含水量()= (湿重一干重)湿重100。 2.2.5 脑组织中谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)的含量测定 每组另取 10 只大鼠，于末次给药后，将大鼠立即断头取脑。取右侧(缺血侧)脑组织，精确 称取 100mg 置匀浆器中，加适量 90乙醇溶液匀浆 3min，倒入离心管，1000rmin 离心 10min，取上清液，将残留物重复匀浆 2 次，合并上清液。将上清液在 80水浴中蒸干，用 01molLHC1 定容至 5ml。1000rmin 离心 10min，上清液经 045m 滤膜过滤，待测。采 用高效液相色谱仪检测氨基酸：谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)，结果以 mgg 湿脑组织表示。 色谱条件：HypersilODS 色谱柱40mmx125mm粒径 5m；流动相(A)： 10molLNa2HPO4pH7.2 缓冲液(PB)；流动相(B)：PB 一甲醇一乙腈(50：35：15)。线性梯度： 在 025min 内，流动相 B 以线性从 0 上升到 100。流量：10mlmin 柱温 40。检测波 长：激发波长 340nm，发射波长 450nm。 标准溶液准确称量氨基酸对照品后,用 0.1molLHC1 溶液溶解并稀释配成含每种氨基酸 20、50、100、150、200、250、300nmolml 的系列混合标准溶液。 3.3.大鼠血瘀型脑缺血动物模型大鼠血瘀型脑缺血动物模型5,6 5,6 3.1 方法：Wistar 大鼠，60 只,雄性,体重 250300g，分组及给药方法同上，末次给药后， 制备血瘀模型。其方法是：皮下注射 01%的肾上腺素 07mLkg-1，共 2 次，间隔 4h，并在 此二次间(前后各 2h)分别将大鼠浸入冰水中 5min。然后动物禁食不禁水 12h，次晨动物给予 腹腔注射水合氯醛 350 mgkg 麻醉，腹主动脉取血 2.7mL，4ml。 3.2 指标：其中 2.7ml 的肝素抗凝，离心，分离富血小板血浆、贫血小板血浆，置血小板 凝聚仪上测定 ADP 诱导的血小板最大聚集率(MPAG)。4mL 的血液置血液黏度计上测定全血粘度 (P)和不同切变率(B)。 2、预算： 1.小鼠急性脑缺血模型（约 1 万） 小鼠 60 只：500 元 LDH、SOD、MDA、2=- Na=-ATPase、Na=-K=- ATPase 共 5 个试剂盒：7500 元 2线栓法建立 MCAO 脑缺血模型(约 2 万) 大鼠 180 只：5400 元 LDH、CK、S0D、MDA、NO 共 5 个试剂盒：7500 元 氨基酸标准品：1000 元 测脑梗死面积：5000 元（待定） 3. 大鼠血瘀型脑缺血动物模型（约 5000） 参考文献：参考文献： 2张雷,邓同乐,严伟民,郑筱祥等. 上海中医药杂志J.2004,38(8):55-57 3辛世萌,刘远洪,聂志书挂或长度、直径覆太鼠体重与栓践法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究大连医科大学学报 J2000，21(2)：4549 4 刘瑛琳.