自动生化分析仪自动识别免疫比浊分析中的钩状效应

自动生化分析仪自动识别免疫比浊分析中的钩状效应自动生化分析仪自动识别免疫比浊分析中的钩状效应 【提 要】 目的 探讨全自动生化分析仪上识别钩状效应的方法.方 法 以 IgG 为检 测对象，在 HITACHI-7170A 型全自动生化分析仪上，抗原抗体反应 10 分钟，利用定时监 测-时间反应进程曲线，分析其变化特征，选择钩状效应的识别参数 .结果 以反应时间 (读点)20 点的反应完成率(ABS20/ABS34)0.9 0 为限额参数，可自动识别钩状效应.结论? 免疫比浊测定分析中 的钩状效 应，可通过正确的参数设置自动识别.时间反应进程曲线 是识别钩状效应的基础， 反应率是识别钩状效应的有效方法. 【关键词】 免疫 比浊法 钩状效应 抗原 抗体 中图分类号 R 392-33 文献标识码 A 文章编号 1008- 634X(2000)04-0252-03 AutomaticAutomatic CheckCheck MethodMethod ofof HookHook EffectEffect inin thethe ImmunoassayImmunoassay withwith AutomaticAutomatic ClinicalClinical ChemistryChemistry AnalysisAnalysis LIU Zhong-min GAO Yue-ting CHEN Tao （Department of Laboratory,First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College ,Guangzhou 510120 China） 【Abstract】 Objective To obtain automatic checck method of hook effec t in the turbibimetric immunoassay with automatic clinical chemistry analysis.Methods With model 7170A automatic clinical chemistry analyzer，the method and value of automatic check o f hook effect was obtained by assaying absorbance of immune complexes produced by which IgG of different concentratoin reacted with antibody for 10 minutes and t raced the relationship between the quantity of antigen and absorbance,and by an alyz ing charactreistics of reaction monitor curve of immunofraction and tracing the relationship between the quantity of antigen and hook efect,and by calculating c heck value of the hook effect.Results The hook effect could be detected by aut omatic clinical analyzer if value,reaction rate of the 20th measurement point(AB S20/ABS34),was lower than 0.9.Conclusions The c heck of ho ok effect in immunoreaction were performed by setting correctly limited value.R eaction monitor curve of immunoreaction was the basis of check of hook ef fect.T he comparison of reaction was a kind of effective method of the check of hoo k effect. 【Key Words】 Immunoassay; Turbibimetric; Hook effect; Ant igen; Amtibody 免疫测定是利用抗原抗体反应检测标本中微量物质的方法.基于抗原抗体反应的敏 感性和 特异性，免疫测定的范围遍及医学检验的各个领域.任何物质只要能获得相应的 特 异性 抗体，即可用免疫测定进行检测.抗原抗体反应是按一定的分子比例结合，当二 者 比例适中 时，形成的免疫反应最强烈；当抗原或抗体过量时，免疫反应都将减弱1. 因此 ，在自动生化分析仪上，正确判断抗原抗体反应体系中抗原与抗体的比例状态， 识别钩状效 应(hook effect)是否存在，直接关系到物质测定的准确性.本文以 IgG 为例， 在全 自动生 化分析仪上，探讨利用定时监测-时间反应进程曲线的变化特征，正确设置 自动识别钩状效 应参数的方法. 1 1 材料与方法材料与方法 1.1 参考物 免疫比浊法测定用 C.f.a.s 特种蛋白定标液，批号：194613041355279 ，德国 Boehringer Mannheim 公司产品，IgG 参考定标值 20.6g/L. 1.2 试剂 全液体 IgG 免疫比浊法测定试剂盒，上海玉兰生物技术研究所生产. 1.3 仪器 HITACHI 7170A 型自动生化分析仪，日本 Hitachi 公司生产. 1.4 方法 免疫透射比浊法，自编测定程序. 1.5 主要参数 Cali.type:logit-log4P;Cali.Poin t:6;STD1 CONC.:0.00;STD2-6 CONC.:assigned value;Temperture：37;Reac tion time:10min;Assaymode:2Point End;Assay Point:134;Wave(Sub/Main):700/340;Sa mple Vol(l):5-10- 195;Reagent Vol:250;Unit:g/L;Expected Value:8.016.0;Inst BFQ. Factor:1.0;Technical Limit:0.13.0;SD Limit:0.1;Duplicate Limit:10 0;ABS.Limit:12000 2 2 结果与讨论结果与讨论 2.1 剂量反应曲线与钩状效应分析 采用稀释和增加样本(抗原)用量的方法，获得一系 列 IgG 浓度值为 0、2.06、4.12、6.18 、8.24、10.3、20.6、30.9、41.2、51.5、103.0、154.5、206.0、257.5、309 .0、360.5、412.0、463.5、515.0、566.5、618.0、669.5g/L 的溶液，用免疫透射 比浊 法测定抗原抗体反应免疫复合物的生成量.以 IgG 浓度为横坐标，吸光度值 ABS 为纵坐标 绘制 IgG 剂量反应曲线图，结果(见图 1). 图 1 IgG 剂量反应曲线图 Fig.1 IgG dose-effect relation curve 从图 1 可以看出，免疫透射比浊测定 IgG 的剂量反应曲线是一条双相反应曲线，即 在恒定剂量 的抗体溶液中加入不同剂量的抗原时，免疫复合物的生成量起初随抗原剂量 的增加而增加 ；当达到峰值后，生成量随着抗原剂量的进一步增加反而减少.抗原抗体 反应这一 独 特的现象可以用著名的“Heidel berger 曲线”来描述2.曲线左侧为 抗 体过剩 的测定区又称为前带，中间为抗体抗原浓度大致相等的等当量区又称为等价带， 右侧为抗原 过剩区又称为后带.当抗原抗体比例由抗体过剩到抗原过剩时，免疫复合物 的生成 量由上 升到下降，剂量反应曲线呈钩状的现象，即为钩状效应.高剂量钩状效应 使强阳性 标本误测 为弱阳性，以至假阴性结果.因此，高剂量钩状效应是免疫比浊测定 中必须重视的 问题. 2.2 时间反应进程曲线与反应率分析 以 IgG 剂量反应曲线的拐点(顶点)为界，测定拐 点 左侧抗体过剩区和拐点右侧抗原过剩区抗 原抗体反应 10 分钟，34 个读点的吸光度值， 绘制成时间反应进程曲线，观察不同的 IgG 浓度 值标本的吸光度值随时间变化的特征， 结果(见图 2 和图 3). 图 2 抗体过剩时的时间反应进程曲线 Fig.2 Antibodyexcess zone reaction monitor curve 图 3 抗原过剩时的时间反应进程曲线 Fig.3 Antigenexcess zone reaction Monitor curve 由于 7170A 型全自动生化分析仪的程序设置可分别在 0、5、16、33 读点加试剂，故 以这些点 表述时间反应进程曲线的特征.由图 2 可知，由于抗体过剩，5、16、33 读点的 吸光 度值随抗原浓度增加而增加；其中， 5 点之内的吸光度值增加迅速，16 点时反应 完成率(ABS16/ABS34)较高，其后的 反应线较平直.而在图 3 中，由于抗原过量，使抗原抗 体反应比例失调，免疫反应 减弱，5、 16、33 点值随抗原浓度增加而降低；其中，5 点 之内的吸光度值增加减缓，16 点的反应完成 率也逐渐下降.与图 2 比较，反应曲线有明 显变化，曲线前段逐渐变得平坦，曲线 后段向上 延伸明显.由此可见，抗原过量时反应 完成率下降，是测定过程中出现假性低值、 影响临床 对病情诊断的原因.正确认识和理 解钩状效应前后时间反应进程曲线的变化特点， 是正确识别钩状效应是否存在的基础和 方法. 2.3 检查钩状效应的方法选择 比较图 2、图 3 时间反应进程曲线可以看出，抗体过剩 区内，不同 IgG 浓度值的抗原抗体快速 反应期的反应速率(A=ABSx+1-ABSx,X5)和各 个读点的反应完成率(ABSx/ABS 34)均较抗原过剩区高.因此，可用计算快速反应期反应速 率或反应完成率的 方 法判断钩状效应.但由于计算反应完成率法较计算反应速度法更简 单、有效，故建 议采用计算反应完成率法. 2.4 检查钩状效应时间读点的选择 分别选取剂量反应曲线拐点左侧区内 IgG 浓度值为 2.06、4.12、6.18、8.24、10.3、20 .6、30.9、41.2、51.5、103.0g/L 的溶液，反应时 间 10min.由低到高分别求 出不同 IgG 浓度值的 34 个读点的反应完成率(ABSx/ABS34). 通过分析图 2 和计算的各读点反应完成率发现，不同 IgG 浓度值的反应完成率均随 反应时间的 增加而增加；但在相同反应时间时，反应完成率有明显差异，且 20 读点以 后的反应完成率均 0.90.这说明，虽然所有的反应时间点都可以作为钩状效应检查的时 间点，但如 果以反应完成率达到 0.90 为检查点，检查的时间点应以 20 读点为好. 2.5 检查钩状效应的限额参数计算 分别选取剂量反应曲线拐点左侧和右侧不同 IgG 浓 度值的溶液，反应时间 10min.由 低到高分 别求出不同 IgG 浓度值第 20 读点的反应完成 率.其反应完成率分别为：拐点左侧：0 .90、0 .92、0.92、0.91、0.93、0.94、0.94、0.95、0.94、0.92；拐点右侧：0.89、0 .86、0.81、0.78、0.75、0.73、0.70、0.68、0.65、0.67、0.69.由 此可见， 剂量反 应曲线拐点左侧不同 IgG 的浓度值的反应完成率均0.90；而拐点右侧不同 IgG 浓度 值 的反应完成率均0.89.因此，0.90 可作为自动别钩状效应的限额参数. 2.6 有效工作剂量范围的确定 由于抗原抗体剂量反应曲线不是直线，用确定直线线性 范围的方法，不适用于确定抗原抗体 免疫反应的有效工作剂量范围，较理想的方法是用 变异系数对分析物浓度绘制密 度图(又称 P-P 图)，用最低可接受的精密度确定工作范围 3，4.剂量 反应曲线 拐点左侧区内各浓度点的精密度图(见图 4).由图 4 可看出，IgG 的有效工作剂量范 围在 4.1241.2 之间.低于或高于此范围浓度的样品，必须加倍或稀 释后再测定 . 综上所述，抗原过量引起的钩状效应是免疫透射比浊测定中首先要解决好的问题. 用手工或 仪器对样本进行前稀释或使用双份标本或用蛋白质试纸预测等方法，也可解决 抗原过量问题 .但是，这些方法有时会导致抗原含量过低，造成抗体绝对过量，影响测 定结果的 准 确性，或增加工作量和试剂成本而使其应用受到限制.因此，对有条件的实 验室， 在全 自动生化分析仪上，应准确设置这些参数，自动识别钩状效应，以确保测 定结果的准确性. 图 4 IgG 测定精密度图 Fig.4 Precision curve of IgG measurement 刘忠民（广州医学院第一附属医院检验科 广州 510120） 高月亭（广州医学院第一附属医院检验科 广州 510120） 陈涛（广州医学院第一附属医院检验科 广州 510120） 参考文献参考文