药物对肺癌细胞的作用

2012-07-10 14:41 多西他赛与吉非替尼对人肺癌细胞的作用多西他赛与吉非替尼对人肺癌细胞的作用 来源： 多西他赛和吉非替尼均是晚期非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer, NSCLC) 的一线和二线治疗药物，日前两者疗效都达平台期。除寻找新的靶向治疗靶点外，如何进 一步提高化疗和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EG FR-TKIs)的疗效是晚期NSCLC面临的问 题。化疗药物与EGFR-TKIs作用的机制不同，理论上两者同时应用可能有增效作用。细胞学 研究显示，EG FR-TKIs联合化疗药物能明显增强对NSCLC细胞生长的抑制作用，起到 “1+12”的作用川。但是，多项大型临床研究INTACTl 2 ,INTACT23、TRIBUTE4和 TALENTS均显示EGFR-TKIs与化疗同时作用在有效率及生存期方面并未优于单独化疗，且无 疾病进展时间和疾病控制率未能提高。上述结果引发了两个问题:(1)对于EGFR-TKIs与化疗 同时使用是否一也存“优势人群” 了例如TRIBUTE研究中EGFR突变患者采用化疗联合厄洛 替尼的有效率显著高于野生型( 53 % vs. 18 % , P = 0. 012 ) ( 2 ) EGFR-TII与化 疗序贯应用是否具增效作用，序贯应用增效作用是否也存在“优势人群” 了日本的 WJTOG0203 III期临床试验证实，先化疗后序贯吉非替尼能够提高肺腺癌患者的总生存时间 6es。说明化疗联合EGFR-TKIs的增效作用不仅与用药顺序有关，还可能与NSCLC细胞EGFR 突变状况有关。因此，本研究的第一个日的是通过观察多西他赛和吉非替尼不同顺序用药 对EGFR野生型和EGFR突变型细胞生长的影响，寻找NSCLC细胞不同EGFR突变状况的最佳给药 方式。 化疗与EG FR-TKIs二者联合应用增效与否的细胞学机制不明。既往研究显示，化疗同 时应用EGFR-TKIs不增效的原因可能与细胞周期有关,H 化疗后序贯应用EGFR-TKIs产生协 同增效作用可能与EGFR磷酸化有关91。近年的研究表明胰岛素 样生长因子受体1( IGF-1 R)亦可通过细胞内信号蛋自PI3 K/AKT影响细胞对化疗及EG FR-TKIs敏感性i o-i i 。因此，本研究的第二个日的旨在通过检测多西他赛与吉非替尼 不同时序应用对EGFR野生型和突变型肺腺癌细胞的EGFR , IGF-1 R、下游信号蛋自表达磷 酸化影响及细胞周期变化，寻找可能的细胞学机制。 材料与方法 1. 1材料人肺腺癌A549细胞由中科院上海细胞生物研究所提供，PC-9细胞由日本国立 癌症中心小泉史明博士惠赠 z。四甲基偶氮哩盐3- ( 4 , 5-dime-thvlthiazol-2-vl) -2，5-diphenvl-tetrazolium bromide，MTT、二甲基亚矾( DMSO)购自Sigma公司。吉非 替尼和多西他赛分别由阿斯利康制药有限公司及江苏恒瑞公司提供，均溶于DMSO中，以5 x 10-3mo1/L-20保存。胞外调节蛋自激酶(ERI1/2)一抗、蛋自激酶B ( AKT)一抗、IGF-1 R一抗、内参(3-actin ) ,磷酸化表皮生长因子受体(p-EG FR)一抗、磷酸化蛋自激酶B ( p-AKT)一抗、磷酸化胰岛素样生长因子受体1( p-IGF-1 R)一抗以及p-ERKl /2均购自Cell Signa-ling公司，表皮生长因子受体(EGFR)一抗购自SantaCruz公司，兔源及鼠源二抗购自 Cell Signaling公司，BCA试剂盒购自Pirce公司。ECL化学发光试剂盒购自GE Healthcare 公司。DNA提取试剂盒购自天根生物公司。电泳仪及化学发光成像系统购自Bio-Rad公司， 酶联免疫检测仪购自Bioce112010公司。流式细胞检测盒购自碧云天公司，流式细胞仪购自 BeckmanCoulter公司。1. 2细胞培养人肺腺癌细胞A549和PC-9置于含10%胎牛血清的RPMI- 1640 ( Gibc。公司)培养 液，370a ,5% a02培养箱中培养，细胞单层贴壁生长。实验取用生长状态良好的对数 生长期细胞，胰酶消化传代，收集备用。 1. 3 A549 ,Pa-9细胞的EGFR和K-Ras基因突变检测将处于对数生长期的细胞，胰酶消 化，离心重悬后按基因组DNA提取试剂(TIANGEN)说明操作提取DNA。分别取A549,Pa-9细胞 DNA产物8闪进行电泳，1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。细胞EGFR及K-Ras突变检测送 苏州为真生物医药有限公司，采用高分辨率溶解曲线分析技术(quantitativePCR high- resolution melting,qPCR-HRM)完成。 1. 4四甲基偶氮哇盐( MTT)法检测药物对A549,Pa -9细胞生长作用影响取对数生长的 细胞，接种至96孔培养板，A549 100()个细胞，Pa-9 200()个。每组4个平行复孔，细胞贴 壁后，再按实验要求分别加人100闪含有不同浓度的多西他赛或吉非替尼的培养基，按实验 设计时间换含有不同药物的培养基。每孔加MTT 20,1(Sg/L)，孵育4h后弃上清，加人 150,1 DMSO，振荡15 min后酶标仪测定492 nm波长下各孔吸光值(A)，计算细胞抑制率和半 数抑制浓度(IaSO。实验分组:PBS对照组(a、多西他赛单独作用72h组(D)、吉非替尼单独 作用72h组( G) ,多西他赛作用24h序贯吉非替尼48h组( DG)、吉非替尼作用48h序贯多西他 赛作用24h组(GD)和同时给药72h组(D+G)，实验重复3次。抑制率=100%一(用药组A值一空自 对照A值)/(阴性对照组A值一空自对照A值)。 1. 5 Western hlottin。检测细胞信号蛋白细胞按上述分组给药处理后，将原培养 基连同胰酶消化下的细胞离心，冷PBS洗涤3次，加人含有蛋自酶抑制剂和磷酸化蛋自酶抑 制剂的裂解液，冰上提取蛋自，BCA法测定蛋自浓度，等量上样，10% SDS-PAGE电泳，转 膜，5%牛血清自蛋自封闭2h，一抗(1:40()一1000 ) 4 0C摇床孵育过夜，TBST洗膜lOmin x3次，二抗(1 : 2000)室温摇床孵育1h, TBST洗膜l Omin x 3次，ECL显色后化学发光成像 系统成像。 以Band Scan图像分析软件进行A值分析。 1. 6流式细胞术检测细胞周期变化取生长状态良好的对数生长期A549细胞及PC-9细胞 接种于30cm2的培养皿中。A549接种1 x 10个，PC -9接种2x10个。按上述分组给药，消化， 收集细胞，制成单细胞悬液，用碧云天流式细胞试剂盒提取和DNA染色，流式细胞仪测细胞 周期，Ce11Fit软件进行细胞周期分布的测定;实验重复3次。 1.7统计学分析采用SPSS 13. 0软件分析，数据用均数士标准差表示，多组间计量资料 用单因素方差分析。以P 0. OS为差异具有统计学意义。 2结果 2. 1肺腺癌细胞EGFR和K-Ras基因表达采用qPCR-HRM对人肺腺癌A549 , PC-9细胞的 EGFR基因18,19,20,21外显子和K-Ras基因2 ,3外显子进行突变检测。结果显示，A549细胞 的EGFR基因无突变，K-Ras基因第2外显子突变。PC-9细胞的EGFR基因第19外显子突变，K- Ras基因无突变。 2. 2多西他赛与吉非替尼对肺腺癌细胞生长的影响正常培养的两株肺腺癌细胞生长均 呈无限繁殖，A549细胞第2天进人对数生长期，PC-9细胞第3天进人对数生长期。多西他赛 和吉非替尼单药或联合用药均能抑制A549和PC-9细胞生长，呈浓度依赖性。多西他赛和吉 非替尼作用72h抑制A549细胞生长的ICS分)I为5. 24 x 10 - mol/L和1. 28 x 10- 5mo1/L(P 0. OS)，抑制PC-9细胞生长的ICS分别为2. 13x 1()一“mol/L和4. 58 x 1() 一“mol/L。见图 图1不同浓度吉非替尼和多西他赛对A549和PC-9细胞生长的影响分别取多西他赛和吉非 替尼的ICSc作为固定浓度，按上述分组方法研究不同给药方式下两药对A549和PC -9细胞 的抑制作用。结果显示，相比D,G组，DG组对A549和PC -9细胞的生长抑制作用均明显增强 (P 0.05)，抑制率分别为60. 0%和57.45% (D+G)组只对EGFR突变型的PC -9细胞的生长抑 制有增效作用，抑制率为53. 46%，较单药组明显增高(P 0.05);在EGFR野生型的A549细胞 中，(D+G)组的抑制率为48. 25 %，与D,G组无明显差异。而GD组对A549和PC-9细胞的抑制 率均无明显的协同增效作用，抑制率分别为46. 46%和46. 59 0o。 。见表1。) 2. 3多西他赛与吉非替尼不同时序应用对细胞EGFR,ERK,AKT, IGF-1 R表达及其磷酸化 的影响单药多西他赛增强A549和PC-9细胞EGFR和ERK磷酸化，单药吉非替尼抑制A549和PC-9 细胞EGFR和ERK磷酸化，多西他赛诱导EGFR和ERK磷酸化被序贯应用吉非替尼显著抑制，但 不能被同时应用吉非替尼抑制。吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用不能被应用多西他赛逆 转。多西他赛与吉非替尼不同时序应用对A549和PC -9细胞的AKT及其磷酸化均无明显影响。 单药多西他赛抑制A549细胞IG F-1 R表达及其磷酸化，单药吉非替尼增强A549细胞IG F-1 R表达及其磷酸化。两药联合对PC-9细胞的IG F-1 R表达无影响，但均抑制IG F-1 R磷酸化。 两药同时应用对抑制PC-9的细胞IGF-1 R磷酸化具增强作用，对A549细胞IGF-1R磷酸化无明 显影响。见图2 2. 4多西他赛与吉非替尼不同应用对细胞周期的影响对于A549细胞，G组未引起明显的 细胞周期变化，D组可引起明显的G期阻滞，由C组的6. 63%上升为49.58%(P0.05) DG组 有明显的 图2吉非替尼和多西他赛同时及序贯应用对A549和PC-9细胞信号蛋白表达的影响GZ期阻 滞，较C组上升约54.11%(P0.05) (D+G)组和GD组各期细胞无明显变化。对于PC -9细胞， G组可引起明显的G,/G，期阻滞，G,/G，期细胞较C组上升29.96% (P 0. OS) D组可 引起明显的GZ期阻滞，较C组上升30.13% (P0.05)DG组可见明显的G:期阻滞，较C组上升 40. 77 %(P0.05) (D+G)组和GD组与C组相比，细胞周期变化不明显，味/G，期细胞比例 提高13. 27%和17. 10%。见图3 3讨论 本研究结果显示，人肺腺癌细胞A549细胞为EGFR野生型，K-Ras基因突变型;PC-9细胞 为EG-FR突变型，K-Ras基因野生型。细胞生长实验显示A549和PC-9细胞分别为吉非替尼耐 药型和敏感型，其ICSc分)I为1. 28 x 1()一5 mol/L和4. 58 X 1()一smol/L，对吉非替 尼的敏感性相差1000倍，结果与既往报道的一致3141。基于临床研究显示化疗与EG-FR- TKIs同时或序贯应用可能存在“优势人群” ，而这种“优势人群”可能源于EGFR突变状况， 我们同时选用EGFR野生型的A549细胞和EGFR突变型 的PC-9细胞进行研究并从细胞信号传导蛋自和细胞周期对其可能的细胞学机制进行探 讨。 Cappuzzo等 ISO报道的SATURN研究发现化疗联合EGFR-TKI增效作用与用药顺序相关， 先化疗再序贯EGFR-TKI能够提高有效率，延长无疾病进展期及肺腺癌患者总生存。本研究 结果发现，不论是EGFR野生型的A549细胞还是EGFR突变型的PC -9细胞，多西他赛序贯吉非 替尼对这两株人肺腺癌细胞生长的抑制作用都较单药多西他赛明显增强，两株细胞间无明 显差别，结果说明EGFR突变不 是化疗后序贯EGFR-TKI优势受益人群，与既往的研究一致。(Ciovannetti等6es在 细胞学实验基础上探讨化疗药物与吉非替尼以不同顺序作用于肺癌细胞的结果发现，不论 肺癌细胞是否存在EGFR突变，应用化疗药物后，只有细胞EGFR磷酸化(pEG-FR)水平增加者 才能从后续的吉非替尼治疗中获益，而与EGFR是否存在突变或扩增无关。新近的INFORM研 究亦发现化疗后吉非替尼维持治疗晚期NSCLC患者EGFR突变者无进展生存期(PFS)的获益最 大7es。Mok等psl报道在非选择人群中比较吉西他滨联合铂类+厄洛替尼与单纯吉西他滨 联合铂类化疗疗效的11期研究(FAST-ACT，发现化疗序贯EGFR-TKI能显著延长PFS(29.4周。 .23. 4周，P = 0. 002。是否延长总生存日前正在进行一项111期临床试验( FAST-ACT II) 加以证实。 本研究两药同时应用仅对EGFR突变型的PC-9细胞生长抑制有增效作用，对EGFR野生型 的A549细胞无增效作用，与既往的研究结果一致9， 6es。虽然有研究显示化疗与EGFR- TKI同时应用，其增效与否与EGFR突变状况有关，但日前临床研究的结果尚存争议。 TRIBUTE研究对患者组织学标本进行EGFR 18一21和K-Ras基因进行突变 检测，结果提示，EGFR突变的患者化疗联合厄洛替尼有效率显著高于野生型(53 % vs. 18 % , P =0. 012，但缺少与单药厄洛替尼的对比。INTACT试验对比了EGFR突变型与野生 型患者联合应用化疗和吉非替尼的疗效，结果显示不论在有效率还是总生存方面，两组患 者均无明显差异，因此认为仅凭EGFR突变与否预测化疗联合EGFR-TKI同时治疗的有效率是 不够的23es。 EGFR-TKI通过竞争性与EGFR结合，阻断其酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，主 要通过抑制PI3 K-AKT和MARK/ERK信号传导，实现抑制肿瘤细胞生长、加速细胞凋亡、抑制 血管生成和抑制浸润与转移。化疗联合EGFR-TKIs增效与否的细胞学机制不明，既往研究显 示化疗同时应用EGFR-TKIs不增效的发生机制可能与细胞周期有关,H 化疗后序贯应用 EGFR-TKIs产生协同增效作用可能与EGFR磷酸化有关6es。 本研究发现，不论A549细胞还是PC-9细胞，多西他赛增强EGFR和ERK磷酸化，而吉非替 尼呈抑制作用。先用多西他赛后序贯吉非替尼的EGFR和ERK磷酸化水平明显较多西他赛与吉 非替尼同时应用或单独应用多西他赛降低，这种EGFR和ERK磷酸化水平的变化不伴有EGFR和 ERK的增加，这一结果与我们先前在另一EGFR野生型的SPC-1 A细胞发现的一致ges，说 明化疗上调EGFR和 ERK磷酸化，使吉非替尼抑制EGFR及ERK敏感性增强，这是化疗序贯吉非 替尼的协同增效作用的细胞学机制之一。Van Schaeybroeck20和Giovan-netti 报道， 化疗与EGFR-TKI联合应用于不同的NSCLC细胞，只有细胞EGFR磷酸化(p-EGFR)水平增加者才 能从后续的吉非替尼治疗中获益，而与EGFR是否存在突变或扩增无关。此外，细胞周期 显示，多西他赛将两株细胞阻滞在Gz期，已知细胞在Gz/M期开始DNA损伤的修复和分裂。 因此，多西他赛序贯吉非替尼组使Gz/M期细胞显著增多，无法从影响细胞周期来解释这一 协同作用现象，结果与既往的研究一致 14-I S v 同时应用多西他赛与吉非替尼对EGFR野生型的A549细胞无增效作用。吉非替尼抑制 A549细胞EGFR和ERK磷酸化不能被同时应用的多西他赛逆转，这一结果与我们先前在另一 EGFR野生型的人肺腺癌SPC-A1细胞结果一致191，说明多西他赛未增强吉非替尼抑制细胞 生长作用可能与EGFR和ERK磷酸化水平低下有关。Van Schaeybroeck等zo报道在结直肠癌 细胞中，下调EGFR磷酸化水平能导致EG FR-TKI与细胞毒化疗药物产生拮抗作用。 同时应用多西他赛与吉非替尼对EGFR突变型的PC-9细胞生长抑制有增效作用。吉非替 尼抑制PC -9细胞EGFR和ERK磷酸化亦不能被同时应用的多西他赛逆转，因此，EGFR和ERK磷 酸化不是其增效机制。既往研究显示，IGF-1 R表达与细胞对化疗及EG FR-TKI、敏感性相 关21-221，干扰细胞IGF-1R表达或IGF-1 R抑制剂可以提高NSCLC细胞对化疗药物及EG FR- TKIs的敏感性，化疗药物如多西他赛诱导肿瘤细胞凋亡机制亦包括了对IGF-1 R的抑制，增 加化疗药物敏感性与抑制PI3 K/AKT关系密切lol。反之，EG FR-TKI、影响IGF-1 R表达 zz 本研究两株肺腺癌细胞均表达IGF-1 R,多西他赛与吉非替尼均抑制PC-9细胞IGF-1 R 磷酸化表达。与单药多西他赛或吉非替尼比，两药同时应用对PC -9的细胞IGF-1 R磷酸化 抑制有增强作用，但对A549细胞IGF-1 R磷酸化无明显影响。结果提示同时用药对EGFR突变 的PC -9细胞有增效作用，可能与其增强对IGF-1 R磷酸化抑制作用有关，日前我们正进行 上调或沉默IG F-1 R观察同时用药对EGFR突变的PC-9细胞是否具增效作用加以证实。 本研究应用吉非替尼序贯多西他赛对抑制A549细胞和PC -9细胞生长，均未产生增效作 用，鉴于吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用亦不能被序贯应用的多西他赛逆转，用EGFR和 ERK磷酸化变化无法解释这一现象。细胞周期结果显示，吉 非替尼序贯多西他赛使GZ/M期细胞显著减少，而G,/G，期细胞显著增多，细胞周期阻 断在G,/G, ,即进人生长增殖期(S , Gz/M期)的细胞数量明显减 少，减弱了多西他赛的细胞毒作用，所以当吉非替尼序贯多西他赛或者与多西他赛同 时作用时，二者无增效作用，这一结果可以用细胞周期变化来解释，与既往的报道一致7Av 多西他赛与吉非替尼不同时序应用对A549和PC一细胞AKT及其磷酸化均无明显影响，说 明E G-FR受体细胞内信号蛋自AKT及其磷酸化不是化疗联合EGFR-TKIs对NSCLC细胞生长影响 的细胞学机制。 本研究的初步结果显示，多西他赛与吉非替尼同时应用只对EGFR突变型的PC -9细胞具 增效作用，但多西他赛序贯吉非替尼的增效作用与EGFR突变状况无关。值得注意的是，本 研究仅观察了一种EGFR突变型细胞，有待在不同EGFR突变型NSCLC细胞加以证实，EGFR突变 是否可以作为化疗联合EGFR-TKI的优势受益人群，尚需前瞻性的多中心随机对照试验加以 证实。) 【参考文献】 （1）Vmi Schaeyhroeck S, Karaiskou MA, Kelly OM，et al. L;pider-mal growth factor receptor activity determines response of colorec-tal cancer cells to gefitinih alone and in combination with chemo-thernpyJ.Clin Cancer Hes, 2005，11(20);7480一7489. （2）Giaccone G, llerhst HS, Manegnld C，et al. Gefitinih in comhi-nation with gemcitahine and cisplatin in advanced non-small-celllung cancer; a phase trial-1NfACf 1J.J Clin Oncol,2004，22(5):777一784. （3）llerhst HS, Giaccone G, Schiller J11，et al. Gefitinih in comhi- nation with paclitaxel and carhoplatin in advanced non-small-celllung cancer; a phase trial-1NfACf 2J.J Clin Oncol, 2004，22(5):785一794. （4）llerhst HS, 1rager 0，llermmm H, et al. fH1BUfL;:a phase 111trial of erloti